禽呼腸孤病毒σA和σNS蛋白激活PI3K/Akt信號通路的研究

謝麗基，謝芝勛，黃　莉，鄧顯文，謝志勤，范　晴，羅思思，黃嬌玲，曾婷婷

(廣西壯族自治區獸醫研究所 廣西動物疫病病原生物學與診斷重點實驗室，南寧 530001)

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禽呼腸孤病毒σA和σNS蛋白激活PI3K/Akt信號通路的研究

謝麗基，謝芝勛*，黃莉，鄧顯文，謝志勤，范晴，羅思思，黃嬌玲，曾婷婷

(廣西壯族自治區獸醫研究所 廣西動物疫病病原生物學與診斷重點實驗室，南寧 530001)

摘要：旨在探討禽呼腸孤病毒(ARV)的σA和σNS蛋白是否是通過PXXP或YXXXM基序來激活PI3K/Akt信號通路的。作者采用重疊延伸PCR的方法，將σA和σNS基因的PXXP或YXXXM基序進行突變后構建了重組質粒，并在Vero細胞中進行了表達。通過流式細胞術和Western blot，檢測轉染后Vero細胞磷酸化Akt(P-Akt)的表達量，并與野生型σA和σNS蛋白激活的P-Akt表達量進行比較。結果顯示，σA和σNS基因均得到了表達，σA基因的110—114和114—117位的PXXP基序突變后，Vero 細胞P-Akt 的表達量明顯下降。可見，ARV的σA蛋白，是通過PXXP基序來激活PI3K/Akt信號通路的。本研究從細胞信號轉導角度揭示了ARV與宿主相互作用的機制，也為尋找抗ARV藥物作用靶標提供了新的思路。

關鍵詞：禽呼腸孤病毒；PI3K/Akt信號通路；σA蛋白；PXXP基序

禽呼腸孤病毒(avian reovirus，ARV)主要引起雞出現跛行、免疫抑制和總體生產性能下降(增重減少、飼料轉化率低)，嚴重降低雞的經濟價值，成為危害養雞業健康發展的重要傳染病之一[1-3]。P.Y.Lin等[4]使用ARV感染Vero細胞后，通過Western blot檢測磷酸化Akt(P-Akt)的表達量，從病毒的角度證實了ARV感染的早期激活了PI3K/Akt信號通路，但并未找到是ARV的哪個蛋白質激活PI3K/Akt信號通路。本課題組的前期研究工作發現，在Vero細胞中表達ARV的σA蛋白和σNS蛋白后，激活了PI3K/Akt信號通路[5]，從病毒蛋白質的角度證實了ARV激活了PI3K/Akt信號通路。

PI3K/Akt信號通路可調節多種細胞功能，如細胞增殖和分化、抑制細胞凋亡等，病毒感染通常會干擾這個信號通路[6]。研究表明，病毒蛋白和細胞蛋白等通過PXXP或YXXXM/YXXM基序，與PI3K的P85調節亞基結合，從而激活PI3K/Akt信號通路，使P-Akt的表達量升高，實現抑制細胞凋亡的發生[7-10]。

分析ARV的σA蛋白和σNS蛋白的氨基酸序列發現，這兩種蛋白質存在PXXP和YXXXM基序，均沒有YXXM基序。目前還不清楚ARV的σA蛋白和σNS蛋白是否也是通過PXXP和YXXXM基序來激活PI3K/Akt信號通路，使P-Akt表達量升高，實現抑制細胞凋亡的發生。因此作者通過重疊延伸PCR的方法，將σA和σNS基因的PXXP或YXXXM基序進行突變并構建重組質粒，在Vero細胞中分別表達σA和σNS蛋白的野生型和突變型后，通過流式細胞術和Western blot檢測P-Akt的表達量，分析P-Akt表達量的差異，旨在探討σA和σNS蛋白是否是通過PXXP或YXXXM基序來激活PI3K/Akt信號通路，從細胞信號轉導角度揭示ARV的致病機制，為尋找抗ARV藥物作用靶標提供了新的思路。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1毒株、質粒和細胞禽呼腸孤病毒S1133標準強毒株(ARV-S1133)購自中國獸醫藥品監察所；真核表達載體pcAGEN由美國南達科他州大學Xiuqing Wang 教授惠贈；σA-pcAGEN、σNS-pcAGEN和Vero細胞由本實驗室保存。

1.1.2試劑及儀器PCR Mix、pMD18-T載體、限制性內切酶(XhoⅠ與NotⅠ)和T4連接酶購自寶生物工程 (大連) 有限公司；膠回收試劑盒、無內毒素質粒大量提取試劑盒購自北京TransGen Biotech公司；Lipofectamin3000購自Invitrogen公司；Alexa fluor 488標記的羊抗雞IgY、Alexa fluor 488標記的羊抗兔IgG、HRP標記的羊抗雞IgY 和 HRP標記的羊抗兔IgG購自Abcam公司；β-actin 兔單克隆抗體、Akt兔單克隆抗體和Phospho-Akt 兔單克隆抗體購自CST公司；DMEM培養基購自GIBCO公司；胎牛血清購自Hyclone公司；Cytofix固定/破膜試劑盒購自BD公司；ARV陽性血清由本實驗室保存。貝克曼Navios 流式細胞儀；Invitrogen IblotTM干式Western blotting轉印儀；BioRad成像系統。

1.2方法

1.2.1引物的設計與合成根據ARV的σA和σNS的基因序列，設計了9對引物(表1)用于σA和σNS基因的突變，表中序列大寫堿基標記處為突變堿基。擴增全長σA基因(1 248 bp)的引物為σA-F：5′-gatgatctcgaggccaccatggcgcgtgccatatacgac-3′和σA-R：5′-atcgcggccgcttaggcggtaaaagtggctagaac-3′，擴增全長σNS基因(1 101 bp)的引物為σNS-F：5′-gatgatctcgaggccaccatggacaacaccgtgcgtgtt-3′和σNS-R：5′-`atcgcggccgcttacgccatcctagctggagagac-3′，斜體標記為酶切位點(XhoⅠ與NotⅠ)，下劃線處為Kozak序列。

1.2.2σA和σNS突變基因的擴增σA-M1(σA的突變基因1)的擴增程序如下：第一次PCR擴增，引物為σA-F + σA-M1-R，模板為質粒σA-pcAGEN，切膠回收PCR產物。第二次PCR擴增，引物為σA-M1-F + σA-R，模板為質粒σA-pcAGEN，切膠回收PCR產物。第三次PCR擴增，引物為σA-F + σA-R，模板為第一次PCR和第二次PCR的膠回收產物(各1 μL)，得到的PCR產物為σA-M1，切膠回收。

用相同方法擴增其他突變基因σA-M2、σA-M3、σA-M4、σA-M5、σA-M6、σNS-M1、σNS-M2和σNS-M3。

1.2.3與pMD18-T載體的連接及轉化將第三次PCR的膠回收產物與pMD18-T于16 ℃連接過夜，轉化到DH5a感受態細胞中，經PCR鑒定，獲得的陽性質粒分別命名為σA-M1-pMD18T、σA-M2-pMD18T、σA-M3-pMD18T、σA-M4-pMD18T、σA-M5-pMD18T、σA-M6-pMD18T、σNS-M1-pMD18T、σNS-M2-pMD18T和σNS-M3-pMD18T。

表1　引物序列及突變情況

1.2.4重組質粒的構建使用質粒提取試劑盒提取質粒。將真核表達載體pcAGEN質粒和含有目的基因的pMD18-T質粒分別用XhoⅠ和NotⅠ進行雙酶切，切膠回收，使用T4連接酶連接過夜，轉化到DH5α感受態細胞中，PCR鑒定重組菌。陽性克隆分別命名為σA-M1-pcAGEN、σA-M2-pcAGEN、σA-M3-pcAGEN、σA-M4-pcAGEN、σA-M5-pcAGEN、σA-M6-pcAGEN、σNS-M1-pcAGEN、σNS-M2-pcAGEN和σNS-M3-pcAGEN。陽性重組質粒送英濰捷基(上海)貿易有限公司進行測序。

1.2.5轉染細胞參照無內毒素質粒大量提取試劑盒說明書大量提取質粒(pcAGEN、σA-pcAGEN、σA-M1-pcAGEN、σA-M2-pcAGEN、σA-M3-pcAGEN、σA-M4-pcAGEN、σA-M5-pcAGEN、σA-M6-pcAGEN、σNS-pcAGEN、σNS-M1-pcAGEN、σNS-M2-pcAGEN和σNS-M3-pcAGEN)，-20 ℃保存備用。

參照脂質體轉染試劑盒LipofectamineTM3000的使用說明，將質粒分別轉染長成單層的Vero細胞(6孔板)，同時設立陰性細胞組(未轉染質粒)。

1.2.6間接免疫熒光和Western blot檢測σA和σNS的表達轉染Vero 細胞4 h后，用PBST洗滌三次，用置于-20 ℃保存的冷丙酮(丙酮∶乙醇=2∶3)進行固定，500 μL·孔-1，室溫作用10 min。用PBST洗滌三次，加入1∶100倍稀釋的ARV陽性血清200 μL·孔-1，37 ℃作用l h。用PBST洗滌三次，加入1∶500稀釋的Alexa fluor 488標記的羊抗雞IgY，200 μL·孔-1，37 ℃作用l h。用PBST洗滌三次，加甘油緩沖液(甘油∶PBS=1∶1)100 μL·孔-1。倒置熒光顯微鏡下觀察。

同時，收集轉染后的Vero細胞，參照參考文獻[11]的方法，使用ARV陽性血清和HRP標記的羊抗雞IgY對目的蛋白σA和σNS進行Western blot檢測。

1.2.7流式細胞術和Western blot檢測P-Akt的表達轉染Vero細胞4 h后，用Cytofix固定/破膜試劑盒固定細胞20 min，FACS洗滌2次，加入1∶100稀釋的Phospho-Akt 兔單克隆抗體作用30 min，FACS洗滌2次，加入1∶500稀釋的Alexa fluor 488標記的羊抗兔IgG 作用30 min，FACS洗滌1次，加入300 μL FACS重懸浮細胞，上流氏細胞儀檢測P-Akt的表達量，記錄分析數據。

同時，收集轉染后的Vero細胞，參照參考文獻[12]的方法，使用HRP標記的羊抗兔IgG、β-actin兔單克隆抗體、Akt兔單克隆抗體和Phospho-Akt 兔單克隆抗體對Vero細胞中的β-actin、Akt和P-Akt進行Western blot檢測。

重復整個試驗3次。

2結果

2.1重組質粒的PCR鑒定及測序

重組質粒(σA-M1-pcAGEN、σA-M2-pcAGEN、σA-M3-pcAGEN、σA-M4-pcAGEN、σA-M5-pcAGEN、σA-M6-pcAGEN、σNS-M1-pcAGEN、σNS-M2-pcAGEN和σNS-M3-pcAGEN)的PCR鑒定結果見圖1，擴增的基因片段大小與預期大小相符。測序結果也證實了σA和σNS突變基因的正確性。

2.2重組質粒的體外瞬時表達

M.100 bp DNA ladder；1.σA-M1-pcAGEN；2.σA-M2-pcAGEN；3.σA-M3-pcAGEN；4.σA-M4-pcAGEN；5.σA-M5-pcAGEN；6.σA-M6-pcAGEN；7.σNS-M1-pcAGEN；8.σNS-M2-pcAGEN；9.σNS-M3-pcAGEN圖1　重組質粒的PCR鑒定Fig.1　 Identification of the recombinant plasmid by PCR

間接免疫熒光和Western blot檢測結果顯示，轉染σA-pcAGEN、σA-M1-pcAGEN、σA-M2-pcAGEN、σA-M3-pcAGEN、σA-M4-pcAGEN、σA-M5-pcAGEN、σA-M6-pcAGEN、σNS-pcAGEN、σNS-M1-pcAGEN、σNS-M2-pcAGEN和σNS-M3-pcAGEN后，目的蛋白σA和σNS均得到了較好的表達，而空載體pcAGEN組和陰性細胞組均為陰性。間接免疫熒光檢測結果見圖2，Western blot檢測結果見圖3。

A.Negative control；B.pcAGEN；C.σA-M1-pcAGEN；D.σA-M2-pcAGEN；E.σA-M3-pcAGEN；F.σA-M4-pcAGEN；G.σA-M5-pcAGEN；H.σA-M6-pcAGEN；I.σA-pcAGEN；J.σNS-M1-pcAGEN；K.σNS-M2-pcAGEN；L.σNS-M3-pcAGENA；M.σNS-pcAGENA圖2　 IFA檢測重組質粒轉染Vero細胞后的瞬時表達Fig.2　 IFA analysis of the expression of recombined plasmid on the transfected Vero cells

1.Negative control；2.pcAGEN；3.σNS-M1-pcAGEN；4.σNS-M2-pcAGEN；5.σNS-M3-pcAGENA；6.σNS- pcAGEN；7.σA-M1-pcAGEN；8.σA-M2-pcAGEN；9.σA-M3-pcAGEN；10.σA-M4-pcAGEN；11.σA-M5-pcAGEN；12.σA-M6-pcAGEN；13.σA-pcAGEN圖3　Western blot 檢測目的基因的表達Fig.3　Western blot analysis of the expression of the genes

2.3流式細胞術和Western blot檢測P-Akt表達

流式細胞術檢測P-Akt表達發現，轉染Vero細胞后，σA-M3-pcAGEN和σA-M4-pcAGEN組的P-Akt表達量均明顯低于σA-pcAGEN、σA-M1-pcAGEN、σA-M2-pcAGEN、σA-M5-pcAGEN和σA-M6-pcAGEN組，但與陰性細胞組和pcAGEN

空載體組差異不大(圖4和表2)。Western blot的檢測結果(圖5)與流式細胞術檢測結果相似。結果說明σA蛋白在110—114 (PPXXP→AAXXA)和114—117(PXXP→AXXA)位氨基酸突變后，影響了其使Vero細胞P-Akt表達明顯增加的作用。

流式細胞術檢測轉染σNS 突變體細胞中P-Akt的表達結果(圖略)顯示，轉染Vero細胞后，σNS-M1-pcAGEN、σNS-M2-pcAGEN和σNS-M3-pcAGEN組的P-Akt表達量與σNS-pcAGEN組比較差異不大，但明顯高于陰性細胞組和pcAGEN組。Western blot的檢測結果與流式細胞術檢測結果相似。結果說明σNS蛋白在159—162(PXXP→AXXA)、179—183(YXXXM→FXXXA)和333—336(PXXP→AXXA)位氨基酸突變后，并未明顯影響其使Vero細胞P-Akt表達明顯增加的作用。

重復3次的檢測結果一致。

A.Negative control；B.pcAGEN；C.σA-pcAGEN；D.σA-M1-pcAGEN；E.σA-M2-pcAGEN；F.σA-M3-pcAGEN；G.σA-M4-pcAGEN；H.σA-M5-pcAGEN；I.σA-M6-pcAGEN圖4　流式細胞術檢測P-Akt的表達Fig.4　 FCM analysis of the P-Akt expression levels

表2　FCM檢測P-Akt的表達水平

1.Negative control；2.pcAGEN；3.σA-pcAGEN；4.σA-M1-pcAGEN；5.σA-M2-pcAGEN；6.σA-M3-pcAGEN；7.σA-M4-pcAGEN；8.σA-M5-pcAGEN；9.σA-M6-pcAGEN圖5　Western blot 檢測P-Akt的表達Fig.5　Western blot analysis of the P-Akt expression levels

3討論

研究表明，當病毒侵入宿主細胞后，被感染的細胞能被宿主的免疫系統識別，并通過誘導細胞凋亡而對感染病毒的細胞加以清除，從而限制病毒在細胞內的復制及傳播[13-15]。但是在選擇壓力的作用下，許多病毒已經進化出某些可以逃避細胞凋亡的機制，使得病毒在宿主細胞死亡之前能完成其復制周期[9，13-15]，這些對抗措施通常是由病毒蛋白質來介導的。病毒蛋白質通過蛋白質—蛋白質的相互作用而調控細胞內信號分子的生物活性，進而激活相關信號通路，促進或抑制相關基因的轉錄表達，抑制感染細胞的凋亡，在病毒致病中發揮重要作用[16]。

真核細胞內存在多條信號通路，PI3K通路在眾多信號通路中發揮中心作用，可通過其主要下游效應分子Akt來調節多種細胞功能，如細胞增殖和分化、抑制細胞凋亡等。PI3K是由催化亞基p110和調節亞基p85所組成的二聚體蛋白，具有類脂激酶和蛋白激酶的雙重活性，調節亞基p85具有1個SH3結構域和2個SH2結構域[6，17]。許多病毒蛋白質和細胞蛋白質可通過PXXP基序與p85調節亞基的SH3結構域結合，或通過YXXXM/YXXM基序與P85調節亞基的SH2結構域結合，從而激活PI3K/Akt信號通路，使P-Akt的表達量升高，實現抑制細胞凋亡的發生[7-10]，其中，Y.K.Shin等[9]對甲型流感病NS1非結構蛋白的研究表明，NS1蛋白通過PXXP與p85的SH3結構域結合，并通過YXXXM位點與p85的SH2結構域結合，從而激活了PI3K/Akt信號途徑。

σA為ARV的結構蛋白，與ARV的抗干擾素效應有關，在ARV組裝過程中發揮重要作用[18]。σNS為ARV的非結構蛋白，在ARV的RNA復制方面發揮著重要作用[19]。本課題組的前期研究工作發現，ARV的σA蛋白和σNS蛋白可激活PI3K/Akt信號通路[5]。本研究對ARV σA和σNS蛋白的氨基酸序列進行分析發現，這兩個蛋白質均沒有YXXM基序，其中，σA蛋白有4個PXXP和2個YXXXM基序，σNS蛋白有2個PXXP和1個YXXXM基序。因此，作者采用重疊延伸PCR的方法，將σA和σNS基因的PXXP或YXXXM基序進行突變后構建了重組質粒，并在Vero細胞中進行表達。通過流式細胞術和Western blot，檢測轉染重組質粒后Vero細胞P-Akt的表達量，并與野生型蛋白激活的P-Akt表達量進行比較。通過流式細胞術和Western blot的蛋白質雙重檢測，保證了本研究結果的可靠性。研究結果顯示，ARV的σA蛋白在110—114 (PPXXP→AAXXA)和114—117(PXXP→AXXA)位氨基酸突變后，影響了其使Vero細胞P-Akt表達明顯增加的作用，使σA蛋白失去了激活PI3K/Akt信號通路的活性。σA蛋白是否與其他病毒一樣[7，9]，通過PXXP位點與p85的SH3結構域結合，從而激活了PI3K/Akt信號途徑，還有待于進一步的研究。

與許多病毒相似，PI3K/Akt信號轉導通路的激活與ARV的復制有密切關系[4]，因此，有望通過以ARVσA蛋白的PXXP基序作為新的藥物靶點來研發新的藥物，這個新的藥物通過拮抗ARV增殖的宿主細胞信號轉導通路，既可抑制ARV的增殖，又不會誘導耐藥性的產生，為ARV的治療提供了新的方向和思路。同時，本研究從細胞信號轉導的角度，揭示了ARV的分子致病機制，也為進一步探索針對ARV的有效防治措施提供理論依據。

本研究結果還顯示，ARV的σNS蛋白在159—162(PXXP→AXXA)、179—183(YXXXM→FXXXA)和333—336(PXXP→AXXA)位氨基酸突變后，并未明顯影響其使Vero細胞P-Akt表達明顯增加的作用，推測ARV是通過σNS蛋白的多個位點(2個PXXP和1個YXXXM基序一起)、其他位點來激活PI3K/Akt信號通路的，或者ARV的σNS蛋白是通過中間蛋白與p85調節亞基結合來激活PI3K/Akt信號通路，這些還有待于進一步的研究。

Y.K.Shin等[9]報道，轉染空載體pcDNA3.1(-)后，A549 細胞P-Akt的表達量比陰性細胞組高，推測是轉染的試劑造成的。本研究也有類似的發現，轉染空載體pcAGEN后，Vero細胞P-Akt的表達量也比陰性細胞組高出一定的量，但由于陽性組P-Akt的表達量明顯高于pcAGEN空載體組和陰性細胞組(高9倍以上)，因此并未影響檢測結果的判定。同時，本課題組的前期研究工作還發現[5]，轉染時間超過6 h后收獲細胞，隨著轉染時間的增加，空載體組P-Akt的表達量會隨著轉染時間的增加而增加，并且會明顯高于陰性細胞組，與陽性組越來越接近，從而影響結果的判定。因此，在本研究中，收獲細胞的時間均選擇轉染后4 h內。本研究結果，給其他需要轉染質粒的研究，提供了非常重要的理論參考意義。

4結論

ARV的σA蛋白，通過110—114的PPXXP和114—117的PXXP激活PI3K/Akt信號通路，使Vero細胞P-Akt的表達量增高，從而實現抑制細胞的凋亡。

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(編輯白永平)

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.07.019

收稿日期：2015-12-16

基金項目：國家自然科學基金項目(31160512)；廣西特聘專家專項(2011B020)；廣西基金項目(2013GXNSFBA019120)

作者簡介：謝麗基(1981-)，女，廣西靈山人，副研究員，碩士，主要從事動物傳染病病原分子生物學研究, Tel:(0771)3120371，E-mail: xie3120371@126.com *通信作者：謝芝勛，E-mail: xiezhixun@126.com

中圖分類號：S852.659.4

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)07-1451-08

The Study of the Activation of PI3K/Akt Pathway by the σA and σNS Protein of Avian Reovirus

XIE Li-ji，XIE Zhi-xun*，HUANG Li，DENG Xian-wen，XIE Zhi-qin，FAN Qing，LUO Si-si，HUANG Jiao-ling，ZENG Ting-ting

(GuangxiVeterinaryResearchInstitute，GuangxiKeyLaboratoryofAnimalEpidemicEtiologyandDiagnostic，Nanning530001，China)

Abstract:The aim of the present study was to find out whether ARV activates the phosphatidylinositol 3-Kinase-dependent Akt (PI3K/Akt) pathway according to the PXXP or YXXXM motif of σA and σNS protein.Gene splicing by overlap extension PCR was used to change the PXXP or YXXXM motif of σA and σNS gene.Recombined plasmids that contain mutant σA and σNS genes were generated.The Akt phosphorylation profile of transfected cells were examined by flow cytometry and Western blot.The results showed that σA and σNS genes were expressed in the Vero cells，and the expression of P-Akt of the σA mutant groups (Amino acid 110-114 and 114-117) decreased markedly.The results indicated that the σA protein of ARV activate the PI3K/Akt pathway by the PXXP motif.The results of this study reveal the mechanisms by which ARV manipulate the cellular signal transduction pathways，which may provide new ideas for novel drug targets.

Key words:ARV；PI3K/Akt pathway；σA protein；PXXP motif