RNA-seq轉錄組測序分析不同季節對檳榔江水牛精液品質的影響

耿紅紅，張敬旸，李　蓮，王根林

(南京農業大學 動物科技學院，南京 210095)

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RNA-seq轉錄組測序分析不同季節對檳榔江水牛精液品質的影響

耿紅紅，張敬旸，李蓮，王根林*

(南京農業大學 動物科技學院，南京 210095)

摘要：本研究旨在利用RNA-seq技術對不同季節檳榔江水牛全血mRNA進行分析，找出不同季節精液品質候選基因。選取5頭生長狀況相近的3～5歲檳榔江水牛，進行春、夏、秋、冬4個季節的精液品質(鮮精活力、精子畸形率、射精量、精子密度)檢測。根據精液品質，選取差異極顯著的春(BL)、夏(SBL)兩個季節的水牛樣品進行RNA-seq轉錄組測序分析。頸靜脈采集全血，抽提mRNA并組內混合制樣，利用RNA-seq技術分析不同季節檳榔江水牛全血mRNA差異表達。根據差異倍數>1.5，P<0.05的標準進行篩選，得到差異基因，再利用DAVID 6.7軟件對差異基因進行GO和KEGG分析，通過RT-PCR驗證基因芯片結果的準確性。結果表明：差異表達基因84個，其中上調基因56個，下調基因28個；GO分析發現，這些差異基因與應激反應、免疫反應有關；KEGG分析表明，差異基因顯著富集到腫瘤壞死因子(TNF)和T細胞受體信號通路。其中，神經營養因子受體類似物死亡結構域(NRADD，又叫熱休克蛋白因子1 (HSF1))、原癌基因FOS和JUN，與精液品質相關性強，可作為進一步研究的靶基因。

關鍵詞：RNA-seq；檳榔江水牛；差異表達基因；精液品質

檳榔江水牛(Betelnut-jiang buffalo)是中國發現唯一的河流型水牛，主產于騰沖檳榔江上游，檳榔江水牛體型較小，飼料消耗較低，而且產奶量相對較高，牛奶營養豐富，是比較好的乳用品種。當前，人工授精技術及冷凍精液的日益普及，具有優良性狀的種公牛越來越受到重視。檳榔江水牛作為改良產奶量低的沼澤型水牛的優良父本，探討其遺傳優勢有現實意義。

種公牛的精液品質受到季節、品種、年齡、營養和飼養水平等要素的影響，其中季節變化，尤其是溫度濕度的變化對精液品質的影響最為顯著。研究表明，牲畜自身的生理狀態和精子發生需要一個適宜的外界環境作為保障[1]。季節變化中夏季溫度較高時會極大的影響公牛的精液品質和生產效益[2-3]。衡量精液品質的指標主要有射精量、精子密度、原精活力、凍后精子活力、畸形率和有效精子數等。相關數據顯示，種公牛夏秋季采精量明顯低于冬春季，其中采精量夏季<秋季<冬季<春季[4]。西門塔爾種公牛原精活力和精子密度隨季節變化明顯，具體為春季至秋季呈下降趨勢，尤其在6～9月份，達到最低值，冬季后又明顯上升[5]。M.Sadegh等[6]通過對印度水牛夏季和冬季繁殖性能的比較發現，冬季精液采集量、密度、精子活力和直線運動精子數均高于夏季，而精子頭部畸形率則夏季高于冬季。由此可見，季節變化會引起精液品質表觀參數發生規律性的變化。

隨著快速發展的分子生物學技術，加之候選基因法在動物遺傳育種中的廣泛應用，人們不僅可以在DNA、RNA及蛋白表達水平上研究影響精液品質的候選基因或與其緊密連鎖的分子標記，還可以將分子標記與多基因效應合并使用進行標記輔助選擇，從動物育種角度進行提前選擇，最終借助遺傳的改變改善精液品質，以提高經濟效益。轉錄組測序技術(RNA-seq)主要是用高通量測序技術將mRNA、sRNA 以及ncRNA 等的序列測定出來，以期能夠全面快速地獲得幾乎所有的所需研究樣本的轉錄本，并反映出它們的表達水平[7]。RNA-seq在真核生物的基因表達調控、醫學和動植物遺傳育種等方面的研究具有不可估量的潛力[8-9]。季節變化對公牛精液品質的研究大多數停留在表觀指標的規律性變化，而對于分子層面甚少涉及，這對選育工作極為不利，利用轉錄組學的技術研究精液品質亦鮮見報道。故本研究對5頭成年中國檳榔江水牛公牛在春、夏、秋、冬4個季節進行精液品質的跟蹤檢測，并采用RNA-seq技術進行差異表達基因篩選分析，探究季節對檳榔江公牛精液品質的影響，為種公牛的選育提供理論依據。

1材料與方法

1.1樣本收集

自湖北省武漢市興牧科技有限公司種公牛繁育場選取具有相同的飼養條件，年齡3～5歲，體型相近；健康，無患病史的成年檳榔江水牛種公牛5頭。

1.2精液品質相關指標的測定

根據國家牛冷凍精液檢測標準(GB/4143-2008)的相關規定，對精液指標包括射精量、鮮精活力、密度、畸形率進行測定。具體方法：采用臺牛法采集精液，射精量即采即測，一周兩次；精子密度采用密度儀測定，直接讀取數據；精子活力通過電視顯微裝置觀察，每樣片觀察3個視野，并觀察不同液層，進行評估；畸形率的測定采用姬姆薩染色法，并用血球分類計數器進行計數，主要步驟包括制片、固定、染色、鏡檢，鏡檢時每個抹片至少觀察200個精子。

1.3RNA的提取、建庫及測序

采用Trizol法進行檳榔江水牛外周血總RNA的抽提；提取所得RNA通過紫外分光光度計分析、瓊脂糖凝膠電泳和Agilent 2200 Bioanalyzer進行質檢 (A260 nm/A280nm≥1.5，A260 nm/A230 nm≥1，RNA完整性≥7)，若電泳發現有基因組DNA污染，則用DNA酶消化處理；送廣州銳博生物技術公司完成RNA測序。

1.4芯片結果數據分析與處理

根據 GeneChip Scanner3000 掃描芯片結果，用Command Console Software 3.1 讀取得到的原始數據，采用GeneSpring Software 11.0歸一化處理質控合格的數據(MAS 5.0)進行數據分析。本研究篩選的標準為差異倍數值(Fold change值，即FC值)>1.5且P<0.05，利用網絡數據庫及相關生物信息學軟件對差異表達基因進行Pathway分析、GO分析以及層次聚類分析等，對數據中所涉及的分子功能、分子代謝通路以及可能的表達調控機制進行分析。

1.5差異表達基因的qRT-PCR驗證分析

1.5.1反轉錄生成cDNA 使用TaKaRa PrimeScript?RT reagent kit with gDNA eraser 反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄合成cDNA，20 μL PCR反應體系：mRNA模板4 μL，Premix Taq Version 2.0 4 μL，ddH2O 12 μL。PCR反應條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。

1.5.2熒光定量PCR 采用SYBR Green方法進行實時定量PCR反應。所需引物用Primer 5軟件設計，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，引物信息詳見表1，20 μL反應體系：cDNA模板2 μL，ROX(SYBR Green Master)10 μL，ddH2O 7.2 μL，上下游引物各0.4 μL。在7000 Sequence Detection System(Applied Biosystems)儀上進行，每個樣本均重復3次。使用儀器自帶軟件檢測各樣品CT值，并取平均值。mRNA表達水平用2-ΔΔCT方法來表示。

表1　RT-PCR引物序列

2結果

2.1不同季節檳榔江水牛精液指標差異分析

檳榔江水牛不同季節精液指標差異的分析結果見表2。由表2可知，檳榔江水牛采精量在季節之間差異不顯著(P>0.05)。精子活力春冬和夏秋季節差異均不顯著，春冬與夏秋季節差異極顯著，在4個季節的變化為春季>冬季>秋季>夏季，說明夏季的到來會對檳榔江水牛精子活力產生影響，這種影響一直會持續到秋季，直到冬季原精活力才會恢復到之前的水平。檳榔江水牛精子密度春冬季節差異顯著，并與其他季節差異極顯著，且春季>冬季>秋季>夏季，表明夏季檳榔江水牛精子密度明顯降低，夏季結束后，檳榔江水牛精子密度逐漸恢復到原有水平。夏季檳榔江水牛凍后精子畸形率夏季與其他季節相比差異極顯著，春秋和冬季則差異不顯著，且4個季節冬季<春季<秋季<夏季。

通過對檳榔江公牛不同季節精液相關指標的分析發現夏季是檳榔江公牛精液品質最差的季節，秋季次之，冬春季節差異不顯著，選擇具有代表性的夏季和春季作為試驗組和對照組進行轉錄組測序。

表2　檳榔江水牛不同季節精液指標比較(n=5)

同行肩標不同小寫字母表示不同季節差異顯著(P<0.05);不同大寫字母表示不同季節差異極顯著(P<0.01)

Lowercase superscripts in the same row indicate significant differences (P<0.05)；upper-case superscripts indicate extremely significant differences (P<0.01)

2.2差異表達基因的篩選

利用RNA-seq技術檢測試驗組和對照組(SBL∶BL)間差異表達基因，結果發現，試驗組比對照組有顯著差異表達基因84個，其中56個基因表達上調，28個基因表達下調(Fold change>1.5，P<0.05)，部分結果見表3。

2.3候選基因的GO功能分類

利用DAVID Bioinformatics Resources 6.7中的Functional Annotation Chart模塊將差異表達基因按照3大功能板塊，包括生物學過程(BP)、細胞組分(CC)和分子功能(MF)進行限定和描述。結果(圖1)發現，共涉及到215條GO Terms(P<0.05)。差異表達基因主要與應激反應、免疫反應、脂多糖代謝、RNA加工拼接及蛋白磷酸化相關。脂多糖代謝與炎癥反應和凋亡相關。FOS、JUN、NRADD主要參與應激反應、免疫反應和蛋白磷酸化過程。DDX5主要參與RNA加工拼接過程。在細胞組成分中，差異表達基因主要參與膜細胞器的形成，在分子功能中，差異表達基因主要與結合功能相關。

2.4候選基因的KEGG通路富集分析

在生物體內，不同基因相互協調行使其生物學功能，根據KEGG分析有助于進一步分析差異表達基因中存在的顯著性富集的代謝通路注釋。本研究使用 DAVID Bioinformatics Resources 6.7軟件中的“KEGG Functional Annotation Chart”模塊分別對差異顯著基因進行通路富集分析，結果共得到90條通路，其中顯著富集的通路有18條，主要參與到剪接體、炎癥性腸病、雌激素及TNF(腫瘤壞死因子)等通路中(圖2)。

2.5差異表達基因的RT-PCR初步驗證

選出8個差異顯著基因進行熒光定量PCR檢測，結果見圖3。NRADD、FOS、JUN、DDX5、DUSP1、UBE2B為上調差異表達基因，KLK1和MMP9為下調差異表達基因。且定量結果與RNA-seq結果趨勢一致，證明轉錄組在篩選差異表達基因方面的可靠性。

3討論

表3　轉錄組測序前10個上下調基因

圖1　GO分析結果Fig.1　The GO analysis result

圖2　KEGG分析Fig.2　The KEGG analysis result

種公牛精液品質會隨著季節變化而變化。本研究結果顯示，與其他3個季節相比，夏季精子活力較差，畸形率較高，密度較低。與其他季節相比，春冬季節精子活力較高，畸形率最低，密度較高，春冬季節相比，春季精液各指標略優于冬季。夏季是檳榔江公牛精液品質最差的季節，秋季次之，冬春季節差異不顯著。張汝等[10]在對檳榔江水牛精液品質的研究中發現，檳榔江水牛冷凍精液解凍活力和精子密度春、秋、冬季極顯著高于夏季，采精量夏季低于秋季，夏季與冬季的差異不顯著，這與本研究結果相一致。而夏季對公牛精液品質的影響可能與其溫度濕度較高引起機體一系列的變化有關系。桑潤滋等[11]研究表明，夏季溫度較高時，容易引起公牛熱應激，可造成荷斯坦種公牛精液品質顯著下降，使原精活力、凍精活力、精子密度、活精子百分率和頂體完整率分別比春季下降3.13%、11.1%、34.8%、15.0%和17.8%，精子畸形率比春季上升25.5%。在精子生成過程中，熱誘導能引起生精細胞凋亡，睪丸內精母細胞和圓形精子細胞對溫度升高最敏感，是凋亡的主要細胞[12]，夏季高溫刺激，有可能引起生精細胞的逐漸調亡，最終造成精子密度降低，活力較差。

1.NRADD;2.JUN;3.DUSPI;4.KLK1;5.FOS;6.DDX5;7.UPF2B;8.MMP9A.RT-PCR結果；B.RNA-seq結果A.RT-PCR result；B.RNA-seq result圖3　RT-PCR檢測Fig.3　Confirmation of RT-PCR

本試驗選取具有代表性的夏春季節檳榔江水牛作為試驗組和對照組，通過轉錄組測序，并在測序評估的基礎上，共篩選到84個差異表達基因，包含56個上調基因和28個表達下調基因。對差異表達基因進行篩選、功能注釋和富集分析后發現，參與應激反應、免疫反應相關基因HSF1、FOS和JUN在夏季試驗組中表達量顯著高于春季對照組。其中NRADD，又叫HSF1，屬于熱休克轉錄因子[13]，是最早被發現、最具代表性、最重要的熱休克轉錄因子[14]。HSF1在熱應激反應中的主要功能是在熱休克基因的表達過程中與相應啟動子結合，啟動基因的轉錄過程，最終促進熱休克蛋白(Heat shock proteins，HSP)的表達并使其表達增加[15]。本研究中夏季檳榔江水牛外周血中HSF1表達量較春季顯著上調，且檳榔江水牛在夏季精子數量減少，活力下降，可能與夏季高溫高濕氣候引起檳榔江水牛出現熱應激反應，并激活了熱應激相關生物學過程和通路，導致HSF1表達量上升，以期對抗溫度升高的不良環境對自身造成的損害。由此，筆者推斷HSF1與精液品質相關。HSF1轉基因小鼠生精障礙的機制為HSF1激活熱休克蛋白(HSP60)和熱休克蛋白(HSP105)，后者誘導著生殖細胞的大量凋亡，致使雄性小鼠無成熟精子，且研究表明由熱誘導造成的雄性不育多數與HSF1的活化相關[16]。且HSF1能夠啟動雄性生殖細胞中的細胞程序化死亡，將雄性小鼠生精細胞阻滯在減數分裂期[17]。此外，J.Korfanty等[18]在小鼠模型中發現HSF1的過度表達引起精母細胞的大量凋亡并導致雄性不育。

FOS和JUN均參與TNF信號通路和雌激素信號通路。TNF信號通路主要與信號傳導，細胞凋亡等生物學過程相關。包括熱應激、趨化因子和炎癥因子等都能夠激活該通路。本研究中檳榔江水牛夏季精液品質下降可能是與TNF信號通路的激活相關。該通路的激活引起FOS和JUN基因的上調，而這些基因的上調能夠對抗細胞的凋亡，降低對精液品質的影響。由此推斷FOS和JUN基因上調可能與精液品質相關。K.M.Robertson等[19]研究表明，雌激素具有防止未變態精子細胞凋亡，維持成熟精子功能的作用。FOS(也叫C-FOS)和JUN(也叫C-JUN)是激活蛋白-1 (Activator protein-1，AP-1)類轉錄因子，屬于原癌基因，其蛋白產物作為核轉錄因子在細胞增殖和分化中發揮重要作用。原癌基因對精液品質的影響，一方面是通過原癌基因轉錄產物的特異性或不同形式，另一方面是原癌基因在精子發生過程中不同水平的表達[20]。研究發現，多種應激可影響C-FOS和C-JUN的表達，從而誘導C-JUN氨基末端激酶(C-JUN N-terminal kinase，JNK)和p38絲裂原活化蛋白酶(p38 mitogen-acdvated protein kinase，p38)的表達，最終調控細胞的凋亡[21]。雌激素、促性腺激素及多種生長因子促進間質細胞的生長發育和睪酮的分泌是通過FOS和JUN家族的癌基因表達增強而實現的。人絨毛膜促性腺激素(hCG)和多種生長因子能刺激睪丸間質細胞的生長發育和睪酮分泌中均伴有原癌基因(包括FOS)的表達增強，且已證實C-FOS在睪丸組織中有廣泛的表達，且在生精周期中有周期特異性[22]。本研究中與春季對照組相比較，夏季檳榔江水牛外周血中C-FOS和C-JUN表達量顯著提高，可以推測這與檳榔江公牛在夏季高溫高濕環境下發生應激反應，以期對抗不良刺激相關。C-FOS和C-JUN的作用可能與誘導精原細胞增殖、防止生精細胞凋亡、維持成熟精子功能有關。

細胞內的生物學過程，例如代謝、膜運輸、信號轉導和細胞的生長周期等的完成都是基于各個基因間系統地相互協調而進行的。通過對基因進行KEGG和GO富集分析，可以更深入地了解這些基因的生物學功能[23]。

4結論

本研究結果表明，將HSF1、FOS和JUN基因作為不同季節下影響檳榔江公牛精液品質的候選基因，對于培育抗應激品種，對養牛業持續、健康和穩定發展具有重要的理論和現實意義。

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(編輯 程金華)

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.07.009

收稿日期：2016-03-22

基金項目：國家自然科學基金項目(31372290);“十二五”國家科技計劃項目(2012BAD12B10)

作者簡介：耿紅紅(1989-)，女，山西孝義人，碩士生，主要從事動物生殖與生理調控研究，E-mail：15150537075@163.com *通信作者：王根林，教授，E-mail:genlwang@sina.com

中圖分類號：S823.8+3

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)07-1373-08

Semen Quality Analysis of Betelnut-jiang Buffalo in Different Seasons by RNA-seq

GENG Hong-hong，ZHANG Jing-yang，LI Lian，WANG Gen-lin*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology，NanjingAgriculturalUniversity，Nanjing210095，China)

Abstract:To determine the key candidate genes related to semen quality in different seasons，the mRNA profiling of Chinese Betelnut-jiang buffalo were analyzed by RNA-seq.Based on similarities in growth status，5 Betelnut-jiang buffalo bulls were selected and their semen quality were tested (including ejaculate volume，fresh sperm motility，sperm density and abnormality rate).According to the semen quality，the samples of summer (treated as SBL group) and spring (as BL group) were selected for RNA-seq.We collected the whole blood in jugular vein of Betelnut-jiang buffalo bulls，extracted the mRNAs and mixed them within group.Then，the mRNA profiling was used to measure the mRNAs in Betelnut-jiang buffalo bulls.Gene expression levels with >1.5 fold change and P value < 0.05 between the BL and SBL groups were further analyzed.Furthermore，GO and KEGG were used to analyze the genes enrichment.Finally，RT-PCR was used to confirm the RNA-seq result.The results indicated 84 differentially expressed genes.Among these，56 genes were up-regulated and 28 genes were down-regulated in SBL group.The GO search revealed that these differential expression genes were mainly related to stress reaction and immune response.And the KEGG selected the TNF signaling pathway and T cell receptor signaling pathway.Neurotrophin receptor alike death domain(NRADD，also named heat shock factor protein 1(HSF1))，localisation of FOS (FOS) and jun proto-oncogene (JUN)，were strongly associated with semen quality in different seasons which could be used as target genes for further study.

Key words:RNA-seq；Betelnut-jiang buffalo；differently expressed genes；semen quality