青梗菜游離小孢子培養技術研究

方 輝，胡錦彬，薄永明

（寧波微萌種業有限公司，浙江 寧波 31500）

青梗菜游離小孢子培養技術研究

方 輝，胡錦彬，薄永明*

（寧波微萌種業有限公司，浙江 寧波 31500）

以15份不同基因型的青梗菜雜交種為試材進行游離小孢子培養，探討花蕾長度和供體植株基因型對青梗菜小孢子培養的影響。結果表明，青梗菜小孢子培養的適宜花蕾長度為2.0～3.0 mm，基因型是影響青梗菜小孢子培養的關鍵因素。共獲得138株小孢子植株，經流式細胞儀鑒定，其中64.7%為二倍體植株，基本建立了利用游離小孢子培養技術創制青梗菜D H系的技術體系。

青梗菜；小孢子培養；基因型

文獻著錄格式：方輝，胡錦彬，薄永明.青梗菜游離小孢子培養技術研究［J］.浙江農業科學，2016，57（1）：76-79.

青梗菜是小白菜（Brassica raPa L.ssp. chinensis L.Kitamur）中一類束腰、葉色亮綠、品質優良的品種，屬異花授粉作物，雜種優勢明顯。近年來，隨著游離小孢子培養技術的不斷發展，利用該技術輔助傳統育種可提高育種效率，縮短育種周期［1］，已有研究在小白菜游離小孢子培養技術上取得較大進展［2-5］。但游離小孢子培養的胚胎發生頻率及基因型的反應范圍存在很大差異，限制了該技術在遺傳育種和基礎研究上的進一步應用。本研究以15份不同基因型的青梗菜為試材進行游離小孢子培養，對培養過程中影響胚狀體產生頻率的幾個關鍵因素進行探討，為進一步完善青梗菜小孢子培養技術體系奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗材料為15份不同基因型的青梗菜雜種1 代（表1），均為市場主流品種，由寧波微萌種業有限公司引進。2014年9月播種，10月定植于大田，常規管理并調查其農藝性狀。12月底，每個品種各選10棵健壯植株移栽于單棟大棚越冬。2月底至4月中旬取適宜花蕾進行游離小孢子培養。

表1 供試青梗菜材料的名稱及來源

1.2 游離小孢子的分離和培養

供試植株抽薹開花后，于晴天上午8：00—9：00取材，選擇適宜花蕾用于游離小孢子培養。用75%酒精消毒花蕾30 s，再用2%N a C 1 O振蕩消毒15 min，滅菌水清洗3次，每次1 min。將無菌花蕾置于50mL離心管，加5mL洗滌培養基（13% B 5液體），用玻璃棒輕搗釋放小孢子。懸浮液經孔徑40 μ m的細胞過濾器過濾，收集濾液于50mL離心管中，800 r·min-1離心5 min；棄上清，沉淀物用5mL洗滌培養基重懸，800 r·min-1離心3 min；棄上清，純化后小孢子加入胚狀體誘導培養基（13%N L N液體），用血球計數板在顯微鏡下鏡檢，并調節小孢子密度至1萬個·m L-1，每皿5mL分裝到直徑6 cm的無菌培養皿中，封口膜封口。

將分裝好的小孢子懸浮液置于恒溫培養箱中進行32℃熱激誘導1 d后，轉入25℃恒溫培養箱中繼續暗培養，直至肉眼可見胚狀體出現。出胚培養皿移至恒溫搖床，50 r·min-1，25℃暗培養。游離小孢子培養25 d后統計出胚數目。待胚狀體長至3 mm大小時轉入胚狀體再生培養基（3%MS固體，2mg·L-16-B A，0.1mg·L-1I A A），再生苗誘導培養條件為溫度25℃，晝夜光周期16 h/8 h，光照強度1 500 1 x。期間將形成的芽轉入生根培養基（3%MS固體，0.1mg·L-1I A A）中培養。將室外煉苗2 d的再生苗洗去培養基后移植到32穴穴盤，2周后定植于大棚，成活后取植株幼嫩葉片，利用流式細胞儀（B D A c c ur iC 6）檢測其倍性。

1.3 適宜小孢子培養的花蕾長度

以G P-1，G P-13，G P-15為試材，在生長健康的植株花序上選取不同長度的花蕾進行D P A I染色。選取2～3個花蕾置于1.5mL離心管中，加入100 μ L水，用塑料棒輕搗釋放小孢子，取上清滴加1～2滴DAPI染液，室溫暗處理染色15 min后制片，用熒光顯微鏡觀察、照相，并記錄處于單核靠邊期至雙核早期的小孢子外部形態。培養中的小孢子于倒置顯微鏡下進行形態學觀察。

2 結果與分析

2.1 小孢子不同發育時期的DAPI染色觀察

青梗菜小孢子發育過程可分為四分體時期、單核期、雙核期、三核期。經DAPI染色觀察，單核靠邊期的青梗菜小孢子細胞核位于細胞邊緣，靠近細胞壁，細胞近圓形，可看到3條萌發溝。雙核早期小孢子經第1次有絲分裂在細胞內形成1個營養核和1個生殖核。此時細胞的外部形態為圓形，萌發溝變淺。由DAPI染色結果可知，隨著小孢子不斷生長發育，其細胞體積不斷增大，由最先的三棱形細胞轉變為圓形細胞，最后變成橢圓形成熟小孢子。處于單核靠邊期至雙核早期的小孢子可觀察到萌發溝，細胞近圓形或橢圓形，可作為單核靠邊期至雙核早期的細胞形態指標。

2.2 小孢子處于單核靠邊期至雙核早期所對應的花蕾長度

對于青梗菜，適于培養的小孢子發育時期一般是單核靠邊期至雙核早期。而花蕾長度與小孢子的發育時期有明顯的對應關系。本研究將采集的G P-1，G P-13和G P-15花蕾混合，按照長度分類，可分為3個等級：（1）2.0～3.0 mm，（2）3.0～3.5 mm，（3）3.5～4.0 mm。鏡檢和DAPI染色觀察，依據單核靠邊期至雙核早期的小孢子細胞學特征，找出大部分小孢子處于該時期所對應的花蕾長度，即為適宜游離小孢子培養的花蕾長度。從DAPI染色結果可知，不同基因型青梗菜材料單核靠邊期所對應的花蕾長度均在2.0～3.0 mm。在實際應用中，可依據試驗結果，直接選取長度為2.0～3.0 mm的花蕾用于游離小孢子培養。

2.3 青梗菜小孢子培養過程中的細胞學觀

在小孢子培養過程中，用倒置顯微鏡觀察小孢子培養過程中各個發育時期的形態。經24 h熱激處理后，部分小孢子明顯膨大成圓球形，直徑為原細胞的2～3倍（圖1中a）；3 d后，膨大的小孢子發生第1次分裂，除個別為不均等分裂外（圖1 中b），其余大部分為均等分裂（圖1中c）；7 d后可觀察到分裂多次的細胞團（圖1中d）；10～11 d后可觀察到球形胚和心形胚（圖1中 e，f）；第12～15天時可觀察到魚雷形胚和子葉形胚（圖1中g，h）。此外還發現不同基因型青梗菜的小孢子胚胎發生均具有不同步性，在同一個皿中可以觀察到不同形態胚狀體并存的現象（圖1中 i），因此在實際操作過程中，同一個培養皿中的胚狀體需要根據胚狀體發育情況分批次進行轉胚。

圖1 青梗菜小孢子離體發育過程

2.4 供體植株基因型對青梗菜小孢子胚發生能力的影響

由表2可見，供試的15份青梗菜中有10份誘導出胚，其中G P-2，G P-4，G P-15出胚率相對較高，達1.04，0.87和0.89胚·蕾-1，其余7份出胚材料的出胚率較低，在0.5胚·蕾-1上下。由此可見，不同基因型的青梗菜小孢子胚胎發生能力有很大差異，在相同培養條件下，基因型是影響青梗菜小孢子培養成功與否的重要因素。

表2 不同基因型青梗菜誘導形成胚狀體結果

2.5 青梗菜小孢子胚狀體的繼代培養

將培養25 d后的胚狀體轉接到胚狀體再生培養基上繼續培養，待胚狀體萌發分化后，將再生芽轉接到生根培養基，培養中發現，大部分的子葉形胚均能正常發育、分化，最后形成健全植株（圖2），而球形、心形和魚雷形胚狀體分化困難甚至褐化死亡。這表明幼期胚狀體不易誘導成苗，子葉形胚易進行繼代培養，還需要進一步探索繼代培養中各條件對胚狀體發育及分化的影響，以優化青梗菜胚狀體繼代培養條件，進而提高青梗菜游離小孢子培養效率。

2.6 再生植株倍性檢測

通過流式細胞儀對獲得的再生植株進行倍性測定，以正常二倍體青梗菜植株為對照。測定的138份材料中，單倍體材料占17.6%，四倍體材料占11.8，嵌合體占5.9%，二倍體材料占64.7%，這說明青梗菜小孢子培養過程中發生了自然加倍現象，且加倍頻率較高，另外本研究中嵌合體的出現頻率相對較高，這可能與部分材料多次繼代培養有一定的關系。

圖2 青梗菜小孢子胚狀體的萌發與植株再生

3 小結與討論

在游離小孢子培養中，小孢子發育時期與胚誘導成功率密切相關，因此選擇合適發育時期的小孢子尤為重要。前期研究表明，青梗菜小孢子適宜取材時期為單核靠邊期至雙核早期。本研究采用D P A I染色方法，確定了單核靠邊期至雙核早期的細胞形態；對不同長度花蕾小孢子進行顯微觀察，明確了處于單核靠邊期至雙核早期的小孢子所對應的花蕾長度。3條萌發溝是該時期小孢子最為明顯的細胞形態學特征，可作為此發育時期的形態學標志。本研究表明，青梗菜用于小孢子培養的適宜花蕾長度一般為2.0～3.0 mm，但在實際應用中，受供體植株生長環境及植株狀態影響，還需根據情況確定適宜長度的花蕾進行游離小孢子培養。

目前，小孢子培養技術在不同作物育種中已經廣泛應用。在探討大白菜［6］、甘藍［7］、花椰菜［8］、蘿卜［9］等小孢子培養因素的研究中，基因型是決定游離小孢子培養成功與否的關鍵因素。在本研究中，基因型仍是影響青梗菜小孢子培養的重要因素，且不同基因型青梗菜的小孢子胚發生能力有很大差異，能否通過優化培養條件來克服基因型對青梗菜小孢子培養的限制，還需進一步的試驗驗證。本研究對再生植株的倍性進行鑒定，發現自然加倍率達到64.7%，其余為單倍體、嵌合體及四倍體材料，這與C he n等［10］研究結果大體一致。自然加倍省去了復雜繁瑣的人工加倍，為純合二倍體植株的創制與利用提供了便利，但如何利用同時獲得的單倍體及四倍體材料，還需進一步試驗探究。

［1］楊麗梅，方智遠，劉玉梅，等.利用小孢子培養選育甘藍自交系［J］.中國蔬菜，2003（6）：31-32.

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［3］李巖，劉凡，曹鳴慶.通過游離小孢子培養方法獲得小白菜三個變種的胚胎及植株［J］.華北農學報，1993，8（3）：92-97.

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［5］馮輝，楊碩，王超楠，等.青梗菜優異 D H系的創制與利用［J］.中國農業科學，2009，42（9）：3195-3202.

［6］趙俊，巫東堂，趙軍良，等.影響大白菜游離小孢子培養若干因素的研究［J］.山西農業科學，2008，36（8）：26-28.

［7］梁娟，俞金龍，巫水欽，等.甘藍D H系構建技術體系的建立［J］.浙江農業科學，2015，56（5）：669-674.

［8］張曉芬，王曉武，張延國，等.花椰菜游離小孢子培養再生植株研究［J］.中國蔬菜，2005（1）：16-17.

［9］張麗.蘿卜游離小孢子培養技術初探［J］.園藝學報，2004，34（5）：676-678.

［10］CHEN Z Z，SNYDER S，FAN Z G，et a1.Efficient production of doub1ed hap1oid p1ants through chromosome doub1ing of iso1ated microspores in Brassica naPus［J］.P1antBreeding，2006，113（3）：217-221.

（責任編輯：張瑞麟）

S634

A

0528-9017（2016）01-0076-03

10.16178/j.issn.0528-9017.20160129

2015-11-05

寧波市農業科技攻關項目（2014C 10007）

方 輝（1988-），男，浙江寧波人，碩士，從事蔬菜育種工作，E-mai1：fangwurs@126.com。

薄永明，E-mai1：boyongming2@vip.sina.com。