雙去甲氧基姜黃素抑制肝癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制

景　發(fā),熊書名,李建平

(南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 外科學(xué),江蘇 南通,226000)

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雙去甲氧基姜黃素抑制肝癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制

景發(fā),熊書名,李建平

(南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 外科學(xué),江蘇 南通,226000)

摘要:目的探討雙去甲氧基姜黃素(BDMC)對肝癌細(xì)胞的作用及其機(jī)制。方法不同BDMC (0、20、40、80μmol/L)干預(yù)肝癌細(xì)胞株HEPG2 72 h,MTT評價細(xì)胞增殖,Tunel分析細(xì)胞凋亡,ELISA檢測活性氧(ROS)水平和p-STAT3水平,Western blot檢測AMPK。采用ROS抑制劑N-乙酰-L半胱氨酸(NAC 2.5 mmol/L)處理30 min后BDMC再干預(yù)24 h,評價細(xì)胞凋亡能力。結(jié)果BDMC可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，增加ROS生成和AMPK磷酸化水平，抑制p-STAT3表達(dá)。抑制ROS生成可抑制BDMC誘導(dǎo)HEPG2凋亡的能力。結(jié)論BDMC通過ROS/AMPK/STAT3信號通路誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。

關(guān)鍵詞:雙去甲氧基姜黃素; 肝癌; 增殖; 凋亡

姜黃色素主要包括姜黃素、去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素,其中主要成分姜黃素具有廣譜的抗腫瘤作用，能抑制體內(nèi)外多種腫瘤細(xì)胞的生長。肝癌是威脅中國人生命健康的常見腫瘤之一，患者總體預(yù)后不是十分滿意。本實驗研究探討雙去甲氧基姜黃素抑制肝癌細(xì)胞生長及促進(jìn)其凋亡的機(jī)制，現(xiàn)報告如下。

1材料與方法

1.1材料與試劑

人肝癌細(xì)胞株HEPG2購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。雙去甲氧基姜黃素購自美國Sigma生物有限公司。RPMI-1640培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國Gibco公司。MTT試劑盒、抗氧化劑N-乙酰-L半胱氨酸(NAC)、活性氧(ROS)檢測試劑盒購自南京碧云天生物科技公司。P-AMPK，p-STAT3抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。TUNEL 綠色熒光檢測試劑盒購自南京碧云天生物科技有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

HEPG2細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2孵箱中，隔天更換培養(yǎng)基，細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶70%～80%時，用0.25%胰蛋白酶消化后傳代繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3MTT實驗檢測細(xì)胞增殖能力

細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個/L，種植于96孔板，每孔100 μL,24 h后加無血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h,使細(xì)胞同步化于靜止期。棄上清，加不同濃度雙去甲氧基姜黃素(20、40、80 μmol/L),每組設(shè)5個復(fù)孔，培養(yǎng)72 h，棄上清，每孔加10 μL MTT和100 μL無血清DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h,去培養(yǎng)液，加100 μL二甲亞砜37 ℃孵育10 min完全溶解，酶標(biāo)儀以測量波長490 nm測吸光度值。抑制率(%)=[1-(藥物組吸光度值/對照組吸光度值)] ×100%。

1.4熒光TUNEL檢測細(xì)胞凋亡率P

不同濃度姜黃素作用(20、40、80 μmol/L)后,PBS或HBSS洗滌1次，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30～60 min,用PBS或HBSS洗滌1次，加入含0.1% Triton X-100的PBS或碧云天生產(chǎn)的免疫染色洗滌液(P0106),冰浴孵育2 min。在樣品上加50 μL TUNEL檢測液,37 ℃避光孵育60 min。PBS或HBSS洗滌3次。用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察。可以使用的激發(fā)波長為450～500 nm,發(fā)射波長范圍為515～565 nm(綠色熒光)。

1.5ROS生成檢測

按照1∶1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA,使終濃度為10 μmol/L。細(xì)胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，細(xì)胞濃度為104/mL,37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。每隔3～5 min顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。收集細(xì)胞后，流式細(xì)胞儀檢測。

1.6Western Blot鑒定

各組細(xì)胞處理后提取總蛋白，加入上樣緩沖液,12%SDS-PAGE電泳，結(jié)束后轉(zhuǎn)膜,125 mA電流下4 ℃轉(zhuǎn)膜120 min,封閉2 h,一抗(1∶200)稀釋后37℃孵育1.5 h,漂洗3次，每次5 min,孵育二抗1.5 h后漂洗，用Pierce ECL發(fā)光液(Pierce公司)顯影，凝膠成像儀成像。β-actin檢測作為內(nèi)對照。

2結(jié)果

2.1雙去甲氧基姜黃素對HEPG2細(xì)胞增殖的影響

不同濃度BDMC (20、40、80 μmol/L)作用于HEPG2細(xì)胞后，細(xì)胞增殖受限，隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，細(xì)胞的生長抑制率也呈現(xiàn)明顯下降的趨勢，即與藥物濃度和作用時間成正相關(guān)。見圖1。HEPG2細(xì)胞在80 μmol/L BDMC作用48 h左右時達(dá)到半數(shù)抑制率。同一時間點高濃度BDMC作用的細(xì)胞抑制率顯著大于低濃度的抑制率(P<0.05)。

圖1 雙去甲氧基姜黃素抑制HEPG2細(xì)胞增殖

2.2雙去甲氧基姜黃素對HEPG2細(xì)胞凋亡的影響

不同濃度BDMC (20、40、80 μmol/L)作用于HEPG2細(xì)胞72 h后，熒光TUNEL檢測發(fā)現(xiàn)低濃度的BDMC(20 μmol/L)僅見少量綠色熒光，細(xì)胞發(fā)生凋亡率僅為3.1%左右。40 μmol/L BDMC作用HEPG2細(xì)胞72 h后熒光TUNEL染色提示細(xì)胞出現(xiàn)少量凋亡(13.5%)。而80 μmol/L BDMC可明顯誘導(dǎo)抑制HEPG2細(xì)胞發(fā)生凋亡約37.6%。見圖 2。不同濃度BDMC組間細(xì)胞凋亡率存在顯著差異(P<0.05)。

2.3雙去甲氧基姜黃素對ROS生成影響

采用碧云天公司的ROS生成檢測試劑盒檢測不同濃度BDMC (20、40、80 μmol/L) 作用于HEPG2細(xì)胞12 h內(nèi)細(xì)胞ROS生成的相對表達(dá)量見圖3。結(jié)果提示BDMC可明顯誘導(dǎo)HEPG2細(xì)胞ROS生成，并且ROS生成量與BDMC濃度成正相關(guān)，80 μmol/L BDMC誘導(dǎo)ROS生成量要顯著高于低濃度各組(P<0.05)。

圖2 雙去甲氧基姜黃素誘導(dǎo)HEPG2細(xì)胞凋亡

圖3 雙去甲氧基姜黃素促進(jìn)ROS生成

2.4Western Blot檢測ROS下游p-AMPK和p-STAT3蛋白表達(dá)

上述研究表明BDMC可明顯促進(jìn)ROS生成，進(jìn)一步利用80 μmol/L BDMC 處理肝癌細(xì)胞48 h后，Western Blot檢測ROS下游下游信號通路蛋白的表達(dá)。本研究表明p-AMPK表達(dá)明顯增加，而p-STAT3表達(dá)明顯下降。提示BDMC抗腫瘤可能與ROS/AMPK/STAT3信號通路，作者利用ROS抑制劑NAC抑制ROS生成，其下游的p-AMPK明顯下降，而p-STAT3表達(dá)明顯升高。見圖4。

2.5ROS抑制劑NAC阻斷BDMC抗腫瘤作用

利用ROS抑制劑NAC阻斷BDMC誘導(dǎo)的ROS生成后，作者發(fā)現(xiàn)不同濃度BDMC (20、40、80 μmol/L)作用72 h后HEPG2細(xì)胞生長抑制率較無NAC組明顯下降，凋亡也出現(xiàn)減少。見圖5。

3討論

肝癌在中國癌癥死亡率中排名第2位，發(fā)病率為全球最高，嚴(yán)重威脅人們的身體健康[1]。隨著手術(shù)水平的提高及化療藥物的改進(jìn)、放療技術(shù)的進(jìn)步，肝癌治療得到一定的進(jìn)展，但放化療目前副作用較大，肝癌患者的總體預(yù)后仍然不佳[2]。

姜黃色素主要包括姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素，而其中雙去甲氧基姜黃素僅占主要成分的3%[3]。目前關(guān)于雙去甲氧基姜黃素的抗腫瘤研究報道很少[4]。Yu和Xu等[5-6]研究表明，雙去甲氧基姜黃素可有效抑制肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移。Yu和Song等[7]研究表明，雙去甲氧基姜黃素可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡。Luo等[8]發(fā)現(xiàn)雙去甲氧基姜黃素可通過抑制線粒體功能抑制胃腺癌的生長。

圖4 BDMC對p-AMPK和p-STAT3蛋白表達(dá)影響

圖5添加NAC后BDMC對HEPG2增殖和凋亡的影響

雙去甲氧基姜黃素對肝癌細(xì)胞作用至今研究報道仍然很少。本研究發(fā)現(xiàn)雙去甲氧基姜黃素是一種有效的天然抗腫瘤藥物，可有效抑制肝癌細(xì)胞增殖，高濃度時可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且這種作用效果與雙去甲氧基姜黃素作用的時間和藥物濃度是呈正相關(guān)的。Li等[9]研究報道發(fā)現(xiàn)，人乳腺癌細(xì)胞在加入雙去甲氧基姜黃素后細(xì)胞生長明顯受到抑制，其機(jī)制可能與ROS聚集有關(guān)。因此，作者推測雙去甲氧基姜黃素抑制肝癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡與肝癌細(xì)胞內(nèi)ROS生成增加也有關(guān)。在肝癌HEPG2細(xì)胞中加入雙去甲氧基姜黃素后，作者發(fā)現(xiàn)ROS生成水平明顯增加，利用Western Blot證明ROS大量生成后AMPK磷酸化明顯增加，表明ROS生成增加后,AMPK被激活。Nerstedt等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在肝細(xì)胞中STAT3是AMPK活化后的靶點，研究表明AMPK活化可抑制STAT3磷酸化。進(jìn)一步Western Blot證明雙去甲氧基姜黃素干預(yù)后肝癌細(xì)胞中的STAT3磷酸化明顯下降，而研究認(rèn)為p-STAT3表達(dá)下降，可促使Bax從胞漿遷移至線粒體，導(dǎo)致線粒體膜電位崩解,Cyt C釋放至胞漿，激活caspase 3級聯(lián)反應(yīng)，從而誘導(dǎo)凋亡[11-12]。因此，作者推測雙去甲氧基姜黃素的抗肝癌作用通過ROS/AMPK/STAT3信號通路實現(xiàn)。作者利用ROS抑制劑NAC阻斷BDMC誘導(dǎo)的ROS生成后，雙去甲氧基姜黃素的抗腫瘤作用明顯下降，其下游信號通路p-AMPK和p-STAT3表達(dá)水平改變出現(xiàn)相反的變化，表明ROS/AMPK/STAT3信號是雙去甲氧基姜黃素的抗肝癌重要作用機(jī)制。

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收稿日期:2016-03-21

基金項目:江蘇省無錫市科技局科技支撐計劃(CSE31N1311)

通信作者:李建平,教授,E-mail:rober824919@sina.com

中圖分類號:R 735.7

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1672-2353(2016)15-043-04

DOI:10.7619/jcmp.201615012

Mechanism of bisdemethoxycurcumin inhabits proliferation of hepatocellular carcinoma cell and induces apoptosis

JING FA,XIONG Shuming,LI Jianping

(Surgery,Medical College of Nantong University,Nantong,Jiangsu,226000)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of bisdemethoxycurcumin (BDMC) on hepatocellular carcinoma cells.MethodsHepatoma cell line HEPG2 cells were treated with different concentrations of BDMC (0,20,40,80 μmol/L) for 72 h,and then the cell proliferation was measured by MTT.Cell apoptosis was evaluated by TUNEL analysis.ELISA was used to detect the level of intracellular reactive oxygen species (ROS) and STAT3 phosphorylation (p-STAT3),and Western blot was used to detect the expression of AMPK.Processed by ROS inhibitor N- acetyl -L cysteine (2.5 mmol/L NAC) for 30 min,cells were treated with BDMC for 24 h,and the ability of cell apoptosis was evaluated.ResultsBDMC was able to induce apoptosis of hepatocellular carcinoma cells,increase the intracellular ROS production and AMPK phosphorylation levels,and inhibit the expression of p-STAT3 protein.Inhibition of ROS formation could effectively inhibit the ability of BDMC in inducing apoptosis of HEPG2 cells.ConclusionBDMC induces apoptosis in hepatocellular carcinoma cells by ROS/AMPK/STAT3 signaling pathway.

KEYWORDS:bisdemethoxycurcumin; hepatocellular carcinoma; proliferation; apoptosis