恩諾沙星灌注液在健康母豬體內的藥代動力學研究

馮庭松，黃顯會，曾松情，郜　進，謝　順，劉　宇

(華南農業大學 獸醫學院，廣州 510642)

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恩諾沙星灌注液在健康母豬體內的藥代動力學研究

馮庭松，黃顯會*，曾松情，郜進，謝順，劉宇*

(華南農業大學 獸醫學院，廣州 510642)

摘要：旨在考察恩諾沙星灌注液與恩諾沙星普通注射液在母豬體內的藥代動力學特征。作者選用16頭健康長白×大白二元雜交成年母豬，隨機分成2組，每組8頭，分別進行單劑量耳緣靜脈注射恩諾沙星普通注射液(2.5 mg·kg-1)和子宮灌注恩諾沙星灌注液(50 mL·頭-1)，反相高效液相色譜法(RP-HPLC)測定母豬血漿中恩諾沙星及其代謝產物環丙沙星含量，運用藥動學軟件Winnonlin 5.2.1非房室模型分析并計算出相關藥動學參數。結果顯示，靜脈注射恩諾沙星普通注射液后，其主要藥動學參數如下：t1/2(21.71±1.66)h，Vd(1.89±0.33)L·kg-1，Cl(60.18±8.92)mL·h-1·kg-1，AUC0-t(39.94±5.75)mg·h·L-1，AUC0-∞(42.32±6.03)mg·h·L-1。母豬子宮灌注恩諾沙星灌注液后，其主要藥動學參數分別如下：t1/2(28.55±2.31)h，Tmax(3.19±1.46)h，Cmax(1.61±0.20)mg·L-1，AUC0-t(49.06±5.18)mg·h·L-1，AUC0-∞(53.55±5.84)mg·h·L-1，F為63.15%。所有樣品中均未檢測出環丙沙星。結果表明，恩諾沙星灌注液可經子宮灌注吸收進入母豬體內，并且在母豬體內分布廣泛，消除緩慢，生物利用度較高，臨床用藥時應考慮局部給藥對機體的全身性影響。

關鍵詞：恩諾沙星；子宮灌注液；藥代動力學；母豬

母豬子宮內膜炎發病的主要原因是病原微生物感染[1]。慢性和隱形子宮內膜炎往往在斷奶后發情時才會出現流膿癥狀，此時用常規抗生素療法，效果不佳，易發生母豬屢配不孕和產仔率下降。因而正確使用藥物預防和治療母豬子宮內膜炎尤為重要。目前常見的預防和治療母豬產后感染的方法有產前口服、產后肌肉注射抗菌藥物[2]。母豬產前正處于攻胎期，采食量增加，易發生消化不良，此時在飼料中添加抗菌藥物，不僅會破壞腸道有益菌群，進一步降低母豬消化功能，造成藥源性便秘，而且易產生胚胎毒性，影響母豬生殖健康。產后母豬子宮中易發生胎衣碎片、組織液和血液等異物滯留，破壞子宮內環境，單純的肌肉注射抗菌藥物進行消炎是不夠的。恩諾沙星為廣譜抗菌藥物，殺菌作用強，子宮灌注制劑可直接作用于宮內的病原微生物。

作為一種動物專用的廣譜喹諾酮類抗菌藥物，恩諾沙星主要通過抑制細菌脫氧核糖酸回旋酶(gyrase)和拓撲異構酶(topoisomerase)Ⅳ，干擾DNA的正常轉錄與復制而呈現抗菌作用[3-4]。恩諾沙星經靜脈注射、頸部肌肉注射和口服給藥后在仔豬體內的藥動學研究已有報道[5-6]；許多研究探尋改變恩諾沙星制劑和給藥方式以增強藥物靶向性和提高局部藥物濃度[7-10]。子宮灌注恩諾沙星治療馬子宮炎已有研究[11]，但未有恩諾沙星通過子宮給藥在成年母豬體內藥動學的研究報道。作者研究了恩諾沙星灌注液通過子宮灌注給藥后在健康母豬體內的藥動學特征，對恩諾沙星灌注液作藥動學評價，考察子宮用藥時，恩諾沙星在母豬體內的吸收、分布及代謝，并結合藥效學探討恩諾沙星灌注液治療母豬子宮炎的效果，制定合理的給藥方案。

1材料與方法

1.1藥品與試劑

恩諾沙星灌注液(含量50 mL：1 g)，華南農業大學提供，試驗前測定藥物的有效含量(以恩諾沙星計)為2.05%；恩諾沙星普通注射液(拜有利注射液，含量5%，批號KP08FDW)由德國拜耳動物保健有限公司(成都)提供；恩諾沙星對照品(含量99.9%，批號H0081206)和鹽酸環丙沙星對照品(含量99.8%，批號H0101310)均由中國獸醫藥品監察所提供；磷酸，三乙胺等均為國產分析純試劑；甲醇(批號HX080945)為德國產色譜純級試劑；乙腈(批號083889)為美國Fisher Scientific公司產色譜純級試劑。

1.2儀器設備

Waters高效液相色譜系列(2695 Alliance型泵，2475型多波長熒光檢測器)；菲羅門Gemini C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；電子分析天平(日本島津Shimadzu AUW120D型)；臺式高速離心機(德國Centrifuge 5804型)；可調微量移液器(德國Eppendorf Research型)等。

1.3標準儲備液和標準工作液

恩諾沙星標準儲備液：甲醇溶解恩諾沙星對照品，配制質量濃度為500 μg·mL-1；環丙沙星標準儲備液：取環丙沙星對照品用甲醇溶解配制為500 μg·mL-1；恩諾沙星和環丙沙星混合標準儲備液：恩諾沙星和環丙沙星含量均為250 μg·mL-1。三者均于4 ℃避光保存。臨用前使用0.05 mol·L-1磷酸溶液將恩諾沙星和環丙沙星混合標準儲備液稀釋為系列標準工作液。

1.4實驗動物分組與給藥

健康長白×大白二元雜交母豬16頭，生長期3～4年，體重(213.3±24.5)kg。試驗前按常規飼養，飼料為全價日糧(不含抗菌藥物)，臨床觀察1周，表現健康。動物隨機分為2組，每組8頭，給藥方法分別為耳緣靜脈注射拜有利注射液和子宮灌注恩諾沙星灌注液。靜脈注射組給藥劑量為單次給藥2.5 mg·kg-1，子宮灌注組給藥劑量為單次給藥50 mL·頭-1。子宮灌注時，先用0.1%新潔爾滅溶液消毒母豬外陰部，再使用一次性輸精管以常規配種方式將藥液輸入母豬子宮內。

1.5血樣采集

站立式保定豬，自前腔靜脈采血，每次采血5 mL左右，給藥前采一次空白血(0 h)。給藥后分別于0.083、0.167、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、9、12、16、24、36、48、72和96 h采集血液樣品。采集后立即將樣品置于含0.5%肝素鈉抗凝管中，離心10 min(3 000 r·min-1)，分離血漿，置-20 ℃冰箱保存，待測。

1.6血藥濃度測定

1.6.1血漿樣品前處理取血漿樣品0.5 mL于2 mL進口離心管中，加入1 mL色譜甲醇，微型旋渦混合儀渦旋混勻，置軌道式搖床上振蕩10 min。12 000 r·min-1(4 ℃)離心10 min，吸取上清液，經0.22 μm微孔濾膜過濾至2 mL棕色進樣瓶，進行RP-HPLC熒光檢測。1.6.2色譜條件色譜柱：C18，250 mm×4.6 mm×5 μm，美國Gemini公司；流動相：0.05 mol·L-1磷酸液(三乙胺調節pH至2.4)∶乙腈 =80∶20；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進樣體積：20 μL；熒光檢測器：激發波長為278 nm，發射波長為455 nm。1.6.3檢測限與定量限取空白血漿450 μL，加入恩諾沙星和環丙沙星混合標準工作液，分別制得0.005、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20 μg·mL-1系列質量濃度的加標樣品。按照“1.6.1”方法進行血漿藥物提取，在“1.6.2”色譜條件下測定，以S/N≥ 3的血藥質量濃度為檢測限(LOD)，S/N≥ 10的血藥質量濃度為定量限(LOQ)。

1.6.4外標法標準曲線和線性范圍取空白血漿450 μL，加入50 μL恩諾沙星和環丙沙星混合標準工作液，分別制得0.02、0.05、0.20、0.50、2.00、5.00 μg·mL-1系列質量濃度的加標樣品。按照“1.6.1”方法進行血漿藥物提取，按“1.6.2”色譜條件進行測定。將恩諾沙星與環丙沙星色譜峰面積(A)分別與其藥物濃度(C)作線性回歸，繪制標準曲線，求得各自的標準曲線的回歸方程和相關系數。

1.6.5回收率與精密度將恩諾沙星和環丙沙星混合標準工作液加入空白母豬血漿中，制得低(0.02 μg·mL-1)、中(0.20 μg·mL-1)和高(2.00 μg·mL-1)三個樣品濃度，每個濃度設5個平行，分3個批次，按“1.6.1”方法處理血漿樣品，進行RP-HPLC檢測并計算回收率與精密度。

1.7數據處理與統計分析

2結果

2.1色譜條件的適用性

在上述處理方法和色譜條件下，恩諾沙星、環丙沙星與血漿中其他組分分離良好，色譜峰保留時間分別為9.1和7.2 min左右，見圖1～4。

圖1　母豬空白血漿樣品色譜圖Fig.1　Chromatograms of blank plasma samples of sows

圖2　恩諾沙星(ENRO，0.02 μg·mL-1)和環丙沙星(CIPRO，0.02 μg·mL-1)混合標準液樣品色譜圖Fig.2　Mixed standard liquid chromatogram of enrofloxacin (ENRO，0.02 μg·mL-1) and ciprofloxacin (CIPRO，0.02 μg·mL-1)

圖3　母豬空白血漿添加恩諾沙星(0.02 μg·mL-1)和環丙沙星(0.02 μg·mL-1)混合標準液的樣品色譜圖Fig.3　Liquid chromatogram of blank plasma added with enrofloxacin (0.02 μg·mL-1) and ciprofloxacin (0.02 μg·mL-1)

圖4　子宮灌注給藥(50 mL·頭-1)后12 h母豬血漿樣品色譜圖Fig.4　Chromatogram of sample collected at 12 h after intrauterine administration(50 mL per sow)

2.2檢測限與定量限

母豬血漿中恩諾沙星和環丙沙星的檢測限均為0.01 μg·mL-1，定量限均為0.02 μg·mL-1。結果表明該方法靈敏度高，可以滿足血漿中恩諾沙星和環丙沙星檢測需要。

2.3外標法標準曲線和線性范圍

空白血漿添加恩諾沙星和環丙沙星的質量濃度為0.02～5.00 μg·mL-1，線性關系良好，回歸方程分別為C=2 953 365A-164 817(r=0.999 2)和C=1 134 412A-51 395(r=0.998 3)。

2.4回收率與精密度

恩諾沙星的平均回收率為(93.05 ± 5.21)%，批內變異系數小于7.36%，批間變異系數小于6.91%；環丙沙星的平均回收率為(99.17 ± 7.23)%，批內變異系數小于9.38%，批間變異系數小于8.51%。結果表明該方法回收率高，批內和批間變異系數較小，滿足生物樣品測定要求。

2.5血藥質量濃度和主要藥動學參數

健康成年母豬耳緣靜脈注射恩諾沙星普通注射液(2.5 mg·kg-1)和子宮灌注恩諾沙星灌注液(50 mL·頭-1)后的藥時曲線見圖5。本研究檢出環丙沙星最高值在定量限以下，說明恩諾沙星在母豬血漿內代謝轉化極少，故未對其代謝物環丙沙星進行藥動學研究。

采用Winnonlin 5.2.1軟件的非房室模型處理藥—時數據，計算得出各組藥動學參數，見表1。由表1可見，靜脈注射給藥后，表觀分布容積(Vd)為(1.89±0.33)L·kg-1，終末半衰期(t1/2)為(21.71±1.66)h，藥時曲線下面積(AUC0-t)為(39.94±5.75)mg·h·L-1，AUC0-∞為(42.32±6.03)mg·h·L-1，平均滯留時間(MRT)為(29.03±4.22)h。子宮灌注組的達峰時間(Tmax)為(3.19±1.46)h，達峰濃度(Cmax)為(1.61±0.20)mg·L-1，AUC0-t為(49.06±5.18)mg·h·L-1，AUC0-∞為(53.55±5.84)mg·h·L-1，MRT為(38.65±4.55)h。

3討論與結論

3.1恩諾沙星在成年母豬體內的藥動學特征

圖5　母豬單劑量靜脈注射恩諾沙星普通注射液(i.v.，2.5 mg·kg-1)、子宮灌注恩諾沙星灌注液(i.u.，50 mL·頭-1)的藥時曲線Fig.5　Plasma concentration vs.time curves of enrofloxacin in sows after intravenous (2.5 mg·kg-1) and intrauterine (50 mL per sow) administration at a single dose

表1　成年母豬靜脈注射恩諾沙星普通注射液(2.5 mg·kg-1)、子宮灌注恩諾沙星子宮灌注液(50 mL·頭-1)的藥動學參數±s)

母豬靜脈注射恩諾沙星普通注射液(2.5 mg·kg-1)后，恩諾沙星的表觀分布容積Vd為1.89 L·kg-1，表明恩諾沙星在成年母豬體內組織分布廣。其他喹諾酮類藥物亦見相似特征，麻保沙星和二氟沙星在健康豬的Vd分別為1.27 L·kg-1[12]和4.91 L·kg-1[13]。t1/2為21.71 h，表明恩諾沙星在健康成年母豬體內消除緩慢，顯著高于J.T.Howard等報道的16.1 h[9]。與其他氟喹諾酮類藥物在健康豬體內的t1/2相比，顯著高于麻保沙星(16.22 h)[14]和達氟沙星(8.0 h)[15]，與二氟沙星(25.79 h)[16]相似。 子宮灌注恩諾沙星灌注液(50 mL·頭-1)后，恩諾沙星在健康成年母豬體內的藥動學參數為：Cmax1.61 mg·L-1，Tmax3.19 h，t1/228.55 h，AUC0-∞(53.55±5.84) mg·h·L-1，F63.15%，表明恩諾沙星經子宮灌注后，吸收迅速，消除緩慢，生物利用度較高。Tmax高于肌肉注射和內服恩諾沙星(2.5 mg·kg-1)在健康豬體內的 1.21 h和0.97 h[17]，原因可能是因為灌注液為混懸液，其吸收速度受藥物溶出速度和擴散速度的限制，延緩了藥物吸收。消除緩慢的原因可能是灌注液在母豬子宮內吸收速度緩慢，導致在消除相內仍有藥物持續吸收。

3.2給藥方案

子宮內膜炎是病原微生物侵入母豬子宮黏膜表層或深層，引起的子宮黏膜的黏液性或膿性炎癥過程，主要病原菌為金黃色葡萄球菌、鏈球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌和沙門菌等[1，18-19]。恩諾沙星對豬金黃色葡萄球菌的MIC90為0.25 μg·mL-1，對大腸桿菌和沙門氏菌的MIC90均小于0.128 μg·mL-1，對綠膿桿菌的MIC90為2.04 μg·mL-1，對鏈球菌的MIC90小于0.75 μg·mL-1[20]。恩諾沙星是濃度依賴性藥物，在Cmax/MIC>8、AUC24/MIC>125可發揮良好的細菌學療效[21]。有研究表明，馬子宮內灌注恩諾沙星(2.5 mg·kg-1)后，血漿AUC僅為子宮組織AUC的0.63%[11]；環丙沙星通過對人體子宮給藥后，藥物在陰道組織的濃度要比血漿中的高2～5倍[22]。因而，子宮內組織濃度可能遠高于血漿中藥物濃度。成年母豬按50 mL·頭-1單劑量子宮灌注恩諾沙星子宮灌注液，AUC24為 (24.62±2.62) mg·h·mL-1，對于豬大腸桿菌、葡萄球菌、鏈球菌的AUC24/MIC遠遠大于125；灌注給藥后，血藥濃度在3 h左右達到峰濃度(1.61 μg·mL-1)，給藥后48 h血藥濃度仍維持在0.34 μg·mL-1以上。結合市售恩諾沙星的給藥方案，在進行恩諾沙星灌注液治療母豬子宮內膜炎時，建議給藥方案：子宮灌注，每日1次，劑量 50 mL·頭-1，療程3 d。

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(編輯白永平)

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.07.024

收稿日期：2016-01-13

基金項目：國家科技支撐計劃(2015BAD11B03-06)

作者簡介：馮庭松(1991-)，男，安徽長豐人，碩士生，主要從事畜禽藥動學及藥效學研究，E-mail：18819474592@163.com *通信作者：劉宇(1960-)，男，副教授，E-mail：lyscau@foxmail.com；黃顯會(1969-)，男，高級獸醫師，E-mail：huangxianhuiscau@foxmail.com

中圖分類號：S859.7

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)07-1488-07

Pharmacokinetics of Enrofloxacin Perfusate in Healthy Sows

FENG Ting-song，HUANG Xian-hui*，ZENG Song-qing，GAO Jin，XIE Shun，LIU Yu*

(CollegeofVeterinaryMedicine，SouthChinaAgriculturalUniversity，Guangzhou510642，China)

Abstract:This study was designed to compare the pharmacokinetic parameters of enrofloxacin following intravenous and intrauterine administrations to investigate their bioavailability in sows.16 cross-bred (Landrace×Yorkshire) healthy，adult，non-lactating sows，were used.The sows were randomly divided into two groups with eight animals each.The sows of first group were administered with enrofloxacin injection by intravenous route，at a single dose of 2.5 mg·kg-1；whereas those of second group were administered with enrofloxacin uterine perfusate by intrauterine administration at a single dose of 50 mL per sow.Enrofloxacin concentrations were determined by reverse phase-high performance liquid chromatography (RP-HPLC) with fluorescence detection.A non-compartmental analysis of drug plasma concentration vs.time profiles was performed with pharmacokinetic modeling using Winnonlin software.Following intravenous administration，the main pharmacokinetic parameters were as follows：t1/2(21.71±1.66)h，Vd(1.89±0.33)L·kg-1， Cl(60.18±8.92)mL·h-1·kg-1，AUC0-t(39.94±5.75)mg·h·L-1，AUC0-∞(42.32±6.03)mg·h·L-1.The absorption of enrofloxacin was rapid and well absorbed after intrauterine administration，with t1/2of (28.55±2.31)h，Tmaxof (3.19±1.46)h，Cmaxof (1.61±0.20)mg·L-1，AUC0-tof (49.06±5.18)mg·h·L-1，AUC0-∞(53.55±5.84)mg·h·L-1.The absolute bioavailability (F) was 63.15%.Concentrations of the active metabolite ciprofloxacin were not detected in any samples.The results showed that the sows can absorb enrofloxacin well by way of intrauterine administration，with slow elimination and high bioavailability.And the effect on body after intrauterine administration should be considered.

Key words:enrofloxacin；uterine perfusate；pharmacokinetics；sows