CRISPR/Cas9技術的應用性研究

舒磊磊，甲芝蓮，吳勇滸，索　倫，賈麗玲*

(1.上海交通大學生命科學技術學院，上海 200240；2.上海交通大學系統生物醫學研究院，上海 200240；3.上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院，上海 200011)

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CRISPR/Cas9技術的應用性研究

舒磊磊1，甲芝蓮2，吳勇滸2，索倫3*，賈麗玲2*

(1.上海交通大學生命科學技術學院，上海 200240；2.上海交通大學系統生物醫學研究院，上海 200240；3.上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院，上海 200011)

摘要：旨在探索CRISPR/Cas9技術的新應用，本研究通過在小鼠遺傳操作(Genetic manipulation)中使用該技術，創建了一種在活體組織內研究基因功能的方法。通過胚胎電轉、免疫組化和PCR分析等手段，結果發現，針對DCX基因進行編輯，再現了DCX下調導致神經元遷移障礙的表型，說明該技術能夠用于小鼠遺傳操作中下調基因表達；其次，該技術還成功應用于Pcdhα基因簇的編輯并研究了基因簇恒定區的功能；最后，通過基因型鑒定發現，胚胎電轉中使用CRISPR/Cas9會導致目的基因的敲除、反轉和重復事件的發生。綜上所述，在小鼠胚胎電轉中使用CRISPR/Cas9技術，能夠成功編輯目的基因，從而實現活體組織內研究基因的在體功能。

關鍵詞：CRISPR/Cas9；遺傳操作；基因敲除；基因反轉；基因重復

CRISPR/Cas9是一種RNA指導的DNA內切酶，依靠RNA-DNA的互補識別并切割特異基因序列從而達到精確的基因組編輯和基因修飾的目的。該技術自面世以來已經改變了生物領域的科研面貌，并迅速發展為實驗室的一種常規試驗手段。其已成功應用于細菌、人類細胞、斑馬魚、小鼠、豬、食蟹猴以及多種植物的基因組精確修飾，是最具有臨床與應用前景的基因治療技術之一[1]。該技術之所以被評為具有革命性的原因，在于其僅僅依靠一種蛋白(Cas9)，通過一段特殊設計的與目的基因互補的寡聚核苷酸和一段常見的RNA組合，就能實現對目的基因組的精準定位和精確修飾。在哺乳動物中，以豬為例，約有3萬個基因。然而，有些基因的功能卻只有在其發育到特定時期在特定的組織中才會發揮其相應的功能。因此，倘若能夠創建一種針對動物特定組織的、快速而有效的基因編輯技術，那么將對研究基因在特定組織中的功能提供非常有效的平臺。為此，本研究選擇小鼠為模型，以兩種腦組織中高度表達且功能明確的基因DCX(Doublecortin)和Pcdhα為例，對CRISPR/Cas9遺傳操作技術在小鼠腦組織中基因編輯的有效性進行研究。

DCX是高度表達于哺乳動物大腦皮質并在腦發育過程中起很重要作用的蛋白分子[2-4],對神經元的發育具有重要作用。而Pcdhα基因簇屬于原鈣粘蛋白(Protocadherin，Pcdh)家族，是鈣粘蛋白(Cadherin)超家族里最大的亞家族，它們在神經元發生以及神經發育的過程中具有非常重要的作用，比如神經元生存[5-7]、樹突發育[8-9]、突觸形成[10-12]、自我回避[13]和軸突投射[14-15]等。

J.Li等發現，使用CRISPR和一對sgRNA轉染體外培養的HEK293T細胞，非同源末端修復的結果主要有3種：敲除、反轉和重復[16]。為鑒定CRISPR/Cas9在活體組織中是否同樣可以達到基因編輯的目的，本研究首先分別針對DCX和Pcdha基因設計成對的sgRNA，并采用胚胎電轉技術將其與Cas9表達質粒一同共轉于小鼠大腦中。研究CRISPR/Cas9遺傳操作技術對DCX和Pcdha基因編輯后對基因表達及神經元遷移的影響。并與PcdhaRNAi后的研究結果進行對比。進一步對目的基因PCR后測序，分析該技術是否能對小鼠活體組織中目的基因進行精確修飾，并產生精確的敲除、反轉和重復事件。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗材料、感受態細胞和表達載體試驗中所用小鼠均為C57BL/6品系，飼養于SPF級別動物房中，動物房恒溫恒濕，晝夜節律12 h/12 h；感受態細胞為DH5α菌株，為本實驗室制備；sgRNA質粒載體為pGL3，由南京大學模式動物研究所贈送，pGEM-T Easy載體購自Promega公司。

1.1.2試劑與試劑盒PCR所用2× PCR mix購于Biotake公司，高保真酶KOD-plus購于Toyobo公司，T4 DNA連接酶、Bsa1內切酶購于NEB公司，染色劑fast green和DAPI(4′,6-二脒基-2-苯基吲哚)購于Sigma公司，封片劑購于DAKO公司，酵母提取物和胰蛋白胨購于OXOID公司，DNA Marker購于Invitrogen公司，多聚甲醛(PFA)購于Thermo公司，NaOH、EDTA、Tris-HCl、Na2HPO4、KH2PO4和Agar購于Sigma公司，NaCl、KCl、氨芐、IPTG、 X-Gel和戊巴比妥鈉購于國藥集團；質粒小量提取試劑盒、PCR 純化試劑盒和DNA 膠回收試劑盒購于Axygen公司，質粒中量提取試劑盒和質粒大量提取試劑盒均購于Qiagen公司。

1.1.3儀器Nanodrop2000分光光度計購于Thermo公司，電轉儀購于Bio-Rad公司，PCR儀購于Bio-Rad和Applied Biosystems公司，低溫離心機購于Eppendorf公司，振動切片機購于Leica公司，熒光顯微鏡和體視顯微鏡購于Zeiss公司，激光掃描共聚焦顯微鏡購于Nikon公司。

1.1.4產品及服務試驗中使用的各種引物(包括基因型鑒定引物、構建sgRNA質粒寡核苷酸等)均由上海生工生物工程股份有限公司合成；試驗中所有需測序樣本均送至上海桑尼生物科技有限公司或者上海生工生物工程股份有限公司測序。

1.2方法

1.2.1表型觀察試驗小鼠胚胎電轉時間為胚胎期14.5 d，取腦時間為胚胎期19.5 d(E14.5～E19.5)，在體視顯微鏡下觀察取腦，使用熒光顯微鏡觀察小鼠腦部熒光，使用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察腦片并拍照。

1.2.2遺傳操作本研究以胚胎電轉探索神經發育相關基因的功能為手段，故胚胎電轉的部位位于小鼠腦部。質粒注射部位位于小鼠大腦腦室，電轉使用38 V電壓，電擊5次，每次5 ms，兩次電擊間隔50 ms；每次注射的質粒大約為1 μL，各成分濃度：sgRNA 0.8 μg·μL-1，Cas9 1 μg·μL-1，fastgreen 0.000 3%。因為質粒帶有負電荷，因此在外加電場的作用下會向正極移動，當把正極電儀放在小鼠大腦皮層外側，負極電儀放在對側，電轉時質粒會向正極電儀所在的大腦皮層移動。

1.2.3腦片獲取小鼠大腦固定時間大約為12 h，之后使用1× PBS浸泡清洗約12 h。清洗完后用震蕩切片機切片，每片厚度50 μm，將需要觀察的切片收集于24孔板中，孔中有預先放好的1×PBS，將要觀察的腦片進行DAPI核染色，并置于水平脫色搖床常溫孵育30 min，孵育過程避光。孵育完后，使用1×PBS清洗3次，每次5 min，清洗完將腦片轉移到載玻片上并封片。此腦片即可使用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1.2.4PCR分析對于需要進行基因型鑒定的小鼠大腦，需在熒光顯微鏡下觀察熒光，并用手術刀取出熒光部分，放入PCR管中裂解。裂解時使用裂解液，其成分：NaOH 25 mmol·L-1，EDTA 0.2 mmol·L-1，體積為50 μL，裂解時以92 ℃裂解20 min，之后加入50 μL中和液中和并混勻，中和液成分：Tris-HCl 40 mmol·L-1，裂解液和中和液的溶劑均為去離子水。裂解之后進行PCR，PCR反應的組分和用量：5 μL 2 × PCR mix，0.5 μL Primer1(5 mmol·L-1)，0.5 μL Primer2(5 mmol·L-1)，0.5～1 μL模板，并用去離子補至10 μL。PCR反應條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s/500 bp，72 ℃ 1 min， 36個循環。

將符合預期的PCR產物條帶進行膠回收，膠回收產物經過T-A克隆插入pGEM-T Easy載體，之后轉化感受態細胞，涂板于藍白斑篩選平板。最后挑出白色菌落進行質粒小量提取，送公司測序。

1.2.5基因敲除表達質粒的構建胚胎電轉中所用的sgRNA基因敲除質粒均為獨立構建。試驗所用質粒載體為pGL3，自帶U6啟動子，使用Bsa1酶切，該酶在U6啟動子后面具有2個酶切位點且形成不同粘性末端。購買的用于構建sgRNA質粒的上游(F)和下游(R)引物序列首先均配成20 mmol·L-1的工作液，之后配置退火溶液，溶液各成分體積：F：5 μL，R：5 μL，NEBuffer 5 μL，并用去離子水補至50 μL。將上述溶液置于沸水中自然冷卻至室溫進行退火，退火后形成雙鏈核苷酸兩端有黏性末端序列，用T4連接酶與已酶切的pGL3載體相連接，測序，確認序列正確性。

1.2.6統計和分析試驗中用ImageJ對小鼠腦片中熒光細胞進行計數，數據來自至少3組獨立重復試驗，然后取其平均數。計數采用雙盲法，被計數的腦片也隱去其名稱等相關信息。計數之后用t檢驗對兩組不同數據進行比較，并以95%為置信區間。對于被計數的腦片中的細胞，我們采用梯形分割分區計數的方法，將小鼠大腦皮層從內到外分為10層，依次標記為10、9、8、7、6、5、4、3、2、1。最外層(第1層)區間置于大腦皮層的最外層，最內層(第10層)與切片內圈切線重合，然后記出每個區間的熒光細胞數量。

1.2.7構建sgRNA質粒的寡聚核苷酸序列和PCR分析的引物序列 試驗中所用與目的基因互補的sgRNA的核苷酸序列見表1。基因型鑒定引物序列如表2所示。

表1　構建sgRNA的核苷酸序列

表2　PCR分析的引物序列

預期目的片段長度：敲除:F1+R1,280 bp；反轉(上)：F1+F2,365 bp；反轉(下)：R1+R2，415 bp；重復：F2+R2,506 bp

The predicted fragment sizes：deletion:F1+R1,280 bp；inversion(sense)：F1+F2,365 bp；inversion(antisense)：R1+R2，415 bp；duplication：F2+R2,506 bp

2結果

2.1CRISPR/Cas9轉染后可重現目的基因RNAi的表型

本研究選取了功能明確的DCX基因來驗證CRISPR/Cas9用于遺傳操作的可行性。首先，試驗組共轉融合了eGFP蛋白的Cas9質粒以及作用于DCX編碼區的兩對sgRNA：DCX1和DCX2，對照組則轉染了該Cas9基因以及sgRNA空載體，試驗結果如圖1a所示，對照組中被GFP標記的神經元大多數都遷移至外層，而試驗組的神經元只有部分遷移到應到的位置。為了更加精確地了解神經元遷移狀況，我們把腦片分成10層并進行統計。從統計結果(圖1b)發現，轉染DCX1 sgRNA的腦片在第2、4、7、9層與對照組相比有顯著差異，轉染了DCX2 sgRNA的腦片在第2、3、7、8層與對照組相比有顯著差異。此結果與shRNA下調DCX基因表達后的結果一致。因此，推測在胚胎電轉中使用CRISPR/Cas9能夠使目的基因的表達量下降。

其次，使用該方法研究了Pcdhα基因簇恒定區的功能。在試驗中使用胚胎電轉的技術，針對Pcdhα基因簇的恒定區設計3個sgRNA：αcon1、αcon2和αcon3，用CRISPR/Cas9的手段，分別轉染2個或3個sgRNA，使之能高效并特異地敲除Pcdhα基因簇恒定區，對照組則轉染了該Cas9基因以及sgRNA空載體。試驗結果如圖2a所示，在敲除Pcdhα基因簇的恒定區之后，神經元的遷移會發生明顯障礙，大部分神經元不能遷移至正常區域。統計結果(圖2b)表明，與對照組相比，轉染了特異性識別Pcdhα基因簇恒定區sgRNA的腦片神經元遷移明顯滯后。這說明Pcdhα基因簇恒定區對神經元的正常遷移至關重要。

a.圖中綠色是被GFP標記的神經元細胞；標尺：100 μm；b.橫坐標：縱切大腦皮層由外到內分成10層，每個數字表示不同的層數；縱坐標：該層GFP陽性細胞占總GFP陽性細胞的比例；*.P<0.05,**.P<0.01。圖2同a.The green in the figure are neuron cells labeled by GFP；Bar：100 μm；b.Abscissa：Longitudinal cerebral cortex is divided into 10 layers from outside to inside，each number means one different layer；Ordinate：The layer of GFP positive cells accounted for the proportion of total GFP positive cells；*.P<0.05,**.P<0.01.The same as Figure 2圖1　下調DCX導致神經元遷移障礙Fig.1　Down-regulated DCX lead to neuron migration defects

圖2　破壞Pcdhα基因簇恒定區導致神經元遷移障礙Fig.2　Deleting Pcdhα cluster constant exons lead to neuron migration defects

2.2CRISPR/Cas9可導致目的基因片段的敲除、反轉和重復為了探索CRISPR/Cas9在局部組織遺傳操作中的有效性，本研究在胚胎電轉中共轉一對sgRNA并分別位于Pcdhα基因簇的兩端，然后獲取有熒光細胞的部分腦部組織裂解之后進行PCR鑒定。鑒定結果表明，胚胎電轉中應用CRISPR/Cas9可實現對目的基因的精確編輯并導致目的基因發生精確的敲除、反轉和重復。發生敲除、反轉和重復的示意圖如圖3所示。

圖3　發生敲除、反轉和重復的示意圖Fig.3　Schematic diagram of deletion，inversion and duplication

PCR電泳結果顯示(圖4a,c,e左)條帶大小與預期相符，將DNA進行回收，之后經過T-A克隆，連到pGEM-T Easy載體中進行測序。測序結果的接頭處如圖所示(圖4a,c,e右)，測序峰圖(圖4b,d,f))顯示的是獲得不同結果的接頭處序列。

由圖4可見，在遺傳操作中使用CRISPR/Cas9會導致目的基因的敲除、反轉和重復，之后我們對基因敲除之后的修復結果進行統計，發現其精確修復的比例高達70.8%(表3)。

表3　Pcdhα基因簇敲除、反轉和重復3種事件精確修復的比例

3討論

a,c,e左圖表示基因型鑒定的電泳圖；a,c,e右圖表示測序結果的接頭處序列；b,d,f.測序結果中存在的所有不同的情況的測序峰圖；expected表示接頭處預期精確修復的序列，precise表示接頭處修復精確的條帶a,c,e left.Electrophoresis identification of genotype；a,c,e right.Joint sequence of sequencing results；b,d,f.All different conditions in the sequencing results；expected.Precisely repaired of the joint；precise.DNA that is precisely repaired圖4　胚胎電轉中共轉1對sgRNA敲除Pcdhα基因簇導致敲除、反轉和重復事件及其基因型鑒定Fig.4　Contransfection of a pair of sgRNAs to delete Pcdhα cluster lead to deletion，inversion and duplication and the genotyping

CRISPR/Cas9是非常可靠而且簡便的研究基因功能的工具，自其研發以來已經迅速成為一種強大且實用的方法。本研究中，在小鼠胚胎電轉時使用CRISPR/Cas9研究在體基因的功能，并且得到了較好的結果。我們首先通過已知功能的基因DCX驗證了該方法的可行性。研究表明，DCX在大腦皮質的發育中起很重要的作用[2，3，17]，其缺陷會抑制大腦皮質中神經元遷移，也會抑制神經元從多極神經元向雙極神經元的轉變[4，18]。我們推測認為，胚胎電轉時應用CRISPR/Cas9可以將DCX破壞，并產生相應表型。于是我們設計試驗轉染不同的sgRNA來破壞目的基因。結果表明，DCX被破壞之后的試驗組神經元遷移明顯障礙，證明了我們猜想的正確性。之后我們使用該方法研究Pcdhα基因恒定區的功能。Pcdhα基因簇對神經發育具有重要作用，在培養的海馬神經元中的試驗表明，敲除其Pcdhα基因簇或者過表達Pcdhα胞內段從而進行顯性抑制均導致樹突簡化，且樹突棘的寬度和長度降低，并且敲除Pcdhα基因簇會導致樹突分枝和樹突棘減少[8，19]等。以往在研究Pcdhα基因簇時，研究人員會將其全部敲除，從而使該基因完全不表達[8，19]。我們在試驗中僅僅敲除了Pcdhα基因簇的恒定區，而Pcdhα基因簇的恒定區編碼蛋白質的胞內段。試驗結果表明，在敲除Pcdhα基因簇的恒定區之后，神經元的遷移會發生明顯障礙，這說明Pcdhα基因簇的恒定區，即編碼蛋白質的胞內段對神經元的正常遷移至關重要。J.Li等[16]提出，在體外培養的HEK293T細胞中使用CRISPR/Cas9敲除目的基因，非同源末端修復的結果有3種：敲除、反轉和重復。與細胞系不同，神經元細胞不再分裂增殖，這樣存在兩種可能：一是可能因質粒在細胞中的維持時間更長而導致Cas9更徹底地切割，二是由于染色體構象與細胞系不同而導致Cas9工作效率的不同。我們想進一步探索在體外培養的細胞中發生的敲除、反轉和重復事件在活體組織中會不會同樣發生，于是設計試驗在胚胎電轉中使用CRISPR/Cas9共轉一對sgRNA將小鼠整個Pcdhα基因簇敲除，并進行基因型鑒定，發現該技術可導致目的基因的敲除、反轉和重復事件的發生，并且統計結果表明，精確修復的比例超過70%。然而，該手段與使用shRNA造成的基因表達下調的表型相比仍然具有一定的差距，因此如何提高該手段的效率仍然需要進一步的研究。同時，因為修復結果中存在目的基因的敲除、反轉和重復等3種事件，因而無法確定某種事件在所有事件中發生的比例，也即不能確定出現的表型中哪種事件占據主導地位。

4結論

本研究證明了在遺傳操作中使用CRISPR/Cas9能夠產生目的基因的敲除、反轉和重復事件，從而可以在活體組織內研究在體基因的功能。

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(編輯郭云雁)

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.07.003

收稿日期：2016-01-21

基金項目：國家自然科學基金(31200825)

作者簡介：舒磊磊(1990-)，男，安徽六安人，碩士生，主要從事分子和遺傳生物學方面的研究，E-mail：leilshu@163.com *通信作者：索倫，副研究員，碩士生導師，主要從事基因在體功能研究，E-mail：suoyunfei@126.com；賈麗玲，實驗師，E-mail：jllmao@126.com

中圖分類號：S813.3

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)07-1316-08

The Application Research of CRISPR/Cas9

SHU Lei-lei1，JIA Zhi-lian2，WU Yong-hu2，SUO Lun3*，JIA Li-ling2*

(1.SchoolofLifeSciencesandBiotechnology，ShanghaiJiaoTongUniversity，Shanghai200240，China；2.InstituteofSystemsBiomedicine，ShanghaiJiaoTongUniversity，Shanghai200240，China；3.ShanghaiNinthPeople’sHospital，ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine，Shanghai200011，China)

Abstract:To investigate new application of CRISPR/Cas9 technology，we established a method to study genes function in living organism by the application of CRISPR/Cas9 in genetic manipulation.By using in vivo electroporation，immunohistochemistry and PCR analyzing，we first validated the function of DCX and the results indicated that CRISPR/Cas9 could be used in down-regulated gene expression in mouse genetic manipulation.Then this method was also used to study the function of constant exons of Pcdhα cluster.To further clarify the mechanism that led to the phenotype of neuron migration defects by DCX，we designed experiments to identify the genotype of target genes.The results indicated that CRISPR/Cas9 could lead to deletion，inversion and duplication of target genes.In conclusion，CRISPR/Cas9 technology could be used in mouse genetic manipulation and edit the target genes efficiently，which might be an ideal method to research gene function in living organism.

Key words:CRISPR/Cas9；genetic manipulation；deletion；inversion；duplication