HPLC-熒光檢測法測定人血大黃酸的藥代動力學和相對生物利用度

李　偉（岳陽市二人民醫院藥劑科　岳陽　414000）

HPLC-熒光檢測法測定人血大黃酸的藥代動力學和相對生物利用度

李偉（岳陽市二人民醫院藥劑科岳陽414000）

目的：建立健康志愿者血漿中大黃酸的HPLC-熒光檢測法，并研究大黃酸的藥代動力學和人體相對生物利用度。方法：血漿樣品用鹽酸沉淀后離心，乙酸乙酯萃取上清液，以水（含1%醋酸）-甲醇-乙腈（60∶15∶25，v/v）為流動相，在Kromasil C18柱（250mm× 4.6mm，5μm）上分離，流速1.0mL·min-1。20名健康志愿者以隨機雙交叉實驗方法，單劑量口服大黃酸膠囊受試制劑和參比制劑100mg，進行藥代動力學分析和生物等效性判定。結果：大黃酸在0.05～5.0μg·mL-1的范圍內線性關系良好，回歸方程為A=2.991c+ 0.0011，r=0.9999。定量下限為0.05μg·mL-1。單劑量口服受試制劑和參比制劑的Tmax分別為（4.03±0.7）h和（4.07±0.6）h；Cmax分別為（16.2±3.1）μg·mL-1和（15.8±2.9）μg·mL-1；t1/2分別為（5.25±1.15）h和（5.36±1.19）h；MRT0-t分別為（7.21±0.78）h和（7.13±0.81）h；AUC0-t分別為（162.6±36.1）μg·mL-1和（157.8±38.7）μg·mL-1；AUC0-∞分別為（164.9±38.5）μg·mL-1和（159.4±39.2）μg·mL-1。結論：采用梯形法計算AUC0-t，單劑量口服大黃酸膠囊后，體內相對生物利用度為（105.6±13.1）%。經方差分析和雙單側t檢驗表明在人體內兩種制劑具有生物等效性。

大黃酸膠囊 藥代動力學 生物利用度

大黃酸（Rhein）廣泛分布于蓼科植物大黃、何首烏、虎杖中，是大黃游離蒽醌衍生物，具有廣泛的藥理活性，因其能有效防治II型糖尿病腎病，引起學者廣泛關注［1］。研究發現，大黃酸具有減輕腎小球硬化、腎臟肥大，改善胰島素敏感性、降低血脂水平的作用［2］。基于明顯的藥理作用，大黃酸在人體內的藥代動力學研究具有重要意義。本實驗參考國內外相關研究，對20名志愿者口服大黃酸參比制劑和受試制劑后的藥代動力學進行了研究，評價其生物利用度，為該藥的臨床實驗提供參考。

1儀器與試藥

1.1儀器：日本島津高效液相色譜儀（SPD-M20A檢測器，LC-20AT型泵），CTO-10A柱溫箱，RF-10AXL熒光檢測器（日本島津）；高速離心機、SPD1010離心濃縮裝置（美國Thermo）；80-2離心沉淀器（盛威實驗儀器廠）；mini-Q Gradient AIO超純水器（Millipore公司）；KQ-50B型超聲波清洗器（上海昨非實驗室設備有限公司）。

1.2藥品與試劑：受試制劑：大黃酸膠囊（50mg·粒-1；批號：20120415；南京軍區南京總醫院）；參比試劑：大黃酸片劑（50mg·粒-1；批號：20111109；中國藥科大學）；大黃酸標準對照品（中國藥品生物制品檢定所）；1，8二羥基蒽醌（中國藥品生物制品檢定所）；甲醇（色譜純，阿爾法試劑公司）；乙腈（色譜純，Merck公司）；醋酸、鹽酸、乙酸乙酯均為分析純；水為雙蒸水；空白血漿由兗礦集團有限公司總醫院提供。

2溶液的配制

2.1大黃酸對照品溶液：精密稱取大黃酸標準品10.0mg，置100mL容量瓶中，加入甲醇搖勻，配制成100mg·L-1的儲備液，4℃冰箱保存。使用時，用甲醇稀釋至所需濃度。

2.2內標溶液：精密稱取1，8二羥基蒽醌10.0mg，置100mL容量瓶中，用甲醇溶解搖勻，配制成100mg·L-1的儲備液，4℃冰箱保存。儲備液用甲醇稀釋，配制成50.0μg·L-1的內標溶液備用。

3給藥方案與樣品采集

試驗經兗礦集團有限公司總醫院倫理委員會批準，選擇20名健康男性志愿受試者，年齡22～27歲，體重55～75kg，在實驗前于兗礦集團有限公司總醫院接受全面體檢，體檢合格后簽署知情同意書并納入實驗。

20名受試者隨機分為兩組，每組10人，采用雙周期隨機交叉試驗設計。試驗前禁食10h，早晨空腹口服大黃酸膠囊或大黃酸片劑 100mg，溫開水送服，于服藥前（0h）和服藥后0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，8.0，12.0，24.0h由肘靜脈抽血5mL，離心分取血漿，-20℃冰箱保存。

4色譜條件

色譜柱：Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：水（含1%醋酸）-甲醇-乙腈（60∶15∶25）；流速：1.0mL·min-1；激發波長：440nm；發射波長：520nm；柱溫：35℃；進樣量：15μL。

5血漿樣品處理

取血漿樣品0.5mL，加入內標1，8二羥基蒽醌（50mg·L-1）50μL渦旋混勻，加入30μL鹽酸（2mol·L-1），渦旋5min，加入1mL乙酸乙酯萃取，渦旋10min，離心10min（8000r·min-1），取乙酸乙酯相N2流吹干后，加入50μL甲醇溶解，進樣15μL。

6專屬性

采用內標法進行測定，大黃酸與血漿中雜質完全分離，內源性物質基本不干擾測定，本實驗條件下測得的色譜圖見圖1。大黃酸的保留時間8.62min，內標在11.78min，兩者完全分離，峰形良好，空白血漿中雜質峰不干擾測定，本方法專屬性較高。

7標準曲線與線性范圍

精密吸取空白血漿0.5mL，加入對照品儲備液，渦旋振蕩5min，用空白血漿稀釋成含大黃酸0.05，0.10，0.20，0.50，1.0，2.0，5.0μg·mL-1的血漿樣品，按照“5”中血漿樣品處理操作并測定，記錄色譜圖，以大黃酸峰面積（A）與血藥濃度（C）進行線性回歸。得線性回歸方程：A=2.991c+0.0011 r=0.9999

大黃酸在0.05～5.0μg·mL-1的范圍內線性關系良好。定量下限為0.05μg·mL-1。

8準確度與精密度

去空白血漿0.5mL，按照“7”的方法配制10.0，100.0，500.0μg·L-1的質量控制樣品，每一濃度進行5樣本分析，同一天內測定5次，連續測定3d，記錄大黃酸峰面積，按回歸方程計算濃度，求得準確度與日內、日間精密度，結果見表1。

表1方法的準確度與精密度（n=5）

9方法的提取回收率

配制濃度為10.0，100.0，500.0μg·L-1的對照品血漿，按“7”項操作，測定峰面積A1；另外配制10.0，100.0，500.0μg·L-1的對照品溶液，進樣測定峰面積A2。每一濃度進行5樣本分析，以A1與A2之比計算提取回收率。內標物1，8二羥基蒽醌（1000.0μg· L-1）提取回收率實驗方法相同（表2）。

表2提取回收率（n=5）

10方法穩定性

用空白血漿配制10.0，100.0，500.0μg·mL-1的對照品血漿，分別置于室溫放置12h、-20℃冷凍-解循環2次、-20℃冰箱保存20d，藥物穩定性良好（表3）。

表3樣品穩定性考察（n=3）

11 口服大黃酸藥-時曲線

兩組受試者服用受試制劑100mg后平均血藥濃度/時間曲線（圖2）。

12藥代動力學參數

20名男性健康志愿者單劑量交叉口服大黃酸膠囊受試制劑和參比制劑。經DAS（Drug And Statistics，version 2.0）程序處理，采用非房室模型計算藥代動力學參數，結果見表4。

13單劑量口服大黃酸膠囊的相對生物利用度

兩組受試者交叉服用兩種制劑的平均生物利用度為（105.6±13.1）%，方差分析結果表明受試制劑和參比制劑的Cmax和AUC0-24之間沒有顯著差異（P＞0.05），90%置信區間受試試劑在參比試劑99.6%～112.4%之間，證明兩種制劑具有生物等效性。

14討論

14.1 20名健康志愿者服用大黃酸膠囊100mg后，根據平均血藥濃度曲線，藥代動力學參數與文獻報道基本一致［3］。由實驗結果可知，大黃酸膠囊口服給藥3～4h達到最大血藥濃度。方差分析顯示，大黃酸參比制劑和受試制劑Cmax、AUC0-t值和AUC0-∞值存在明顯個體差異，臨床用藥時需考慮個體化用藥。實驗過程，無不良反應發生。

14.2專屬性實驗發現，大黃酸在光照、酸、堿、熱條件下相對穩定。對大黃酸膠囊的色譜峰進行PDA檢測，主峰純度較好，未發現雜質峰。

14.3生物樣品中大黃酸的檢測常用HPLC-UV法、放射性標記法、HPLC-MS法和固相萃取法等，HPLC-UV法檢測過程易被血漿樣品雜質干擾，靈敏度不高，誤差較大；放射性標記法需要價格昂貴的特殊設備，對儀器要求高，難以推廣；大黃酸臨床樣品濃度高，質譜檢測殘留較大，HPLC-MS法難以定量測定人體內的大黃酸；固相萃取法成本高，操作煩瑣，不利于進行大批量新藥研究。本文建立了對人血漿（0.5mL）中大黃酸濃度的HPLCFLD方法，該方法靈敏度高，雜質干擾少。大黃酸對治療糖尿病和腎病具有一定效果，該檢測方法符合生物樣品檢測要求，為大黃酸的臨床研究提供了穩定可靠且操作方便的檢測手段。

［1］張錦雯，王廣基，孫建國，等.HPLC-熒光檢測法測定大鼠血漿中大黃酸的濃度及其藥代動力學［J］.中國天然藥物，2005，3（4）：238.

［2］劉志紅，鄭敬民，吳義超，等.糖尿病腎病小鼠腎臟基因表達譜及大黃酸對其影響［J］.腎臟病與透析腎移植雜志，2002，11：201.

［3］萬萍，孫建國，郝剛，等.大黃酸的HPLC-熒光檢測及其在人體藥代動力學中的應用［J］.中國藥科大學學報，2013，44（1）：73.

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1672-8351（2016）08-0007-03