基于PRLR-JAK-STAT5信號(hào)傳導(dǎo)通路測(cè)定鵝催乳素的新方法

宋金委，李　輝，陳　哲，施振旦，王振勇*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安 271018； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，南京 210014)

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基于PRLR-JAK-STAT5信號(hào)傳導(dǎo)通路測(cè)定鵝催乳素的新方法

宋金委1，李輝2，陳哲2，施振旦2，王振勇1*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安 271018； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，南京 210014)

摘要：旨在建立鵝催乳素(Goose prolactin，gPRL)的高靈敏度的測(cè)定方法。本研究設(shè)計(jì)出基于PRLR-JAK-STAT5信號(hào)通路的熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)。首先克隆鵝PRLR基因CDS區(qū)序列，合成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子5 (Signal transducer and activator of transcription 5，STAT5) 信號(hào)應(yīng)答序列，并分別插入真核表達(dá)載體pCMV6-Entry和熒光素酶報(bào)告載體pGL3-Enhancer中，構(gòu)建成為信號(hào)接收載體和信號(hào)應(yīng)答載體。然后將兩載體同篩選基因載體pEZX-MR03及內(nèi)參載體pRL-TK共轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中，經(jīng)嘌呤霉素篩選后獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株。分別用終濃度為0、30、60、90 ng·mL-1的PRL刺激轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，通過(guò)qRT-PCR和雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定在不同PRL濃度下轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株中熒光素酶(Luciferase， Luc)基因的相對(duì)表達(dá)量和相對(duì)活性的變化。篩選出10株成功整合有全部4個(gè)轉(zhuǎn)基因載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株，經(jīng)過(guò)不同濃度PRL刺激后，篩選出一株細(xì)胞，其熒光素酶基因表達(dá)量和酶活性均表現(xiàn)出隨PRL濃度升高而上調(diào)的趨勢(shì)。結(jié)果表明，建立的基于PRLR-JAK-STAT5信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)檢測(cè)鵝PRL生物活性的新方法是可行的，為準(zhǔn)確測(cè)定家禽PRL奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：鵝催乳素受體；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；STAT5；熒光素酶報(bào)告基因；催乳素活性

催乳素(Prolactin，PRL)又名促乳素，因能促進(jìn)鴿子嗉囊上皮增生，生成嗉囊乳而得名[1]。PRL的生理功能超過(guò)300多種，是名副其實(shí)的萬(wàn)能激素。PRL對(duì)禽類的繁殖活動(dòng)具有重要的調(diào)控作用，對(duì)于季節(jié)性繁殖的禽類，PRL的季節(jié)性分泌可調(diào)節(jié)禽類對(duì)光照敏感性的變化，PRL分泌上升造成光鈍化效應(yīng)抑制繁殖活動(dòng)，使禽類進(jìn)入季節(jié)性非繁殖狀態(tài)，反之則進(jìn)入繁殖狀態(tài)[2]。研究表明，雌禽產(chǎn)蛋可促進(jìn)腦垂體分泌高濃度的PRL，從而促進(jìn)和維持就巢行為[3]，同時(shí)抑制垂體促性腺激素的分泌[4]，使禽類的卵巢萎縮及功能下降，終止排卵和產(chǎn)蛋，最終引起繁殖力下降[5]。而中低濃度的PRL則表現(xiàn)出促進(jìn)禽類的卵泡發(fā)育和產(chǎn)蛋性能[6-8]以及促進(jìn)雄禽睪丸發(fā)育[9]的作用。因此PRL對(duì)禽類繁殖活動(dòng)的調(diào)控表現(xiàn)出依分泌水平或血液濃度而異的復(fù)雜機(jī)制，在禽類繁殖調(diào)控中具有重要作用。尤其近年探索鵝反季節(jié)繁育技術(shù)取得較大進(jìn)展，鵝PRL濃度水平在反季節(jié)繁育過(guò)程中對(duì)鵝不同繁殖階段起到一定的指示作用[10-11]，準(zhǔn)確測(cè)定鵝PRL濃度可為鵝反季節(jié)繁育技術(shù)的深入研究提供幫助，因此，進(jìn)行PRL的檢測(cè)，在禽類繁育調(diào)控研究中具有重要意義。

PRL的檢測(cè)方法主要包括免疫測(cè)定和生物學(xué)測(cè)定法兩種。其中免疫測(cè)定法包括放射免疫法(RIA)、放射受體法(RRA)、酶聯(lián)免疫法(ELISA)、化學(xué)免疫發(fā)光法(CIA)等。在當(dāng)前多數(shù)檢測(cè)禽類PRL的相關(guān)文獻(xiàn)中均采用放免法，即利用天然PRL及其抗體或用重組PRL蛋白制備抗體進(jìn)行放免分析。但是該方法缺點(diǎn)十分明顯，主要表現(xiàn)在同位素衰變導(dǎo)致標(biāo)記有效期短、損害試驗(yàn)人員健康和污染環(huán)境等方面[12]，故目前應(yīng)用有下降的趨勢(shì)。而且放免法測(cè)定的是蛋白的免疫活性，而非生物活性，由于具有免疫活性的蛋白不一定具有生物活性，而在生物體內(nèi)只有具有生物活性的蛋白才能發(fā)揮生理作用，因此放免法測(cè)定的蛋白濃度并不等同于生物體內(nèi)有效蛋白濃度。本研究設(shè)計(jì)了基于PRLR-JAK-STAT5信號(hào)通路測(cè)定鵝PRL的方法，為開發(fā)針對(duì)鵝及禽類PRL蛋白的生物活性檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

Trizol試劑、Lipo fectamine LTX、Opti-MEM購(gòu)自Invitrogen公司。TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。人胚腎細(xì)胞HEK293T購(gòu)自凱基生物。pGL3-Enhancer、pRL-TK載體、雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司。雞PRL標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)農(nóng)業(yè)部。 篩選基因載體pEZX-MR03和pCMV6-Entry本實(shí)驗(yàn)室保存。PremixTaq酶、T4 DNA連接酶、pMD19-T、感受態(tài)細(xì)菌E.coliDH5α、內(nèi)切酶、瓊脂糖回收純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自寶生物(大連)有限公司。中提去內(nèi)毒素質(zhì)粒試劑盒購(gòu)自Axygen公司。基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司。嘌呤霉素購(gòu)自MPbio公司。FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)購(gòu)自Roche公司。胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液(100X) (Penicillin-Streptomycin Solution)雙抗購(gòu)自Gibco公司。

1.2方法

1.2.1鵝PRLR基因的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建屠宰性成熟的健康揚(yáng)州鵝，取卵巢組織，裝入無(wú)菌凍存管液氮速凍后，于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)GenBank收錄的鵝PRLR基因序列(Gene ID：DQ209271.2)，采用Oligo 6.0 軟件設(shè)計(jì)鵝PRLR基因CDS區(qū)序列引物，并在上下游引物的5′端引入Hind III和XhoI酶切位點(diǎn)(表1)。Trizol法提取鵝卵巢總RNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證RNA的完整性，并用Nanodrop2000(Thermo)紫外可見光分光光度計(jì)測(cè)定總RNA純度和濃度。以提取的總RNA為模板，用全式金Trans Script One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。 以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得PRLR的CDS區(qū)，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后，雙酶切凝膠純化回收并定向克隆到真核表達(dá)載體pCMV6-Entry的Hind Ⅲ和XhoI位點(diǎn)，構(gòu)建成pCMV6-PRLR-Entry表達(dá)載體，利用雙酶切和測(cè)序驗(yàn)證所構(gòu)建載體的準(zhǔn)確性。

1.2.2重組STAT5雙熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建根據(jù)已知的STAT5結(jié)合序列：AGATTTCTAGGAATTCAATCC，人工合成5個(gè)串聯(lián)STAT5結(jié)合序列并定向克隆到pGL3-Enhancer的KpnⅠ和XhoⅠ位點(diǎn)中，構(gòu)建成pGL3-(STAT5)5-Enhancer載體，利用雙酶切和測(cè)序驗(yàn)證所構(gòu)建載體的準(zhǔn)確性。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的篩選和驗(yàn)證將復(fù)蘇并傳代的293T細(xì)胞接種于6 孔板中，在含10%胎牛血清1%雙抗的 DMEM中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合率 60%～70%時(shí)，換培養(yǎng)基為DMEM，將去內(nèi)毒素提取且線性化的pCMV6-PRLR-Entry、pGL3-(STAT5)5-Enhancer、pEZX-MR03和pRL-TK，采用脂質(zhì)體Lipo fectamine LTX 轉(zhuǎn)染細(xì)胞，6 h后換含10%胎牛血清1%雙抗的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞狀態(tài)恢復(fù)后采用嘌呤霉素篩選，篩選過(guò)程：首先采用終濃度為1 μg·mL-1的嘌呤霉素進(jìn)行高壓篩選，6 d后，更換終濃度為0.5 μg·mL-1嘌呤霉素進(jìn)行維持篩選。篩選16 d后，出現(xiàn)細(xì)胞克隆，待克隆長(zhǎng)大后，在熒光顯微鏡下觀察，然后采用濾紙胰酶消化方法挑取EGFP陽(yáng)性克隆。將所挑取的細(xì)胞克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后凍存?zhèn)溆谩８鶕?jù)Luc基因序列、人β-actin基因序列和克隆得到的鵝PRLR基因序列，設(shè)計(jì)檢測(cè)引物(表1)。將得到的單克隆細(xì)胞株分別提基因組DNA，用基因組DNA為模板，用PRLR、Luc的引物分別進(jìn)行PCR驗(yàn)證，篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的單克隆細(xì)胞株。

表1　引物序列

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定單克隆細(xì)胞株中鵝Luc基因的相對(duì)表達(dá)量復(fù)蘇挑取的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株于6孔板中，在含10%胎牛血清的 DMEM 中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合率 70%～80%時(shí)，加入不同濃度的PRL，濃度梯度為0、30、60 ng·mL-1。繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，收集細(xì)胞提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，以β-actin為內(nèi)參基因，以Luc和鵝PRLR引物用PremixTaq酶分別進(jìn)行普通PCR檢測(cè)鵝PRLR和Luc的表達(dá)。同時(shí)采用ABI7500進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定Luc的相對(duì)表達(dá)量，采用2-△△Ct分析方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.5熒光素酶的活性測(cè)定復(fù)蘇挑取的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株于 6 孔板中，在含10%胎牛血清的 DMEM 中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合率 70%～80%時(shí)，加入不同濃度的PRL，濃度梯度為0、30、60和90 ng·mL-1。繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，收集細(xì)胞，每孔加入 20 μL收集細(xì)胞裂解緩沖液，室溫?fù)u晃 15 min 后，吹打細(xì)胞，收集裂解液至 96 孔白板，加入 100 μL熒光素酶分析劑(LARⅡ)，放置發(fā)光檢測(cè)儀Glomax(Promega)中，測(cè)定螢火蟲(Firefly)熒光素酶活性。加入100 μL Stop &Glo Reagent，測(cè)定海腎(Renilla)熒光素酶活性。計(jì)算熒光素酶相對(duì)活性。發(fā)光儀程序設(shè)置：延遲 2 s，測(cè)定時(shí)間5 s。制定熒光素酶相對(duì)活性隨PRL濃度變化量。

2結(jié)果

2.1pCMV6-PRLR-Entry和pGL3-(STAT5)5-Enhancer載體的構(gòu)建

PCR獲得了2 498 bp的鵝PRLR的CDS區(qū)(圖1A)。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后，將該片段定向克隆到真核表達(dá)載體pCMV6-Entry中的HindⅢ和XhoⅠ位點(diǎn)，并進(jìn)行雙酶切和測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果證明所構(gòu)建的載體是正確的，表達(dá)載體示意圖如圖1B。將人工合成的(STAT5)5序列克隆到pGL3-Enhancer中的KpnⅠ和Xhod Ⅰ位點(diǎn)，載體示意圖如圖1C，并且通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證證明所構(gòu)建的載體是正確的。

M.DL5000 DNA marker；1，2.PRLR DNAA.PCR獲得2 498 bp的鵝PRLR的CDS片段電泳圖；B.利用Hind Ⅲ和Xho I酶切位點(diǎn)將PRLR定向克隆到真核表達(dá)載體pCMV6-Entry；C.利用KpnⅠ和Xho I酶切位點(diǎn)將(STAT5)5定向克隆到真核表達(dá)載體pGL3-EnhancerA.The sequence of CDS 2 498 bp region goose PRLR gene obtained by PCR；B.PRLR gene was eukaryotic expression cloned into the pCMV6-Entry vector by Hind III and Xho I restriction sites；C.(STAT5)5 was eukaryotic expression cloned into the pGL3-Enhancer vector by KpnⅠand Xho I restriction sites圖1　pCMV6-PRLR-Entry和pGL3-(STAT5)5-Enhancer重組載體的示意圖Fig.1　The schematic maps of the recombinant vectors pCMV6-PRLR-Entry and pGL3-(STAT5)5-Enhancer

2.2轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的制備與鑒定

將線性化的去內(nèi)毒素pCMV6-PRLR-Entry Vector，pGL3-(STAT5)5-Enhancer，pEZX-MR03和pRL-TK轉(zhuǎn)染細(xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選后獲得細(xì)胞單克隆，挑取后單克隆細(xì)胞株，在熒光顯微鏡488 nm波長(zhǎng)激發(fā)下可觀察到EGFP的表達(dá)(圖2a)，白光對(duì)照如圖2b。

分別用PRLR和Luc的引物對(duì)單克隆細(xì)胞株基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，近200個(gè)單克隆細(xì)胞株中篩選獲得10株P(guān)RLR和Luc都穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株(圖2c，2d)。

2.3轉(zhuǎn)基因細(xì)胞對(duì)PRL應(yīng)答的檢測(cè)

對(duì)經(jīng)PRL刺激后的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株進(jìn)行普通PCR，檢測(cè)鵝PRLR和Luc的表達(dá)(圖3a)，可看出PRLR和Luc均有表達(dá)。同時(shí)采用ABI7500進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定Luc的相對(duì)表達(dá)量(圖3b)，Luc相對(duì)表達(dá)量隨著PRL濃度的上升而上升。

2.4Luc相對(duì)活性隨PRL濃度變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染基因的單克隆細(xì)胞株中，分別加PRL至終濃度分別為0、30、60、90 ng·mL-1，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，測(cè)定Luc相對(duì)活性，制定Luc相對(duì)活性隨PRL濃度變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4)。

3討論

PRL是動(dòng)物生殖過(guò)程中的重要調(diào)控激素，其功能的發(fā)揮同其它激素一樣，只有通過(guò)其受體PRLR介導(dǎo)才能激活信號(hào)通路，并將信號(hào)傳遞至下游靶基因而發(fā)揮作用。PRLR是一種單鏈跨膜蛋白受體，屬于細(xì)胞因子受體超家族，并且在多個(gè)組織中廣泛表達(dá)。PRLR分子量介于34 000～37 000，由胞外域(Extracellular domain，ECD)、跨膜域(Transmembrane domain，TMD)和胞內(nèi)域(Intracellular Domain，ICD)組成[13]。胞內(nèi)域含有兩個(gè)相當(dāng)保守的區(qū)域box1和box2，近膜端的box1由脯氨酸和疏水氨基酸殘基富集的8個(gè)氨基酸殘基組成，由于脯氨酸特有的結(jié)構(gòu)特征，box1內(nèi)保守的P-x-P基序形成特異的結(jié)構(gòu)而被轉(zhuǎn)導(dǎo)分子所識(shí)別[14]，box1主要參與與JAK2 ( Just another kinase 2 或janus kinase 2 )的結(jié)合以及JAK2的磷酸化。胞內(nèi)域中存在著對(duì)信號(hào)傳導(dǎo)至關(guān)重要的JAK ( Just another kinase 或janus kinase ) 家族。該家族是一種非受體型酪氨酸激酶，家族中不同成員參與不同類型的細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)；STAT(Signal transducers and activators of transcription，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子) 家族是在研究干擾素對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控中被認(rèn)識(shí)的，是一種DNA 結(jié)合蛋白[15]。JAK-STAT途徑是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一條細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，廣泛參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程，是眾多細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑[16]。

M.DL500 DNA marker；1～23.不同單克隆細(xì)胞株基因組DNA；24.陽(yáng)性對(duì)照。a.HEK 293T單克隆細(xì)胞株綠色熒光圖片(10×20)；b.HEK 293T單克隆細(xì)胞株白光圖片(10×20)；c.單克隆細(xì)胞株基因組DNA用PRLR驗(yàn)證引物進(jìn)行PCR的結(jié)果電泳圖；d.單克隆細(xì)胞株基因組DNA用Luc驗(yàn)證引物進(jìn)行PCR的結(jié)果電泳圖M.DL500 DNA marker；1-23.The genomic DNA of monoclonal cell lines；24.Positive control.a.The image of HEK 293T cell clones with green fluorescence (10×20)；b.The image of HEK 293T cell clones with white light (10×20)；c.The results of PCR of the genomic DNA of monoclonal cell lines with the PRLR gene verificating primer；d.The results of PCR of the genomic DNA of monoclonal cell lines with the luciferase gene verificating primer圖2　轉(zhuǎn)基因細(xì)胞鑒定Fig.2　The schematic diagram of identification of transgenic cell

M.DL500 DNA marker；1～3.0 ng·mL-1PRL時(shí)β-actin、PRLR和Luc表達(dá)；4～6.30 ng·mL-1PRL時(shí)β-actin、PRLR和Luc表達(dá)；7～9.60 ng·mL-1PRL時(shí)β-actin、PRLR和Luc表達(dá)。a.普通PCR檢測(cè)鵝PRLR和Luc的表達(dá)電泳圖；b.Luc相對(duì)表達(dá)量隨PRL濃度變化圖M.DL500 DNA marker；1-3.The expression of β-actin，PRLR and Luc when the PRL is 0 ng·mL-1；4-6.The expression of β-actin，PRLR and Luc when the PRL is 30 ng·mL-1；7-9.The expression of β-actin，PRLR and Luc when the PRL is 60 ng·mL-1.a.The electrophoresis chart of expression of luciferase and PRLR detected by common PCR；b.The graph of relative expression of Luc with the change of PRL concentration圖3　轉(zhuǎn)基因細(xì)胞Luc基因的表達(dá)檢測(cè)Fig.3　The expression detection of luciferase gene in the transgenic cell

圖4　Luc相對(duì)活性隨PRL濃度變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4　The standard curve of relative activity of Luc with PRL concentration

PRL分子含有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，PRL分子的結(jié)合位點(diǎn)1先與細(xì)胞表面受體的ECD結(jié)合后形成激素受體二聚體，激素受體二聚體的形成是結(jié)合位點(diǎn)2與第2個(gè)PRLR ECD結(jié)合的先決條件，最后形成一個(gè)激素結(jié)合兩個(gè)受體分子的三聚體，三聚體激活受體胞內(nèi)域的JAK2的活化，活化的JAK2募集并磷酸化STAT5 的特異性酪氨酸殘基，隨即磷酸化的STAT5形成二聚體，然后通過(guò)核孔進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，結(jié)合到靶基因啟動(dòng)子的特異性的γ-干擾素激活位點(diǎn)序列(GAS)(TTCNNNGAA)并啟動(dòng)靶基因的轉(zhuǎn)錄[17]。

基于上述的PRL信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，開發(fā)成一種新型高靈敏度的檢測(cè)鵝及禽類PRL生物活性的方法。目前有一些蛋白生物活性檢測(cè)方法也是應(yīng)用JAK-STAT途徑產(chǎn)生并傳導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，可準(zhǔn)確快速測(cè)定蛋白生物活性，特別是測(cè)定瘦素(Leptin)生物活性[18-22]。本試驗(yàn)首先克隆全長(zhǎng)為2 498 bp的鵝PRL受體基因，將其插入真核表達(dá)載體pCMV6-Entry中，作為信號(hào)接受系統(tǒng)。然后根據(jù)GAS序列，人工合成STAT5的結(jié)合序列，為了提高應(yīng)答效率，將STAT5序列連續(xù)重復(fù)5次后合成，并插入含有螢火蟲熒光素酶基因的pGL3-Enchancer中，作為信號(hào)應(yīng)答系統(tǒng)。STAT5廣泛存在于各個(gè)組織和細(xì)胞中[17]，故利用HEK293T細(xì)胞作為宿主構(gòu)建檢測(cè)模型。HEK293T 細(xì)胞自身含有Neo抗性基因，本研究選擇含有EGFP標(biāo)記基因和嘌呤霉素抗性基因的pEZX-MR03質(zhì)粒與所構(gòu)建的載體進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，利用EGFP和嘌呤霉素篩選轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株。篩選出的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞經(jīng)PRL刺激后，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定Luc基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本試驗(yàn)構(gòu)建的測(cè)定方法確實(shí)使Luc基因的相對(duì)表達(dá)量隨PRL濃度上升明顯上調(diào)，而對(duì)照組熒光素酶活性隨PRL濃度上升幾乎無(wú)變化，證明基于PRLR-JAK-STAT5信號(hào)傳導(dǎo)構(gòu)建的檢測(cè)系統(tǒng)能夠用于靈敏的反映鵝PRL濃度變化。在目前試驗(yàn)的測(cè)定范圍，熒光素酶相對(duì)活性隨PRL濃度變化呈現(xiàn)線性相關(guān)的趨勢(shì)，證明該檢測(cè)系統(tǒng)能夠用于定量的檢測(cè)鵝PRL濃度水平，并且本系統(tǒng)檢測(cè)的是具有生物活性的PRL蛋白，能夠真實(shí)反映鵝體內(nèi)PRL有效蛋白濃度。本檢測(cè)系統(tǒng)在加入PRL 6 h后即可直接檢測(cè)激素生物活性水平，與目前檢測(cè)禽類PRL采用的放免法相比，節(jié)省了測(cè)定的前處理過(guò)程，更加快速，也更加安全環(huán)保。將進(jìn)一步摸索擴(kuò)大本測(cè)定方法的測(cè)定范圍，完善測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)一步改進(jìn)和改良測(cè)定方法，為實(shí)際的科研應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

4結(jié)論

本研究建立了測(cè)定鵝血清中催乳素濃度的蛋白生物活性檢測(cè)方法，并篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染成功的單克隆細(xì)胞株，為鵝PRL準(zhǔn)確測(cè)定奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為其他蛋白激素的測(cè)定提供參考。

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(編輯程金華)

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.07.011

收稿日期：2016-01-07

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31372314)；江蘇省自然科學(xué)基金(BK20130718)

作者簡(jiǎn)介：宋金委(1989-)，女，滿族，河北青縣人，碩士生，主要從事禽類品種改良和繁育研究，E-mail:915352256@qq.com *通信作者：王振勇，博士，副教授，E-mail: wzy@sdau.edu.cn

中圖分類號(hào)：S835.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)07-1389-07

A Novel Method of Detecting Goose Prolactin Based on PRLR-JAK-STAT5 Signal Transduction Pathway

SONG Jin-wei1，LI Hui2，CHEN Zhe2，SHI Zhen-dan2，WANG Zhen-yong1*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，ShandongAgriculturalUniversity，Tai’an271018，China；2.InstituteofAnimalScience，JiangsuAcademyofAgriculturalSciences，Nanjing210014，China)

Abstract:In order to develop a high sensitive method of detecting goose prolactin，luciferase detecting system based on PRLR-JAK-STAT5 signal transduction pathway was designed in the present study.Firstly the CDS region of goose PRLR gene was cloned，the signal transducer and activator of transcription 5(STAT5) was artificially synthesized and inserted into the eukaryotic expression vector pCMV6-Entry and luciferase reporter pGL3-Enhancer plasmid as signal receiver vector and signal responder vector respectively.Secondly，the two recombinant vectors along with puromycin screening vector pEZX-MR03 and internal control pRL-TK vector were transfected into HEK293T cells.After puromycin screening，stable transgenic cell lines were isolated and stimulated by a serial of different concentrations of chicken PRL (0，30，60，90 ng·mL-1).Finally the mRNA relative expression level and enzyme activity of luciferase enzyme were detected by qRT-PCR and dual-luciferase detection system.Results showed that 10 stable transgene cell lines carried the 4 vectors were isolated.After treated with different concentrations of chicken PRL，luciferase gene mRNA expression level was up regulated and luciferase enzyme activity also enhanced in dose dependent manner in one of these 10 cell lines.These results demonstrated that it was feasible of detecting PRL bioactivity using the constructed PRLR-JAK-STAT5 signal transduction system and could be further used in measuring poultry PRL concentrations.

Key words:goose prolactin receptor；signal transduction；signal transducer and activator of transcription 5；luciferase reporter gene；prolactin bioactivity