MMP-9在心肌缺血再灌注中的作用和機制研究

曲　哲，劉　佩，姚　園

?

MMP-9在心肌缺血再灌注中的作用和機制研究

曲哲，劉佩，姚園

武漢大學人民醫院(湖北武漢 430060)，E-mail：yinh74@126.com

摘要：目的探討血清基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)在心肌缺血再灌注中的表達和作用機制。方法建立大鼠急性心肌缺血再灌注模型，構建MMP-9 siRNA慢病毒，并分為對照組、缺血再灌注(I/R)組、I/R+control-siRNA組、 I/R+MMP-9-siRNA組。觀察并記錄術后28 d各組大鼠生存情況，Western Blot 檢測在大鼠 I/R術后1 d，7 d，14 d，28 d心肌中MMP-9的表達；M型超聲評價各組大鼠心功能改變；Real time PCR法檢測干擾素-γ(IFN-γ)、 白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的變化。結果I/R+ MMP-9 siRNA組大鼠生存率達80%，生存率顯著提高，與I/R組比較，具有統計學意義(P<0.05)。I/R組和I/R+control-siRNA組左室收縮末期內徑(LVESD)、左室舒張末期內徑(LVEDD)以及左心室質量指數(LVMI)增加(P<0.05)，對I/R組大鼠進行MMP-9 siRNA干預后，可見3個指標減少，與I/R組比較，差異具有統計學意義(P<0.05)。I/R術后，MMP-9蛋白表達明顯增加，與術后1 d比較，差異具有統計學意義(P<0.05)。當缺血再灌注時IFN-γ、IL-6、TNF-α急劇增加(P<0.05)，MMP-9 siRNA干預后，可見IFN-γ、IL-6、TNF-α不同程度的減低，與I/R組大鼠比較，差異具有統計學意義(P<0.05)。結論以MMP-9 siRNA作為靶標可減輕缺血再灌注損傷和心室重構，改善心室功能。

關鍵詞：心肌缺血再灌注；基質金屬蛋白酶-9；siRNA；炎性因子

急性心肌梗死(AMI)是臨床上很常見的急危重癥，隨著現代生活節奏的加快，飲食習慣的改變以及人口老齡化和社會、心理等因素的影響，目前我國急性心肌梗死的發病率高達45/10萬～55/10萬[1-2]。急性心肌梗死可導致較長時間心肌組織缺血，當重新恢復血液灌流時，其造成冠脈流量下降，收縮功能降低，血管反應性改變，進而造成更為明顯和嚴重的再灌注損傷和心肌功能障礙，稱為心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)[3]。MIRI過程包括細胞外基質的重構，使得動脈擴張來維持血管正常的張力。激活的駐留成纖維細胞和招募的單核/巨噬細胞釋放細胞因子和生長因子影響細胞外基質的產生和降解。細胞外基質的降解組分進一步招募更多的炎性細胞到損傷組織，其中基質金屬蛋白酶(matrix metallo proteinases，MMPs)是一組依賴于鋅離子的以降解細胞外基質成分作為底物的蛋白水解酶，心肌細胞、心肌成纖維細胞和巨噬細胞均能分泌MMPs[4-5]。本研究擬通過心肌缺血再灌注大鼠模型心肌MMP-9的表達，分析其在缺血再灌注損傷中的作用和機制，為將MMP-9作為診斷、治療和評估預后的生物標記物提供依據。

1材料與方法

1.1材料與儀器PVDF膜購自Pall Life Sciences公司，Western blot相關化學試劑購自上海碧云天生物技術有限公司，ECL試劑購自Amersham Biosciences公司，兔抗鼠 MMP9單抗，羊抗兔辣根過氧化物酶(HRP)標記IgG二抗購自美國Cell signaling公司。RNA提取試劑盒，反轉錄試劑盒，lipo2000試劑購自美國Invitrogen公司。手術器械和顯微鏡購自上海醫用儀器廠。酶標儀購自美國BD公司。DNA擴增儀購自美國PE Gene Amp PCR System 2400。其他常用試劑購自上海生工生物有限公司。

1.2實驗動物選取清潔級 Wistar 大鼠80只，雄性，鼠齡6周～8周，體重 230 g±20 g。由本院實驗動物中心提供。嚴格遵守無特殊病原菌(SPF)要求分籠飼養。本研究經醫學倫理委員會批準進行。

1.3方法

1.3.1動物分組實驗動物常規適應性飼養1周后進行實驗。取同批次同周齡的大鼠按照體重標記后，以隨機數字表法將大鼠隨機分為4組，每組20只。 對照組； 缺血再灌注(I/R)組； I/R+control-siRNA組；I/R+MMP-9-siRNA組。

1.3.2大鼠急性心肌缺血再灌注模型麻醉后，將大鼠仰臥位固定四肢于操作臺上。胸前區脫毛，手術區消毒，經口明視下氣管插管，呼吸機輔助呼吸(潮氣量4 mL 、呼吸頻率80 次/min)。經胸骨左側第四肋間開口，鈍性分離皮下肌肉，暴露心臟。以7-0 尼龍線穿過左心耳下緣(1～2)mm 處的2/3 心肌層，結扎左側冠脈，實驗過程中心電圖實時監測，以大鼠心肌顏色變白且心電圖ST 段持續弓背抬高(>1/2 R波)呈單峰曲線作為模型成功標志。結扎45 min后，去除塑料管，撤除結扎線。以心肌恢復紅潤且ST 段下降作為再灌注模型成功標志。

1.3.3MMP-9 siRNA慢病毒構建及包裝針對基質金屬蛋白酶8靶基因設計siRNA序列，序列由Santa Cruz合成，序列號sc-35950，由3個靶向特異性的含20～25堿基的siRNA構成；control siRNA是非靶向20～25 nt siRNA，序列號 sc-37007。合成小發卡RNA(short hairpin RNA，siRNA)結構的DNA，與經AgeΙ和EcoRΙ酶切的pSIL-RFP連接、轉化大腸桿菌感受態細胞，構建成攜帶MMP-9-siRNA慢病毒質粒載體(pSIL-RFP/MMP9-siRNA)，PCR及測序鑒定后，Western blot篩選出攜帶最佳siRNA的慢病毒質粒載體，并利用慢病毒包裝質粒(pHelper1.0和pHelper2.0)將其制備成MMP8-siRNA慢病毒，并測定病毒滴度為1×1010pfu/L。PCR和DNA測序證實合成的含基質金屬蛋白酶8短發卡RNA慢病毒載體寡核苷酸鏈正確插入pSIL-RFP載體，表明實驗成功構建基質金屬蛋白酶8的RNA干擾慢病毒表達載體。

1.3.4Western blot檢測MMP-9蛋白表達變化Western Blot 檢測在大鼠 I/R術后1 d，7 d，14 d，28 d心肌中MMP-9的表達。取心肌提取蛋白：加裂解液，在冰上裂解并研磨15 min～30 min，5 s × 4次超聲破碎細胞，4 ℃離心15 min，轉移上清至新的Ep 管中，蛋白定量后于-20℃保存，用于Western blot實驗。分離蛋白利用10% SDS-PAGE電泳，并將膠用半干轉膜法轉移至PVDF膜，去除非特異性背景利用室溫，5% 脫脂奶粉作用，2 h。分別加入一抗1∶1 000 稀釋的HPV16 E7單抗，搖床，4℃，過夜，PBST洗滌，室溫，避光條件下加入1∶2 000羊抗兔二抗，孵育30 min，PBST洗滌，化學發光劑顯色1 min，X片曝光成像，觀察結果。利用蛋白圖像處理系統軟件和Quantity one軟件分別掃描X膠片和條帶密度測定。分別重復實驗四次，統計分析。

1.3.5各組大鼠形態學和生存狀態分析觀察各組大鼠形態學變化，記錄大鼠生存狀況，并于術后28 d記錄各組大鼠生存率。

1.3.6評價各組大鼠I/R術后心功能改變分別于術后28 d利用M型超聲評價各組大鼠I/R術后心功能改變，左心室質量指數，心室收縮及舒張內徑。仰臥位固定實驗大鼠，右手持15L8超聲探頭，將超聲探頭置于大鼠胸骨旁，取胸骨旁左室短軸乳頭肌水平切面，獲得清晰2D圖像后，轉換M型超聲心動圖，轉動軌跡球，測量左室舒張末內徑(LVEDD)和左室收縮末內徑(LVESD)，并根據公式計算左心室質量指數。

1.3.7Real-time PCR檢測大鼠干擾素-γ(IFN-γ)、白介素-6(IL-6)、TNF-α表達變化依據基因序列合成引物，引物合成由上海英駿生物技術有限公司完成(見表1)。采用Trizol試劑提取各組心肌細胞，根據試劑盒說明，進行DNA反轉錄合成。對目的基因進行Real-time PCR檢測。反應條件：55℃ 1 min，92 ℃ 30 s，58℃ 45 s，72 ℃ 35 s，共進行35個循環。進行數據收集，利用PCR反應儀軟件，將GAPDH為參照，根據熒光定量，計算出所有樣品以及標準品的起始循環數(CT)，以標準品CT值為依據，繪制出標準曲線，再根據2-△Ct法進行半定量分析。

表1　引物序列

2結果

2.1各組大鼠大體觀察和生存率分析對照組大鼠仍保持正常狀態，皮毛柔順光滑，發育正常，飲食、精神狀況正常，反應靈敏；缺血再灌注(I/R)組大鼠于術后出現精神萎靡不振，反應遲緩，毛發稀疏光澤度減少，飲食不佳，且出現發紺以及肢端水腫；I/R+control-siRNA組大鼠狀態類似于缺血再灌注組大鼠；而I/R+ MMP-9 siRNA組可見MMP-9 siRNA干預后，大鼠飲食恢復較好，精神狀況、活動狀況隨著干預時間的延長而轉好，皮毛較對照組光滑，且稀疏程度減少。I/R+MMP-9 siRNA組大鼠生存率達80%，生存率顯著提高，與I/R組比較，具有統計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2　各組大鼠生存率分析

2.2MMP-9siRNA對I/R大鼠術后心功能改變的影響利用M型超聲評價在術后28 d對各組大鼠心功能進行評估，發現在I/R后，心臟功能發生明顯改變，左室收縮末期內徑和左室舒張末期內徑在術后出現增加，與對照組比較差異具有統計學意義(P<0.05)，而control-siRNA組兩個指標也顯著增加，與對照組比較差異具有統計學意義(P<0.01)，當對I/R組大鼠進行MMP-9siRNA干預后，可見LVESD和LVEDD出現減小，與I/R組比較，差異具有統計學意義(P<0.05)。同樣，左心室質量指數(LVMI)出現與LVESD和LVEDD相似的變化，即I/R組和control-siRNA組顯著增加，與對照組比較有統計學意義；而經MMP-9siRNA干預后，可見降低，與I/R組比較，差異具有統計學意義(P<0.05)，說明I/R后心功能出現顯著降低，而經MMP-9- siRNA干預可顯著改善心功能指標。詳見表3。

表3　MMP-9siRNA干預后對I/R大鼠心功能的影響(±s)

2.3MMP-9在I/R大鼠心肌中的表達變化提取心肌組織蛋白，利用Western Blot 檢測在大鼠心肌中 I/R術后1 d，7 d，14 d，28 d MMP-9的表達變化。在大鼠心肌中 I/R術后，MMP-9蛋白表達明顯增加，術后14 d和28 d表達增加明顯，與術后1 d比較，差異具有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，說明心肌組織中MMP-9蛋白的表達在缺血再灌后隨著時間的延長而增加(見圖1、圖2)。

圖1　MMP-9在I/R大鼠心肌中的表達變化

注：與術后比較，*P<0.05，**P<0.01

2.4MMP-9對I/R大鼠炎性因子表達的影響進一步利用Real time PCR法檢測干擾MMP-9表達對I/R大鼠炎性因子表達的影響。當缺血再灌注時IFN-γ、IL-6、TNF-α急劇增加，與對照組比較，差異具有統計學意義(P<0.05)，MMP-9- siRNA干預后，可見IFN-γ、IL-6、TNF-α不同程度的減低，與I/R組大鼠比較，差異具有統計學意義(P<0.05)。詳見圖3～圖5。

注：與對照組比較，*P<0.05；與I/R組比較，#P<0.05。

注：與對照組比較，*P<0.05；與I/R組比較，#P<0.05。

注：與對照組比較，*P<0.05；與I/R組比較，#P<0.05。

3討論

心肌缺血再灌注損傷，可出現一系列治療后病情惡化現象，尤其表現在急性心肌梗死經PCI治療后，可以表現為心功能不全、嚴重心律失常、心源性休克、心功能衰竭、心源性猝死等。心肌缺血再灌注損傷可進一步發生心臟重構，甚至引起心力衰竭、心臟破裂等嚴重并發癥[6-8]。 心肌缺血再灌注損傷發生的相關機制尚未完全闡明，同時如何減輕心肌缺血再灌注損傷也成為目前醫學界研究熱點之一[9]。關于MIRI發生機制的研究眾多，目前主流有三個學說，包括白細胞損傷學說、鈣離子學說、自由基損傷學說，由炎癥反應，鈣離子的參與，以及細胞損傷壞死等造成自由基損傷，從而引起觸發級聯放大式效應，引起一系列病理生理過程[10-12]。

眾多基質金屬蛋白酶家族的表達和活性均有所變化，例如在心肌梗死中可見到MMP-2的含量增加，而其活性也明顯提高，并證明其中發揮重要病理作用。有實驗表明，在動物心肌梗死模型以及心肌梗死發生左室重構的病人中，可以見到MMP-1、MMP-2、MMP-3的表達增加，活性亦有所增強。研究發現，MMP-1表達水平在高血壓心肌肥厚組與非肥厚組進行比較明顯降低，而且MMP-1活性在心肌肥厚的高血壓病病人中降低的更明顯[13]。本研究證實，在I/R損傷動物模型中，MMP-9的表達增加，且隨著損傷的時間延長而增加更加明顯。MMP-9的表達增加，大鼠死亡率也明顯增加，經MMP-9siRNA干預后，可見大鼠精神狀態轉好、飲食恢復較好，活動能力增強，而死亡率與I/R組比較有明顯減少。

細胞外基質ECM的合成與降解保持動態平衡，而在研究中證實基質金屬蛋白酶家族和/或 TIMP 表達和活性改變，平衡被打破，ECM 過度沉積過多，導致心肌間質纖維化和血管重塑，血管周圍纖維化，因此使心室心肌順應性進一步下降，心肌收縮功能下降，導致心臟衰竭的發生[14]。本研究結果證實，缺血再灌注大鼠心臟功能發生明顯改變，左室收縮末期內徑和左室舒張末期內徑在缺血再灌注術后出現增加，當對I/R組大鼠進行MMP-9- siRNA干預后，可見左室收縮末期內徑和左室舒張末期內徑出現減小，而代表心肌功能改變的左室質量指數顯著增加，結果與以往研究一致，說明缺血再灌注心功能出現顯著降低。但經MMP-9- siRNA干預可顯著改善心功能指標。

心肌損傷后炎癥以及免疫應答均參與其中，因此可在心肌缺血再灌注損傷過程中發揮作用。炎癥過程中巨噬細胞可通過吞噬壞死細胞以及組織碎片，或直接分泌細胞因子、生長因子等調節其他細胞參與免疫應答以及心肌缺血再灌注損傷的調節，再膠原合成、分泌、瘢痕形成、炎癥發生等。基質金屬蛋白酶家族以及組織型基質金屬蛋白酶抑制劑也主要作用在細胞外基質，參與合成分泌炎性因子等作用，而炎性細胞因子分泌增加，促進炎癥發生，導致細胞外基質的大量損失[15-16]。本研究證實當缺血再灌注時IFN-γ、IL-6、TNF-α急劇增加，MMP-9- siRNA干預后，可顯著抑制IFN-γ、IL-6、TNF-α的分泌，說明干預MMP-9有利于減輕心肌缺血再灌注引起的炎癥反應。

本研究證實以MMP-9為靶點，進行 siRNA干預，可減少炎性因子分泌，減輕炎癥反應，可能對抑制缺血再灌注的損傷，逆轉血管重構有較好作用，為臨床預防、診治心肌缺血再灌注損傷的分子靶點選擇提供理論依據。

參考文獻：

[1]Li XD，Yang YJ，Hao YC，et al.Effect of pre-procedural statin therapy on myocardial no-reflow following percutaneous coronary intervention：a meta analysis [J].Chinese Medical Journal，2013，126：1755-1760.

[2]Bolognese L，Neskovic AN，Parodi G，et al.Left ventricular remodeling after primary coronary angioplasty：patterns of left ventricular dilation and long-term prognostic implications [J].Circulation，2002，106：2351-2357.

[3]Zhou X，Chen M，Wang S，et al.MG53 protein：a promising novel therapeutic target for myocardial ischemia reperfusion injury [J].Int J Cardiol，2015，199：424-425.

[4]Bencsik P，Sasi V，Kiss K，et al.Serum lipids and cardiac function correlate with nitrotyrosine and MMP activity in coronary artery disease patients [J].Eur J Clin Invest，2015，45(7)：692-701.

[5]Barteková M，?imon?ìkovP，Fogarassyová M，et al.Quercetin improves postischemic recovery of heart function in doxorubicin-treated rats and prevents doxorubicin-induced matrix metalloproteinase-2 activation and apoptosis induction [J].Int J Mol Sci，2015，16(4)：8168-8185.

[6]Carrabba N，Parodi G，Valenti R，et al.Prognostic value of reverse left ventricular remodeling after primary angioplasty for stemi [J].Atherosclerosis，2012，222：123-128.

[7]Waldo SW，Li Y，Buono Cl.Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques [J].Am J Pathol，2008，172(4)：1112-1126.

[8]Givvimani S，Kundu S，Narayanan N，et al.TIMP-2 mutant decreases MMP-2 activity and augments pressure overload induced LV dysfunction and heart failure [J].Arch Physiol Biochem，2013，119(2)：65-74.

[9]Koenig GC，Rowe RG，Day SM，et al.MT1-MMP-dependent remodeling of cardiac extracellular matrix structure and function following myocardial infarction [J].Am J Pathol，2012，180(5)：1863-1878.

[10]Jaffré F，Friedman AE，Hu Z，et al.β-adrenergic receptor stimulation transactivates protease-activated receptor 1 via matrix metalloproteinase 13 in cardiac cells [J].Circulation，2012，125(24)：2993-3003.

[11]Ikeda J，Ichiki T，Matsuura H，et al.Deletion of phd2 in myeloid lineage attenuates hypertensive cardiovascular remodeling [J].J Am Heart Assoc，2013，2(3)：e000178.

[12]Kothari P，Pestana R，Mesraoua R，et al.IL-6-mediated Induction of matrix metalloproteinase-9 is modulated by JAK-dependent IL-10 expression in macrophages [J].J Immunol，2013，11(3)：144-151.

[13]Fertin M，Lemesle G，Turkieh A，et al.Serum MMP-8：a novel indicator of left ventricular remodeling and cardiac outcome in patients after acute myocardial infarction [J].PLoS One，2013，8(8)：e71280.

[14]Chakraborty M，Kamath JV.Pharmacodynamic interaction of green tea extract with hydrochlorothiazide againsti schemia-reperfusion injury-induced myocardial infarction [J].J Adv Pharm Technol Res，2014，5(3)：134-139.

[15]Lim SH，Kim MY，Lee J.Apple pectin，a dietary fiber，ameliorates myocardial injury by inhibiting apoptosis in a rat model of ischemia/reperfusion [J].Nutr Res Pract，2014，8(4)：391-397.

[16]Gupta A，Kaur CD，Jangdey M，et al.Matrix metalloproteinase enzymes and their naturally derived inhibitors：novel targets in photocarcinoma therapy [J].Ageing Res Rev，2014，13：65-74.

(本文編輯王雅潔)

中圖分類號：R542.2R285.5

文獻標識碼：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.13.014

文章編號：1672-1349(2016)13-1483-05

(收稿日期：2015-08-12)

The Effects and Mechanisms of MMP-9 on Myocardial Ischemia Reperfusion Injury

Qu Zhe，Liu Pei，Yao Yuan

Renmin Hospital of Wuhan University， Wuhan 430060，Hubei，China

Abstract：ObjectiveTo explore the expression， effects and mechanisms of matrix metallo proteinases 9(MMP-9)on myocardial ischemia reperfusion injury (MIRI).Methods Acute myocardial ischemia reperfusion rat models and MMP-9 siRNA lentivirus were established.The animals were divided into control group，ischemia reperfusion group(I/R group)，I/R+control-siRNA group，I/R+MMP-9-siRNA group.The survival rate was observed after 28 days of operation.The changes of heart function were analyzed by M type ultrasonics.MMP-9 expression in the myocardium after 1 d，7 d，14 d，28 d after operation was detected by western blot.Real-time PCR was used to detect M1 macrophage markers interferon-gamma (IFN-γ)，interleukin-6(IL-6)，tumor necrosis factor-alpha (TNF-α).Results The survival rate in I/R+MMP-9 siRNA group significantly increased compared with I/R group (P<0.05).LVESD and LVEDD in I/R group and I/R+control-siRNA group increased with significant difference compared with the control group(P<0.05).After MMP-9 siRNA treatment，LVESD and LVEDD reduced significantly compared with I/R group(P<0.05).Similar changes could be seen in left ventricular mass index(LVMI).MMP-9 protein increased significantly after 14 days and 28 days of operation (P<0.05).The levels of IFN-γ，IL-6，TNF-α increased dramatically in I/R group and reduced at different degrees after MMP-9 siRNA treatment compared with I/R group (P<0.05).Conclusion MMP-9 can participate in MIRI and ventricular remodeling.MMP-9 siRNA can reduce the cardiac injury and improve ventricular function.

Key words：myocardial ischemia reperfusion injury；matrix metallo proteinases 9；siRNA；inflammatory cytokines