綿羊季節性繁殖相關基因TSHR外顯子多態性研究

軒俊麗，馬曉萌，王慧華，3，曹家雪，魏彩虹，趙福平，馬友記，張　莉*，杜立新*

(1.甘肅農業大學動物科學技術學院，蘭州 730070； 2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193)

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綿羊季節性繁殖相關基因TSHR外顯子多態性研究

軒俊麗1，2，馬曉萌2，王慧華2，3，曹家雪2，魏彩虹2，趙福平2，馬友記1*，張莉2*，杜立新1，2*

(1.甘肅農業大學動物科學技術學院，蘭州 730070； 2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193)

摘要：旨在研究烏珠穆沁羊與湖羊這兩種具有不同繁殖性能和發情周期綿羊的促甲狀腺激素受體(Thyroid stimulating hormone receptor，TSHR)基因外顯子區遺傳變異特性及其構建的單倍型在品種間的分布和對mRNA和蛋白質二級結構的影響，為進一步揭示其對TSHR表達調控的影響及表型效應奠定基礎。本研究采用直接測序的方法對中國蒙古系2個綿羊品種共172個個體TSHR基因的遺傳變異情況進行分析。共發現了6個突變位點，獨立性卡方檢驗發現SNP1、SNP3、SNP4和SNP5 4個多態位點的基因型在兩個綿羊群體間的分布存在極顯著差異(P<0.01)，其中SNP5為錯義突變，其余為同義突變；對這4個位點進行連鎖不平衡分析發現，SNP3和SNP4兩個位點完全連鎖，其余位點兩兩之間存在不同程度連鎖關系；生物信息學分析發現不同的單倍型使TSHR基因的mRNA二級結構發生改變，SNP5使受體蛋白的二級結構發生改變。結果提示：(1)TSHR基因外顯子區存在4個在兩個綿羊品種中具有潛在生物學功能和表型效應的突變位點，可組成H1～H6共6種單倍型，其中H1(CGCC)和H4(TTTG)分別在烏珠穆沁羊和湖羊群體中為優勢單倍型，這可能與這兩種綿羊不同的發情周期有關。(2)外顯子區SNP5位點突變影響mRNA和蛋白質二級結構的穩定性，可能是具有潛在表型效應的重要功能位點。

關鍵詞：綿羊；季節性繁殖；TSHR基因；多態性

季節性繁殖活動是哺乳動物對各種環境因素變化的一種適應性保護行為，其中，光周期變化是影響這一活動的主要環境因素。其機理：褪黑激素(Melatonin，MEL)通過下丘腦—垂體—性腺軸(Hypothalamic-pituitary-gonadal axis，HPGA)系統來調節促性腺激素釋放激素(Gonadotropin releasing hormone，GnRH)、促性腺激素、黃體生成素以及孕激素等的合成與釋放，進而影響哺乳動物的季節性繁殖活動[1-2]。近些年的研究表明，TSHR基因也能影響動物的季節性繁殖活動。

TSHR屬于G蛋白偶聯受體家族，主要分布于甲狀腺，能夠通過特異性結合甲狀腺激素來提高甲狀腺攝入碘的能力，促進甲狀腺的生長發育及甲狀腺激素的合成分泌。TSHR不僅僅在甲狀腺中表達，它也可表達于綿羊的腦部(如下丘腦、松果體和垂體等)、卵巢和血液中[3]。趙賡等[4]研究發現，綿羊卵巢和下丘腦中的TSHR基因序列具有很高的相似性，并推測TSHR可以通過調節神經內分泌過程來影響綿羊的季節性繁殖活動。E.A.Hanon等[5]在Soay綿羊中研究發現光照長短能夠影響TSH及其受體TSHR的表達，TSHR能夠受到光周期的影響調節綿羊的季節性繁殖活動。進一步研究表明，TSHR在動物腦部中的表達主要集中在第三腦室內皮細胞(Endothelial cell，EC)和垂體結節部[6]。EC細胞能夠連通垂體門脈系統和第三腦室的腦脊液(Cerebrospinal fluid，CSF)，且能與下丘腦中的GnRH神經元形成突觸連接，而CSF中存在大量MEL，其濃度隨光周期變化而變化[7]。由此可見，TSHR可能會受光周期的作用，影響GnRH和MEL的分泌，進而影響動物的季節性繁殖活動。C.Viguie等[8]通過試驗對其進行了驗證，結果發現綿羊的甲狀腺被切除后會一直處于季節性繁殖狀態，直到在其腦室注射T4后，才對光周期信號重新產生反應，進入休情期。

綜上所述，TSHR對綿羊的季節性繁殖活動具有重要作用，它可能通過PT(垂體)-TSH-TSHR-DIO2/DIO3(下丘腦)-TH-GnRH通路，使綿羊感知光照的季節性差異，從而影響松果體分泌MEL，進而影響通路下游GnRH的分泌，并最終影響綿羊季節性的發情行為和繁殖活動[9]。

綿羊是季節性多次發情的動物。中國寒冷地區的綿羊品種，如烏珠穆沁羊及呼倫貝爾羊等綿羊的發情周期處于6月下旬到12月末或來年1月初，主要集中于9～11月份。而湖羊和小尾寒羊等溫暖地區的綿羊品種，發情不存在明顯的季節性，但也具有秋季較為旺盛的規律。因此，本試驗以烏珠穆沁羊和湖羊為研究對象，全面了解TSHR基因SNP多態性、單倍型組成及其在不同群體中的分布，明確各單倍型對mRNA二級結構及其蛋白質二級結構的影響，將有助于篩選出具有潛在生物學功能的單倍型組合，為下一步篩選合適的相關表型進行全基因組關聯分析奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

以兩個綿羊品種共172只個體為研究對象，其中烏珠穆沁綿羊(Ujumqin sheep)96只，湖羊(Hu sheep)76只，分別來自內蒙古東烏珠穆沁旗的烏珠穆沁羊原種場和蘇州市湖羊種羊場。綿羊頸靜脈采血5 mL，肝素抗凝，-20 ℃保存。

1.2基因組DNA提取、檢測及DNA池構建

利用動物血液基因組DNA提取試劑盒(天根，北京)提取血樣基因組DNA，并用含核酸染料的1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測其完整性、含量及純度。從兩個品種中各隨機抽取DNA樣20份，每個樣品各取1 μL，分別構建兩個品種基因組DNA池。

1.3SNP檢測

1.3.1引物設計與合成通過NCBI網站的GenBank數據庫，獲得綿羊TSHR基因(NM_001009410.1)外顯子序列，利用Primer 3.0在線軟件設計12對覆蓋TSHR基因外顯子的PCR擴增引物(表1)，交由天一輝遠生物科技有限公司(北京)合成。

表1　引物序列和擴增產物

1.3.2PCR擴增與測序PCR擴增反應體系(25 μL)包括約20 ng·μL-1的基因組DNA 2 μL，10 pmol的上下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix(內含TaqDNA聚合酶、Mg2+dNTPs等)(北京 天根)12.5 μL，滅菌雙蒸水8.5 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，退火溫度退火30 s(退火溫度見表1)，72 ℃延伸70 s，32個循環；72延伸10 min；4 ℃保存。

PCR擴增產物經1%瓊脂糖電泳檢測后送北京天一輝遠生物科技有限公司回收純化后進行混池測序。

1.3.3飛行時間質譜(TOF-MS)分析通過混池測序的方法，尋找峰圖清晰、有明顯雙峰的位點，確定其為SNP位點，并應用TOF-MS方法對SNP位點進行基因型分析。為了驗證分型的準確率，本試驗采用直接測序的方法檢驗了一部分樣品的分型結果。

1.4TSHR基因群體遺傳結構分析

利用PopGene1.32軟件對SNPs位點進行等位基因頻率、基因型頻率、有效等位基因數及多態信息含量(Polymorphism information content，PIC)等群體遺傳特性進行分析[10]；利用χ2適合性檢驗進行符合Hardy-Weinberg平衡的檢驗；并利用獨立性卡方檢驗分析等位基因在綿羊品種中的分布[11]。

1.5連鎖不平衡(LD)和單倍型分析

使用Haploview 4.2軟件對卡方獨立性檢驗中差異顯著的位點進行連鎖不平衡分析及單倍型的構建。

1.6SNP對TSHR基因mRNA及蛋白質二級結構的影響

運用在線軟件RNAfold web server(http：//rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi)進行mRNA二級結構預測。運用在線軟件(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page= npsa sopm.html)進行蛋白質二級結構預測。

2結果

2.1混池測序及SNP鑒定

利用動物血液基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，將所提取的DNA用分光光度計和含核酸染料的1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結果表明DNA質量符合測序標準，可用于下一步試驗。利用所設計的12對引物，以構建的DNA池為模板進行PCR擴增，擴增產物經檢驗后送公司測序，測序結果如圖1所示。

圖1　TSHR基因結構示意圖及6個SNPs基因型測序Fig.1　TSHR gene structure and sequencing results of the 6 SNPs

在TSHR基因外顯子上共發現了6個多態性位點，分別命明為SNP1～SNP6，以TSHR基因外顯子第一位為+1，6個SNPs位點具體信息如表2所示。

表2　TSHR基因SNPs的信息

2.2飛行時間質譜結果

將測序后挑選出的TSHR基因上的6個SNPs位點利用TOF-MS法進行分型，分型結果如圖2所示，除SNP2和SNP6兩個多態位點只有2種基因型以外，其余4個多態位點均存在3種基因型。

2.3群體遺傳學分析

以上6個位點在兩個測試群體的基因型頻率、等位基因頻率、PIC等遺傳參數統計值見表3。由表3可知，SNP1在湖羊群體中只存在兩種基因型，在烏珠穆沁羊中存在3種基因型；SNP2在湖羊群體中只存在兩種基因型，而在烏珠穆沁羊群體中不存在多態性；SNP6位點在兩個綿羊群體中均只存在兩種基因型。SNP1、SNP3、SNP4和SNP5位點在兩個綿羊群體中的優勢基因型不同。SNP1位點在烏珠穆沁羊群體中表現為中度多態(0.25

χ2適合性檢驗表明各個位點在兩個群體中均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(P>0.05)。

圖2　飛行時間質譜結果散點圖Fig.2　The result of time of TOF-MS

2.4群體間的遺傳差異分析

2.4.1兩個綿羊品種中6個SNPs位點的基因型分布差異及遺傳分化χ2獨立性檢驗結果見表4。由表4可知，SNP1、SNP3、SNP4和SNP5 4個多態位點各基因型的分布在兩個綿羊品種間存在極顯著差異。在這4個多態位點中單個SNP位點在兩個品種間的Fst值為0.187 4(SNP5)～0.274 8(SNP1)，普遍大于SNP2和SNP6兩個位點，相應的，這4個位點的基因流值也比其余兩個位點小。

2.4.2連鎖不平衡分析將在兩個綿羊品種中分布差異極顯著的4個位點(SNP1、SNP3、SNP4、SNP5)進行連鎖不平衡分析，如圖3和表5所示，TSHR基因上SNP3和SNP4兩個多態位點在兩個綿羊品種中相互之間的連鎖不平衡系數D′和連鎖不平衡相關系數r2均為1，即兩個位點完全連鎖；SNP3與SNP5、SNP4與SNP5之間存在強連鎖不平衡(D′>0.75，r2>0.33)。其他幾個位點兩兩之間存在不同程度的連鎖關系。

表3　TSHR基因SNP位點基因型頻率、等位基因頻率及群體遺傳特性

表4　TSHR基因SNPs位點基因型在兩個品種分布差異的χ2獨立性檢驗及Fst值

**.表示差異極顯著(P<0.01)

**.Means extremely significant difference at 0.01 level

圖3　TSHR基因4個位點連鎖不平衡分析圖Fig.3　Linkage disequilibrium analysis in TSHR gene

表5　TSHR基因多態位點配對連鎖不平衡分析

對角線的上方為D′；對角線的下方為r2

D′ are above the diagonal for SNPs andr2are below the diagonal

2.4.3單倍型分析及其在不同綿羊品種中的分布運用Haploview軟件對TSHR基因上SNP1、SNP3、SNP4和SNP5 4個多態位點進行單倍型構建，在烏珠穆沁羊群體中構建6種單倍型，其中優勢單倍型為H1(CGCC)；而在湖羊群體中構建5種單倍型，優勢單倍型為H4(TTTG)。單倍型H6只存在于烏珠穆沁羊群體中(表6)。

2.5生物信息學分析

2.5.1mRNA 二級結構預測利用在線軟件RNAfold web server預測TSHR基因不同單倍型mRNA二級結構如圖4所示，其最小自由能為-4 155.55 kJ·mol-1～-4 144.25 kJ·mol-1，其中H2的二級結構自由能最大，H4的最小，因此結構穩定性H4最高，H2最低。

2.5.2蛋白質二級結構預測利用SOPM二級結構預測方法對不同基因型的TSHR蛋白質二級結構進行預測，預測結果見圖5。由圖可知，SNP5位點為錯義突變，突變后蛋白質二級結構發生改變，使TSHR基因編碼區第655位密碼子編碼的絲氨酸變為精氨酸，蛋白質二級結構中α螺旋、β折疊、延伸鏈和自由卷曲所占比例均發生變化(表7)。

表6　兩個綿羊品種TSHR基因6個SNPs位點單倍型頻率分析

表7　TSHR基因SNP5位點突變前后蛋白質二級結構預測結果

圖4　TSHR基因不同單倍型的mRNA二級結構Fig.4　mRNA secondary structure of different haplotypes of TSHR gene

A.SNP5位點為C時的蛋白質二級結構；B.SNP5位點為G時的蛋白質二級結構：h、t、c和e分別代表α-螺旋、β-轉角、無規則卷曲和延伸鏈A.Protein secondary structure of C of SNP5；B.Protein secondary structure of G of SNP5；h，t，c and e means alpha helix，beta turn，random coil，extended strand，respectively圖5　TSHR基因SNP5位點突變前后蛋白質二級結構Fig.5　Protein secondary structure of SNP5 of TSHR gene before and after mutation

3討論

3.1烏珠穆沁羊和湖羊的發情特點

根據《中國畜禽遺傳資源志·羊志》[12]中記載，湖羊和烏珠穆沁羊均由蒙古羊進化而來，但在長期的進化過程中，它們的繁殖性能也因分布地區的地理環境和氣候的不同而有所差異。其中，烏珠穆沁羊為季節性發情，多集中在9～11月份發情，發情周期為15～19 d，發情持續時間為24～72 h，年平均產羔率為113%。而湖羊是常年發情，發情時間主要集中在4～6月份和9～11月份，發情周期長達11 d，經產母羊的年平均產羔率高達277.4%，兩年一般能產3胎。本試驗對不同繁殖周期綿羊的TSHR基因多態性進行研究，為調控綿羊的繁殖季節性、縮短綿羊的休情期，延長其發情期，提高季節性發情綿羊的生產性能和繁殖力提供理論依據。

3.2TSHR基因的多態性

TSHR在調控繁殖相關激素合成與分泌的信號通路中，首先結合TSH，然后與Gs蛋白進行偶聯，激活蛋白激酶A和cAMP系統，進而作用于下丘腦，完成相關激素的合成與分泌。因此，此通路中涉及到的任何相關成分的變化都有可能影響動物的季節性繁殖活動。研究表明，TSHR基因某些位點發生突變，可使相應的氨基酸發生改變進而導致cAMP通路的持續激活。例如，人TSHR第77位的天冬酰胺被谷氨酸替代后，TSHR喪失與TSH的結合能力，第113位天冬酰胺被替代后，TSHR親和力下降約10倍[13]。同時，TSHR基因的突變可直接影響甲狀腺功能的改變[14-16]。A.C.Karlsson等[17]研究發現，TSHR基因的突變可能會通過調節甲狀腺激素的血漿水平來影響雞的孵化時間、憂慮行為及攻擊行為等一些重要的性狀，這在家禽的馴養過程中具有重要意義。

單核苷酸多態性(Single nucleotide polymorphisms，SNP)是一種普遍存在于動植物中且密度大、能穩定遺傳的分子標記[18]。為了探究季節性和常年性發情綿羊之間TSHR基因的多態性差異，本試驗將發現的6個多態位點分別命名為SNP1～SNP6，其中SNP2和SNP5屬于錯義突變，其余位點屬于同義突變，且除SNP1位點位于第3外顯子外，其余位點均位于第10外顯子。本試驗在湖羊群體中SNP1位點處未檢測到CC基因型，說明其是烏珠穆沁羊特有的基因型；在烏珠穆沁羊群體中SNP2位點處未檢測到G等位基因，同時湖羊群體中G等位基因的概率也比較低，僅為0.67%，可能是由于樣本量不足或者是該等位基因在兩個品種中均很少存在，這有待擴大樣本進一步驗證；兩個綿羊群體在SNP6位點處均沒有檢測到TT基因型，可能是由于樣本量不足或者存在純合基因型致死現象。Hardy-Weinberg平衡檢測表明，6個多態位點在兩個羊群均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(P>0.05)，表明上述位點通過長期的進化和選擇，在適應性方面可能具有遺傳優勢。

多態信息含量(PIC)可以衡量位點多態性。PIC值與群體內基因的一致性呈反比，而與群體的變異性和選擇潛力呈正比。在本試驗中，測試綿羊群體TSHR基因的PIC值在0～0.491 0，除SNP2和SNP5外，其余位點的PIC值在烏珠穆沁綿羊群體中均高于湖羊群體，其中SNP1、SNP3和SNP4位點在烏珠穆沁羊群體中屬于中度多態，在湖羊群體中屬于低度多態，說明這些位點在兩個綿羊群體中的變異程度存在一定差異，并且在烏珠穆沁羊群體中遺傳變異較大，通過本品種選育有望獲得較大的進展；而兩個綿羊群體中其余位點的PIC值比較接近，說明這些位點在這兩個綿羊群體中的變異程度未存在太大的差異。獨立性χ2檢驗發現，SNP1、SNP3、SNP4和SNP5 4個位點的基因型在烏珠穆沁羊和湖羊間的分布具有極顯著差異(P<0.01)。這4個位點在兩個綿羊品種群體中的分布具有共同點，即優勢等位基因型不同，且純合基因型在兩個綿羊群體中的分布頻率相差較大，例如，SNP4位點在烏珠穆沁綿羊群體中的優勢基因型為CC，其頻率為46.88%，而其在湖羊群體中的頻率僅為2.67%，這一結果與高磊等[19]的研究結果一致，他們發現TSHR基因第10外顯子481 bp處，即本研究中的SNP4位點發生了T-C突變，此突變雖為同義突變，但其等位基因的分布在常年發情和季節性繁殖等具有不同繁殖周期的綿羊群體中具有顯著差異(P<0.01)，等位基因頻率T/C 與繁殖特性密切相關，即該多態位點與季節性繁殖性狀具有較強的相關性。同時，本研究發現與其他多態位點相比，分布差異極顯著的這些位點的Fst值相對較大，說明在這些位點中兩個綿羊群體之間存在一定程度的遺傳分化，因此，這些位點可作為后續研究的重點。

3.3對mRNA和蛋白質二級結構的影響

大多數表型性狀的改變并不是由單個位點突變引起的，而是由多個位點突變形成的單倍型相互作用的結果[20]。本研究對在兩個品種中等位基因分布差異極顯著的4個位點進行單倍型分析，發現它們在烏珠穆沁羊群中共形成6種不同單倍型，主要以H1為主；在湖羊群體中則形成5種單倍型，以H4為主。mRNA二級結構預測顯示，6個單倍型的二級結構和最小自由能均有不同程度的差異，其中H2單倍型的最小自由能最大，H4單倍型的最小自由能最小。因此，H4具有更加穩定的mRNA二級結構。此外，我們還發現SNP3、SNP4和SNP5位點的改變均導致mRNA二級結構發生改變，它們所引起mRNA結構變化有可能影響細胞因子對TSHR基因的加工、轉運等，致其表達和成熟異常，進而與繁殖性狀變異相關。

進一步的蛋白質二級結構預測發現，SNP5位點的錯義突變導致了TSHR蛋白第655位的絲氨酸變成精氨酸，使得其α螺旋、β轉角、延伸鏈和自由卷曲等二級結構的比例均發生改變。TSHR跨膜結構預測顯示此位點位于第6和第7跨膜區之間，即第3胞外環結構上，胞內環含有一個蛋白激酶C的作用位點。L.Alberti等[21]通過對甲狀腺功能正常和高TSH血癥患者進行研究發現，10位患者中有4位存在TSHR基因突變，這些突變導致其受體蛋白的功能發生改變。其中編碼受體蛋白的第655位氨基酸處CA堿基的缺失，使受體蛋白缺少第7跨膜片段及胞內尾端，進而導致受體蛋白功能喪失。因此，本研究中SNP5位點的錯義突變是否使TSHR的功能發生改變，甚至是否是造成季節性和常年性發情綿羊發情差異的原因之一，還有待進一步的研究。

綜上所述，綿羊TSHR基因外顯子SNP1、SNP3、SNP4和SNP5 4個位點的多態性在烏珠穆沁羊和湖羊群體中存在極顯著差異，SNP1、SNP3和SNP4位點雖為同義突變，但其有可能通過影響mRNA二級結構的穩定性或密碼子的偏好性使蛋白質亞基的結構和功能發生改變[22]。黃冬維[23]對山羊TSHR基因多態性的研究發現5個多態位點的基因型分布在季節性品種和非季節性品種間存在顯著差異，提示著TSHB基因這5個連鎖的多態位點可能與山羊繁殖季節性相關。因此，本研究中兩個綿羊品種中基因型分布差異極顯著的變異位點很可能與綿羊的季節性繁殖相關。下一步將擴大試驗樣本和試驗綿羊品種，重點分析這些位點對TSHR基因表達和功能的影響，明確其不同基因型和單倍型與繁殖性狀的相關性，為對常年發情的綿羊品種的選育和改良，提高綿羊的生產性能和繁殖力提供更加直接的指導和依據。

4結論

4.1在TSHR基因外顯子上共發現6個多態位點，其中4個在兩個綿羊品種中基因型的分布差異極顯著，即具有潛在生物學功能和表型效應的突變位點，它們可組成6種單倍型，烏珠穆沁羊以H1單倍型為主，湖羊以H4為主，他們可能與這兩種綿羊季節性和常年性發情有關。

4.2外顯子上的SNP5突變位點影響TSHR基因mRNA二級結構的穩定性和蛋白質二級結構，可能是與綿羊季節性繁殖相關的重要功能位點。

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(編輯郭云雁)

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.07.006

收稿日期：2015-12-08

基金項目：國家自然基金聯合基金重點項目(U1503285)；“十二五”863項目(2011AA100307-02)

作者簡介：軒俊麗(1990-)，女，河南太康人，碩士生，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail:xuanjunli3566@126.com *通信作者：杜立新，教授，E-mail:lxdu@263.net ；張莉，副研究員，E-mail:zhangli07@caas.cn；馬友記，教授，E-mail: yjma@gsau.edu.cn

中圖分類號：S826；S813.3

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)07-1342-12

Study on Exon Polymorphism of Seasonal Breeding Related GeneTSHRin Sheep

XUAN Jun-li1，2，MA Xiao-meng2，WANG Hui-hua2，3，CAO Jia-xue2，WEI Cai-hong2，ZHAO Fu-ping2，MA You-ji1*，ZHANG Li2*，DU Li-xin1，2*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China；2.InstituteofAnimalScience，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100193，China)

Abstract:The study aimed to investigate the genetic variation of thyroid stimulating hormone receptor (TSHR) gene in Ujumqin sheep and Hu sheep，which had different reproductive performance and oestrous cycle，and the distribution of different haplotypes caused by the polymorphic site and its effects on mRNA and secondary structure of protein.This study provided a theoretical basis for seeking the influence of the mutation on TSHR gene expression and phenotype.Direct sequencing was taken to study genetic variation of the TSHR gene in 172 sheep of 2 Chinese Mongolian sheep strains.6 mutant sites were found and genotyped.Chi-square test for independence was performed to find the genotypes of the 4 SNPs (SNP1，SNP3，SNP4 and SNP5) which were significantly different between the 2 sheep populations(P<0.01).The SNP5 was missense mutation，the other sites were synonymous mutations.Linkage disequilibrium analysis was used to screen the 4 sites，complete linkage happened between SNP3 and SNP4，and the other sites present different degrees of interlocking relationship.Bioinformatics analysis revealed that not only the mutations occured in the TSHR，but also different haplotypes could result in the changes of mRNA and the secondary structure of protein.These results indicate that：(1) The genotypes distribution of 4 sites in TSHR gene have significant differences between the 2 sheep populations.They form 6 haplotypes，among which H1(CGCC) is the advantage haplotype in Ujumqin sheep，and H4(TTTG) is the advantage haplotype in Hu sheep.(2) The SNP5 site affects the stability of mRNA and protein secondary structure of TSHR gene，which may be one of the important functional sites with potential phenotypic effects.

Key words:sheep；seasonal breeding；TSHR gene；polymorphism