遠志總皂苷對癲癇模型大鼠NMDA 受體表達的影響

李　艷，景　瑋，馬　彪，李新毅

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遠志總皂苷對癲癇模型大鼠NMDA 受體表達的影響

李艷1，景瑋1，馬彪2，李新毅1

1.山西醫科大學附屬山西大醫院(太原 030001)；2.山西省晉中市第一人民醫院

摘要：目的觀察遠志總皂苷(Tenuigenin，TEN)對癲癇模型大鼠N-甲基-D天門冬氨酸(NMDA)受體表達的影響，探討TEN對癲癇繼發認知障礙干預作用的機制。方法32只雄性Wistar大鼠，隨機分為對照組(8只)、模型組(12只)、遠志總皂苷防治組(12只)。采用腹腔注射戊四氮(PTZ)溶液制作癲癇大鼠模型，遠志總皂苷防治組在腹腔注射戊四氮的同時給予灌服遠志總皂苷，對照組分別注射及灌服等劑量的生理鹽水。采用免疫組化方法檢測大鼠海馬CA1區NMDA受體表達。結果模型組大鼠海馬CA1區NMDA受體平均灰度值顯著高于對照組，遠志總皂苷防治組大鼠海馬CA1區NMDA受體平均灰度值顯著低于模型組。結論遠志總皂苷可顯著提高癲癇模型大鼠海馬CA1區NMDA受體表達，這可能是其減輕癲癇繼發認知障礙的部分機制。

關鍵詞：癲癇；遠志總皂苷；海馬；NMDA受體

癲癇是由腦部神經元高度同步異常放電而引起的腦功能障礙綜合征。目前，全世界有1%的人口受到此病的困擾，而我國癲癇患病率更是高達7%[1]。值得關注的是，30%～40%癲癇病人伴有不同程度的認知功能受損[2]，成為影響病人生活質量的一個重要因素。遠志是我國傳統的安神益智良藥，遠志的成分復雜，而其中的總皂苷是改善認知的重要成分。有研究證明，遠志總皂苷(Tenuigenin，TEN)可以在多個階段影響小鼠的學習記憶能力，關于遠志總皂苷對學習記憶影響的膽堿能機制已有部分研究，但其對癲癇后N-甲基-D天門冬氨酸(NMDA)受體表達影響的研究尚不多見[3]。本實驗采用腹腔注射PTZ溶液制作癲癇大鼠模型，通過免疫組化方法觀察大鼠海馬CA1區NMDA受體表達變化及遠志總皂苷對其影響，探討TEN改善學習記憶功能的機制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物32只雄性Wistar大鼠，體重為200 g～250 g，由北京海淀興旺動物養殖場提供，室溫(25.5±2)℃喂養。

1.1.2藥品、試劑及實驗儀器遠志總皂苷，純度為72%，在山西大學中醫藥現代研究中心提取，取37.5 g溶于1 L的蒸餾水中，充分溶解后置于4℃環境保存；戊四氮(Pentylenetetrazole，PTZ)購于Sigma公司，將其溶于生理鹽水配成1%的溶液(10 mg/mL)后置于4℃環境保存；腦立體定位儀購于深圳瑞沃德公司。

1.2實驗方法

1.2.1動物分組及造模將32只雄性Wistar大鼠隨機分為對照組、模型組、遠志總皂苷防治組(375 mg/kg)，對照組8只，模型組與遠志總皂苷防治組各12只。模型組給予腹腔注射致驚厥劑量的PTZ(40 mg/kg)，注射時間為每日08：00～09：00，注射完觀察大鼠2 h，注意記錄發作次數和分級，每隔1 d稱大鼠體重進行劑量調節，連續給藥28 d，停藥7 d，再以相同劑量點燃，以連續2次以上、4級以上發作視為造模成功，驚厥發作以Racine法分級標準進行判斷。遠志總皂苷防治組在腹腔注射戊四氮的同時灌服遠志總皂苷溶液(375 mg/kg)，給藥35 d，然后腹腔注射戊四氮點燃。對照組則給予生理鹽水灌胃及腹腔注射。

造模結果：對照組8只大鼠均存活，模型組大鼠由于癲癇發作死亡3只，未達點燃標準的1只，造模成功8只，遠志總皂苷防治組大鼠癲癇發作死亡2只，未達點燃標準的1只，造模成功9只。

1.2.2切片制備經以上處理后，大鼠經7%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔麻醉，開胸腹充分暴露心臟和肝臟，剪開左側心尖部，將導管插入左心室并固定，同時剪開右心耳?？焖俟嘧⑸睇}水250 mL 左右至肝臟完全變白，待右心室流出澄清液體后，用40 mol/L 多聚甲醛固定液先快速再緩慢灌注100 mL左右至大鼠肝臟變硬，肢體僵直后斷頭，完整取出鼠腦并投入含4%的多聚甲醛中4℃固定4～6 h，脫水，透明，石蠟包埋。冠狀位連續海馬切片，切片厚度為4 μm。

1.2.3免疫組化染色采用SABC(Strept Actividin-Biotin Complex)免疫組化染色法，具體步驟如下：①石蠟切片常規脫蠟；②PBS洗2 min×2 次，3% 的過氧化氫溶液滴至切片，室溫10 min，滅活內源性酶；③PBS洗2 min×2 次，0.1% 胰酶修復；④PBS洗2 min×2次，滴加5% BSA 封閉液，室溫30 min，甩去多余液體，不洗；⑤滴加稀釋的兔抗大鼠NMDAR2B(1∶30)，4 ℃ 過夜；⑥ 復溫40 min，PBS 沖洗2 min×2次；⑦滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃ 30 min，PBS 洗2 min×2次；⑧滴加SABC，37℃ 20 min，PBS 洗2 min×3 次；⑨ DAB 顯色，鏡下控制染色程度，7 min～8 min后蒸餾水終止顯色反應；⑩蘇木素輕度復染11 s。脫水，封片。光鏡下觀察。

1.2.4陰性對照的建立以10% PBS 代替一抗進行免疫組化染色，其余步驟如前。1.2.5灰度值測定采用BI2000醫學圖像分析系統，400倍物鏡下，在相對應的海馬CA1區內，隨機各取5個視野，測單個視野中NMDA受體的灰度值。

2結果

各組海馬CA1區NMDA受體(見圖1)，免疫染色陽性物質主要存在于神經元細胞表面。其中對照組免疫染色陽性細胞排列規則，細胞免疫染色深；模型組NMDA免疫染色陽性細胞排列欠規則，染色較淡，其平均灰度值顯著大于對照組(P<0.05)；遠志總皂苷防治組免疫染色陽性細胞排列較模型組規則，染色較深，其平均灰度值顯著小于模型組(P<0.05)。詳見表1。

圖1　各組海馬CAI區NMDA受體

組別nNMDA受體灰度值對照組8186.87±1.46 模型組8205.99±2.531)遠志總皂苷組9195.35±2.332) 與對照組比較,1)P<0.01;與模型組比較,2)P<0.05。

3討論

NMDA 受體在短暫記憶、空間記憶以及被動回避記憶中均有重要的作用[4]。長時程增強(LTP)是一種突觸可塑性的形式，是學習和記憶的細胞基礎[5]。神經電生理學研究表明[6]，大腦海馬LTP 是記憶形成和鞏固過程中神經元活動的客觀指標。海馬發育早期，谷氨酸能神經元內的NMDA 受體參與了LTP的建立，一定強度和頻率的電刺激，可使谷氨酸能突觸的后膜去極化，移除阻礙Ca2+內流的Mg2+，使NMDA 受體通道復合體的Ca2+通道開放，Ca2+內流并觸發神經元內一系列生化反應，最終改變突觸后膜的性質，建立LTP。

癲癇與認知功能損害的關系已引起廣泛重視，癲癇發作次數越頻繁，持續時間越長，導致的損害就越大[7]。癲癇的發生、發展與腦內神經遞質失衡有關，谷氨酸是大腦中含量最高的興奮性神經遞質之一，而N-甲基-D-天門冬氨酸受體是一種重要的離子型谷氨酸受體，它在突觸傳遞和神經可塑性等生理過程中扮演了關鍵角色，而突觸可塑性是學習記憶的基礎，因此研究癲癇后NMDA受體表達的變化對闡明其認知障礙發生的機制具有重要的意義[8]。

作為益智安神藥遠志在臨床上的應用已有千年的歷史，遠志總皂苷作為其主要成分[9]，對學習記憶影響的研究也日益受到重視[10]。

本實驗結果顯示模型組大鼠海馬CA1區NMDA受體平均灰度值顯著高于對照組(P<0.05)，遠志防治組大鼠海馬CA1區NMDA受體平均灰度值顯著低于模型組(P<0.05)。結果表明，癲癇模型組大鼠海馬CA1區NMDA受體表達下降，而遠志總皂苷可顯著提高Ep模型大鼠海馬CA1區NMDA 受體的表達。

遠志總皂苷可能通過對癲癇后NMDA受體表達的影響減輕對海馬LTP的抑制，進而改善癲癇后的認知障礙。

參考文獻：

[1]Binder DK，Steinhauser C.Role of astrocyte dysfunction in epilepsy encyclopedia of basic epilepsy research[M].Academic Press，Oxford， 2009：412-417.

[2]Fisher RS，van Emde Boas W，Blume W，et al.Epileptic seizures and epilepsy：definitions proposed by the International League Against Epilepsy(ILAE) and the International Bureau for Epilepsy (IBE)[J].Epilepsia，2005，46：470-472.

[3]陳勤，高晨曦，葛禮浩，等.遠志皂苷對腦定位注射Aβ1-40擬AD大鼠腦內神經形態病理學變化的影響[J].激光生物學報，2006，15(3)：294-298.

[4]焦聚，馬融，任獻青.NMDA受體及其與癲癇所致認知功能損害的關系[J].中國中西醫結合兒科學，2014(3)：215-218.

[5]柯珂，喬琰 ，王俊.NMDA 受體概述及其在學習記憶中的作用[J].廣西科學院學報，2011，27(1)：49- 54.

[6]Durand GM，Kovalchuk Y，Konnerth A.Long-term potentiation and functional synapse induction in developing hippocampus[J].Nature，1996，381：71-75.

[7]Thompson PJ，Duncan JS.Cognitive decline in severe intractable epilepsy[J] .Epilepsia，2005，46(11)：1780-1787.

[8]唐玲，唐榮偉，唐晶，等.突觸可塑性與學習記憶關系的研究進展[J].川北醫學院學報，2012(1)：89-92.

[9]馬彪.遠志總皂苷對癲癇模型大鼠認知功能障礙的影響及其突觸機制[D].太原： 山西醫科大學，2015.

[10]李曉峰，趙大鵬，陳樹沙，等.遠志總皂苷對AD模型大鼠海馬nACHRα4亞基及PSD-95表達的影響[J].神經藥理學報，2011，1(3)：16-22.

(本文編輯王雅潔)

基金項目：山西省青年科技研究基金(No.2013021036-1)，課題名稱：癲癇模型大鼠認知功能障礙突觸機制探討及遠志總皂苷對其影響

通訊作者：李新毅，E-mail：876379752@qq.com

中圖分類號：R285.5

文獻標識碼：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.13.013

文章編號：1672-1349(2016)13-1481-03

(收稿日期：2016-03-16)