高通量測序分析20株禽流感病毒全基因

王楷宬，莊青葉，張笑春，邱　源，王　通，侯廣宇，劉　朔，王素春

(中國動物衛生與流行病學中心，青島 266032)

?

高通量測序分析20株禽流感病毒全基因

王楷宬*，莊青葉，張笑春，邱源，王通，侯廣宇，劉朔，王素春

(中國動物衛生與流行病學中心，青島 266032)

摘要：為探索使用高通量測序測定和分析禽流感病毒全基因的方法，使用Ion Torrent PGM測序儀對20株自華東地區分離的禽流感病毒進行全基因測序，分析該方法的優缺點，以及此20株病毒的基因組特性和進化特征。結果顯示，應用Ion Torrent PGM測序儀能夠測出全部20株病毒的全基因，確定其均為H9亞型h9.4.2.5分支的低致病性毒株，NA基因均為N2亞型，并分析了其6個內部基因分子演化關系。說明高通量測序可用于禽流感病毒全基因分析。

關鍵詞：高通量測序；禽流感；全基因；分子演化

禽流行性感冒病毒(avian influenza virus，AIV)簡稱禽流感病毒，屬于正黏病毒科、甲型流感病毒屬。甲型流感病毒粒子表面有血凝素(hemagglutinin，HA)和神經氨酸酶(neuraminidase，NA)兩種表面結構蛋白，根據HA和NA的抗原性差異可分別將其分為18種H亞型(H1～H18)和11種N亞型(N1～N11)[1-3]。AIV在家禽和水禽中廣泛存在，引起禽類的全身性或呼吸系統性疾病[4]。雞、火雞、鴨和鵪鶉等家禽及野鳥均可感染，且發病情況不一，有的急性死亡，有的感染后無明顯癥狀。

AIV是單股負鏈RNA病毒，其基因組由8個單股負鏈RNA片段組成，每個基因在3′末端和5′末端都帶有12～13個保守核苷酸序列。這8個片段可編碼10種蛋白質，其中8種蛋白質(HA、NA、PB1、PB2、NP、M1、M2和PA)為結構蛋白，NS1和NS2為非結構蛋白，位于宿主細胞的細胞質中[5]。低保真RNA聚合酶可引起流感病毒的高突變率，以及基因重組，均可使流感病毒呈現分子多樣性，使每個病毒亞型可進化為多個分支[6]。通常一個堿基對的突變，就可引起病毒對宿主感染能力的改變，造成對抗流感藥物的抗性[7]。

由于AIV的突變率高，并易發生重組，監測其進化趨勢和流行態勢尤為重要。AIV所有節段的變化均可通過高通量測序方法進行檢測。目前，研究人員已建立了在一個RT-PCR反應中使用一對通用引物擴增甲型流感病毒所有8個基因節段的方法，這使得AIV全基因組的測序更為簡單[8]。傳統的一代測序雖然經濟高效，但僅能測定特異性擴增的某一片段，且不能測定準種[9]。隨著高通量測序技術的發展，一些測序儀平臺已能夠進行甲型流感病毒全基因組的序列測定與分析，通過一次擴增AIV所有8個節段的RT-PCR反應，能夠消除臨床樣品中來自宿主和環境中核酸的干擾，這使得利用高通量測序進行病毒核酸序列分析更為高效經濟。另外，在文庫構建過程中，可以給每份樣品加入不同的索引標簽，在同一個測序反應中就可以對數十甚至上千AIV的全基因進行測序，其經濟性更為明顯。

作者使用Ion Torrent PGM測序平臺對未知亞型的AIV臨床分離株進行全基因組測序，并分析其亞型和各節段基因序列的分子進化關系，為高通量測序技術用于AIV的大規模測序與分析奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料和儀器

PathAmp FluA Reagent Kit、Ion Xpress Plus Fragment Library Kit、Ion PGM Template OT2 200 Kit、Ion PGM Sequencing 200 Kit V2、E-Gel SizeSelect 2% Agarose、Ion 318 Chip Kit V2、 Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Beads、Ion Xpress Barcode Aaptors、Qubit核酸濃度測定儀及配套試劑均購自Life technologies公司；QIAxtractor 高通量核酸提取儀及配套試劑盒(cador?Pathogen 96 QIAcube?HT kit)；QIAgility 全自動體系構建系統及QIAxcel 全自動實時毛細管電泳儀及配套試劑盒(德國QIAGEN)；超凈工作臺(美國Forma Scientific)；移液器(Eppendorf)；孵化器(德州誠信孵化設備有限公司)；高速臺式離心機(德國Heraeus Biofuge primoR)；PCR擴增儀(Perkin Elmeter Gen Amp PCR System 9600)。

1.2毒株

20株禽流感病毒由中國動物衛生與流行病學中心禽病監測室保存，2014年7月分離自華東地區活禽交易市場的拭子樣品和糞便樣品，均按農業行業標準(NY/ T 772-2013)的特異性M基因引物檢測為禽流感病毒，但未確定亞型。毒株名稱見表1。

1.3RNA提取

按照說明書操作，使用QIAxtractor高通量核酸提取儀(德國QIAGEN)及其配套試劑盒(Cador?Pathogen 96 QIAcube?HT kit)，提取病毒RNA。

1.4流感病毒全基因擴增

應用PathAmp FluA Reagent Kit對病毒 RNA進行反轉錄，并擴增生成全基因組cDNA。使用Qubit核酸濃度測定儀及配套試劑測定DNA濃度。

1.5文庫構建

純化后的AIV全基因cDNA均稀釋成35 μL中含有200 ng DNA的溶液，使用Ion Xpress Plus Fragment Library Kit將病毒全基因組DNA打斷為200 bp的片段，并分別加入含有Barcode的接頭，構建為PGM測序儀可以識別的DNA文庫。

1.6測序

將20個DNA文庫分別稀釋為26 pmol·L-1，并等量混合。應用Ion PGM Template OT2 200 Kit對混合的DNA文庫進行測序前的樣品處理。處理后的樣品加樣至Ion 318 芯片，置于PGM測序儀進行測序。測序序列經PGM自帶的FluAnalysis(v4.0)軟件進行序列拼接和亞型分析。

1.7分析與毒力或宿主嗜性相關的關鍵位點

使用Lasergene軟件將20株病毒的HA基因翻譯為蛋白質序列，分析HA蛋白的裂解位點(第333—341位氨基酸)序列[10]，分析NS蛋白中結合CPSF的特異性殘基是否為GLEWN[11]。

1.8分子進化分析

利用NCBI的Influenza Virus Resource數據庫，搜索并下載1966—2014年其收錄的來自中國的H9亞型AIV的全基因序列，HA基因與136株從NCBI 流感數據庫下載的序列進行比對與進化分析，NA基因與86株從NCBI 流感數據庫下載的序列進行比對與進化分析。在分析本論文所用20株分離株的6個內部基因時，除添加從NCBI 流感數據庫下載的86株序列，另添加經Blast比對與該基因同源性較高的幾個毒株(H7、H10、H9N9以及mixed亞型)的序列，分別與測序得到的序列一起進行在線Alignment初步對比，用MUSCLE方法進行對齊運算[12-13]。利用MEGA6.0生物信息學軟件，應用Bayesian反饋信息準則(Bayesian Information Criterion，BIC)的替代模式和系統評分，構建進化樹。通過Find Best DNA/Protein Model運算方法，計算得出構建進化樹的最佳運算模型，利用Construct/Test Maximum Likelihood Tree運算模型，運算Bootstrap值為1 000，繪制系統進化樹。譜系按照WHO/OIE/FAO聯合發布的方法進行劃分和命名[14]。

表1　毒株名稱、亞型、宿主與序列數量

2結果

2.1測序質量

測序數據已上傳至GenBank，登錄號為SRR2083856。測序共產生7 950 401個reads，去除接頭序列和低質量序列后，4 171 523個reads含有1～20 barcode中的一個，其中3 157 806個reads正確匹配到甲型流感病毒的序列上，涵蓋了所有20個AIV毒株的所有節段。每個AIV毒株各節段的測序reads數量見表1。

2.2測序深度

AIV毒株每個節段的平均測序深度見表2。包括各節段的5′和3′端序列，所有的節段至少平均被測372次(PB1基因)。M基因的平均測序深度最大，為2 449.9。

2.3與毒力或宿主嗜性相關的關鍵位點

所有20株AIV的HA蛋白的裂解位點(第333—341位氨基酸)序列均為PSRSSR↓GLF，為低致病性毒株[10]。NS1 蛋白能結合CPSF，其結合CPSF的特異性殘基為GLEWN。分析發現，所測20個分離株特異性殘基中的L均突變為F，即GLEWN 突變為GFEWN，或可導致這些毒株致病力增強[11]。

表2　毒株各節段的測序深度

2.4AIV全基因分子進化分析

20株分離株的8個節段的序列均登錄GenBank，登錄號：KT449572～KT449591(HA)，KT449612～KT449631(NA)，KT449592～KT449611(M)，KT449632～KT449651(NP)，KT449652～KT449671(NS)，KT449672～KT449691(PA)，KT449692～KT449711(PB1)，KT449712～KT449731(PB2)。8個節段序列的分子進化分析結果見圖1～3。

HA基因分析表明，此20株禽流感病毒均屬于h9.4.2.5分支(代表株為A/chicken/Guangxi/55/2005)，為我國近年來的優勢流行分支。NA基因分析表明，此20株分離株均屬于H9N2亞型毒株所在的分支。6個內部基因分子演化分析表明，作者所分離的20株毒株中有12株AIV病毒和H9N2亞型毒株親緣關系更近；4株毒株的6個內部基因均和H7N9亞型毒株親緣關系更近；2株毒株分別有4個基因和H7N9亞型毒株親緣關系更近，1株毒株有4個基因和H10N8亞型毒株親緣關系更近，1株毒株有2個基因和H10N8亞型毒株親緣關系更近，其余內部基因的序列均與H9N2亞型病毒的親緣關系較近。

■.h9.4.2.4分支的代表毒株；●. h9.4.2.5分支的代表毒株；◆. h9.4.2.6分支的代表毒株；▲.所測20株分離株■. h9.4.2.4 clade representative virus；●. h9.4.2.5 clade representative virus；◆. h9.4.2.6 clade representative virus；▲. The 20 virus sequenced in the study圖1　HA基因分子進化樹Fig.1　Phylogenetic tree of HA gene

▲.所測20株分離株▲. The 20 virus sequenced in the study圖2　NA基因分子進化樹Fig.2　Phylogenetic tree of NA gene

▲.所測20株分離株；◇.H7N9亞型禽流感病毒毒株；○.H9N9亞型禽流感病毒毒株；△.H10N8亞型禽流感病毒毒株；□.Mixed亞型禽流感病毒毒株▲. 20 virus sequenced in the study; ◇. H7N9 AIV;○. H9N9 AIV; △. H10N8 AIV; □. Mixed subtype AIV圖3　M、NP、NS、PA、PB1和PB2基因分子進化樹Fig.3　Phylogenetic tree of M, NP, NS, PA, PB1 and PB2 genes

3討論

AIV是單股負鏈分節段的RNA病毒，其基因組復制時，具有RNA病毒特有的核酸堿基易變性，即抗原漂移(antigen drift)。不同的AIV同時感染同一細胞時，兩個病毒的基因節段相互間還會發生基因重排，引起抗原轉變(antigen shift)。所以，在自然界中每隔一定的時間，就會產生新的流感毒株引發流行。因而，測定AIV的全基因，掌握AIV的變異趨勢，對于防控AIV尤為重要。

傳統方法獲取流感病毒全基因，是以每個節段的特異性引物分別擴增8個基因片段進行克隆，選擇陽性克隆進行Sanger測序，然后進行序列拼接得到病毒基因組，該方法操作比較繁瑣，既費時又費力。自高通量測序儀問世以來，高通量測序技術迅速發展，通量和讀長都得到改善，具有標準化的文庫構建流程，不需要常規實驗中的細菌轉化、培養以及單克隆挑選等，且短時間內可以獲得大量有效的數據，能夠快速獲取病原體的遺傳信息。Ion Torrent 高通量測序技術基于半導體技術，具有簡單、快速、準確、靈活和低成本等顯著優勢，是中等規模測序項目的最佳選擇，2012年A.S.Bowman等[15]利用Ion Torrent PGM高通量測序儀分析了H3N2亞型流感病毒的基因組。多項研究都對高通量測序用于禽流感病毒全基因的測序效果進行評價[16-17]，證實該技術對AIV基因組的測序準確、快速，并能對AIV的遺傳進化進行分析。

本文中作者采用Ion Torrent PGM高通量測序儀完成了20株AIV毒株的全基因測序，確定其均為H9亞型h9.4.2.5分支的低致病性毒株，NA基因均為N2亞型。結果顯示，所采用的建庫與測序方法能夠測定流感病毒的全基因，并且測序深度較大，能滿足序列分析的需要。

HA基因分子演化分析顯示，所分離的20株毒株所在的h9.4.2.5分支，大部分均為我國2008年以后所分離的毒株。從毒株數量、時間和地理分布來看，在三級分支上，2007年以后第h9.4.2.5分支是中國H9亞型流感病毒的主要流行分支，這與尚飛雪等的結論一致[18]。本試驗中有4株H9N2亞型毒株的6個基因均和H7N9亞型親緣關系更近，2株H9N2亞型毒株分別有4個基因和H7N9亞型親緣關系更近，推測某些H9N2亞型流感病毒的6個內部基因經過重配后，可能組成新的甲型H7N9流感病毒[19]；還有1株H9N2亞型毒株的4個基因和H10N8亞型親緣關系更近，1株H9N2亞型毒株的2個基因和H10N8亞型親緣關系更近，與H.Chen等和H.Zhang等的觀點一致，推測H9N2亞型流感病毒的某些內部基因經過重配后，可能會組成新的H10N8亞型流感病毒[20-21]。該方法的建立將進一步改善流感病毒基因組的測序方法，使該項工作的開展更為簡便、快速、高效，更適用于分子流行病學調查中大量樣品的測序分析，以及突發疫情的診斷與處置。

參考文獻(References)：

[1]FREIDL G S，BINGER T，MüLLER M A，et al.Serological evidence of influenza A viruses in frugivorous bats from Africa [J].PLoSOne，2015，10(5)：e0127035.

[2]TONG S，LI Y，RIVAILLER P，et al.A distinct lineage of influenza A virus from bats [J].ProcNatlAcadSciUSA，2012，109(11)：4269-4274.

[3]TONG S，ZHU X，LI Y，et al.New world bats harbor diverse influenza A viruses [J].PLoSPathog，2013，9(10)：e1003657.

[4]YOON S W，WEBBY R J，WEBSTER R G.Evolution and ecology of influenza A viruses [J].CurrTopMicrobiolImmunol，2014，385：359-375.

[5]HOFFMANN E，STECH J，GUAN Y，et al.Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses [J].ArchVirol，2001，146(12)：2275-2289.

[6]GHEDIN E，SENGAMALAY N A，SHUMWAY M，et al.Large-scale sequencing of human influenza reveals the dynamic nature of viral genome evolution [J].Nature，2005，437(7062)：1162-1166.

[7]WANG M Z，TAI C Y，MENDEL D B.Mechanism by which mutations at his274 alter sensitivity of influenza a virus n1 neuraminidase to oseltamivir carboxylate and zanamivir [J].AntimicrobAgentsChemother，2002，46(12)：3809-3816.

[8]ZHOU B，DONNELLY M E，SCHOLES D T，et al.Single-reaction genomic amplification accelerates sequencing and vaccine production for classical and Swine origin human influenza a viruses [J].JVirol，2009，83(19)：10309-10313.

[9]DOMINGO E，BARANOWSKI E，RUIZ-JARABO C M，et al.Quasispecies structure and persistence of RNA viruses [J].EmergInfectDis，1998，4(4)：521-527.

[10]CHEN R A，LAI H Z，LI L，et al.Genetic variation and phylogenetic analysis of hemagglutinin genes of H9 avian influenza viruses isolated in China during 2010-2012 [J].VetMicrobiol，2013，165(3-4)：312-318.

[11]李建麗，陳恩林，李和平，等.H9N2亞型禽流感病毒NS1基因的進化分析[J].病毒學報，2008，24(3)：220-226.

LI J L，CHEN E L，LI H P，et al.Genetic analysis of the nonstructural gene(NS1) of H9N2 avian influenza viruses isolated in China[J].ChineseJournalofVirology，2008，24(3)：220-226.(in Chinese)

[12]EDGAR R C.MUSCLE：multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput [J].NucleicAcidsRes，2004，32(5)：1792-1797.

[13]LIU S，JI K，CHEN J M，et al.Panorama phylogenetic diversity and distribution of Type A influenza virus [J].PLoSOne，2009，4(3)：e5022.

[14]WHO/OIE/FAO H5N1 Evolution Working Group.Toward a unified nomenclature system for highly pathogenic avian influenza virus (H5N1) [J].EmergInfectDis，2008，14(7)：e1.

[15]BOWMAN A S，SREEVATSAN S，KILLIAN M L，et al.Molecular evidence for interspecies transmission of H3N2pM/H3N2v influenza A viruses at an Ohio agricultural fair，July 2012 [J].EmergMicrobesInfect，2012，1(10)：e33.

[16]BIDZHIEVA B，ZAGORODNYAYA T，KARAGIANNIS K，et al.Deep sequencing approach for genetic stability evaluation of influenza A viruses [J].JVirolMethods，2014，199：68-75.

[17]VAN DEN HOECKE S，VERHELST J，VUYLSTEKE M，et al.Analysis of the genetic diversity of influenza A viruses using next-generation DNA sequencing [J].BMCGenomics，2015，16：79.

[18]尚飛雪，劉朔，蔣文明，等.近年來中國H9亞型禽流感分離株譜系分析[J].中國動物檢疫，2012，29(4)：51-53.

SHANG F X，LIU S，JIANG W M，et al.Phylogenetic analysis of H9 subtype avian influenza viruses isolated from China in recent years [J].ChinaAnimalHealthInspection，2012，29(4)：51-53.(in Chinese)

[19]劉春艷，艾軍紅.甲型H7N9禽流感病毒的病毒學特征 [J].中國當代兒科雜志，2013，15(6)：405-408.

LIU C Y，AI J H.Virological characteristics of avian influenza A H7N9 virus [J].ChineseJournalofContemporaryPediatrics，2013，15(6)：405-408.(in Chinese)

[20]CHEN H，YUAN H，GAO R，et al.Clinical and epidemiological characteristics of a fatal case of avian influenza A H10N8 virus infection：a descriptive study [J].Lancet，2014，383(9918)：714-721.

[21]ZHANG H，XU B，CHEN Q，et al.Characterization of an H10N8 influenza virus isolated from Dongting lake wetland [J].VirolJ，2011，8：42.

(編輯白永平)

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.07.018

收稿日期：2015-10-30

基金項目：中國動物衛生與流行病學中心創新基金(2015IF-0004FF)

作者簡介：王楷宬(1981-)，女，山東青島人，副研究員，主要從事動物病原學研究 *通信作者：王楷宬， E-mail：wangkaicheng@cahec.cn

中圖分類號：S852.659.5

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)07-1443-08

Genome Analysis of the 20 Avian Influenza Virus Strains by High-Throughput Sequencing

WANG Kai-cheng*，ZHUANG Qing-ye，ZHANG Xiao-chun，QIU Yuan，WANG Tong，HOU Guang-yu，LIU Shuo，WANG Su-chun

(ChinaAnimalHealthandEpidemiologyCenter，Qingdao266032，China)

Abstract:To discuss the sequencing and analysis of avian influenza virus (AIV) genome by high-throughput sequencing，genomes of the 20 AIV strains isolated from eastern China were sequenced by Ion Torrent PGM.The advantage and disadvantage of the method were evaluated.The characteristic of genome and evolution were analyzed.The molecular evolution relationships of the other 6 internal genes were also analyzed.The results showed that the whole genomes of all the 20 strains were completely sequenced by Ion Torrent PGM.All the 20 viruses are restricted to h9.4.2.5 clade of H9 subtype low pathogenic strains.NA genes of all the viruses are N2 subtype.High-throughput sequencing can be used in the genome analysis of AIV strains.

Key words:high-throughput sequencing；avian influenza；genome；molecular evolution