黃芪注射液加強心肌保護液在兔未成熟心肌保護作用的研究

張　霄，李志英

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黃芪注射液加強心肌保護液在兔未成熟心肌保護作用的研究

張霄1，李志英2

1. 山西醫科大學(太原 030001)；2. 山西醫科大學第一醫院

摘要：目的探討黃芪注射液加強心肌保護液對未成熟兔心肌的保護作用。方法24只幼兔(兔齡14 d～21 d)隨機分3組，每組8只。用Langendorff模型灌注離體心臟。平穩灌注45 min后，主動脈根部灌注STH液(4℃)。對照組(Con)：灌注STH液；黃芪組(AS)：黃芪注射液+STH灌注；5-羥葵酸液(5-HD)組：5-HD+STH灌注。3組心臟均經歷停灌30 min(保溫、保濕)及再灌注40 min復制模型。觀察3組的血流動力學、心肌酶、冠脈流出液、病理學變化、心肌能量變化及分子生物學改變。結果黃芪組左心功能、冠脈流量恢復及再灌后心肌組織內ATP含量明顯優于對照組及5-HD組，心肌酶值明顯低于對照組及5-HD組，心肌細胞線粒體超微結構分析顯示預處理組線粒體損傷輕于對照組及5-HD組，心肌誘導型一氧化氮合酶(iNOS)AS組78.4 ng，高于對照組20.8 ng及5-HD組61.8 ng。結論黃芪加強心肌保護液對兔未成熟心肌有保護作用，黃芪可能是KATP通道開放劑。

關鍵詞：黃芪注射液； 心肌保護液； 未成熟兔心肌；5-羥葵酸； KATP通道

黃芪為豆科多年生草本植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus (Fisch) Bge Var Mongholicus (Bge) Hsiao 或膜莢黃芪Astragalus membranaceus (Fisch) Bge的干燥根。藥性甘，微溫、歸脾、肺經。功效為生陽補氣，固表益衛，消腫利水，托瘡生肌。目前在臨床上已廣泛應用且取得了很好的療效。本實驗探討黃芪注射液加強心肌保護液對未成熟兔心肌的保護作用，及是否對ATP依賴鉀離子通道(KATP)通道有作用，并從機制上加以討論。

1材料與方法

1.1實驗儀器與試劑多導生理記錄儀(Macintosh，Quadra 610，Japan；Chart 3.6v/s)，恒溫循環器(HX-10555，北京)，改良Langendorff 裝置，Stocker血泵(Gemany)，混合氣(O2∶CO2=95%∶5%，北京)，超純水(SZ-93自動雙重純水蒸餾器，上海)。Krebs-Henseleit重碳酸鹽緩沖液成分：NaCl 118.5、NaHCO325.0、KH2PO41.2、KCl 4.8、MgSO4·7H2O 1.2、CaCl2·2H2O 1.8、葡萄糖 11.0。pH 7.4±0.5。黃芪注射液為成都地奧公司生產，每毫升含原生藥2 g。5-羥葵酸(5-hydroxydecanoic acid， 5-HD)編號H135，美國sigma公司。

1.2實驗模型建立實驗兔為中國醫學科學院協和醫科大學實驗動物中心提供(純種新西蘭白兔)。兔重300 g～350 g，兔齡14 d～21 d。氨基甲酸乙酯腹腔麻醉(1.5 g/kg)，經股靜脈肝素化(150 IU/kg)，劍下開腹腔，沿前胸壁充分游離膈肌，雙側橫斷肋骨，胸腔完全暴露，迅速剪開壁層心包，小心快速取出心臟，浸入4℃K-H緩沖液(KHB)，主動脈略修剪， 30 s內連于Langendorff灌注裝置并用39℃經混合氣(O2∶CO2=95%∶5%)平衡的K-H緩沖液灌注，在肺動脈根部剪開以保證冠脈回流通暢，灌注壓60 cmH2O(1 cmH2O=0.098 kpa)。剪開左心耳，向左室插入與多導生理檢測儀相連的帶球囊導管，立即將心臟移入保溫(39℃)缸內。

1.3實驗分組及步驟平穩灌注30 min后，向球囊內緩慢注入生理鹽水，調整至左室舒張壓(LVDP)為10 mmHg(1 mmHg=0.133 kpa)。將18只幼兔隨機分為3組。主動脈根部灌注對照組(CON)：灌注STH液；黃芪組(AS)：AS(2 mL/kg)+STH液灌注；5-HD組：5-HD(100 μmol/L)+STH灌注。3組心臟均經歷停灌30 min(保濕、保溫)、再灌注45 min。

1.4測定指標平穩灌注30 min時，記錄冠脈流量(CF)、心率(HR)、LVDP、左室壓力上升和下降最大速率(±dp/dtmax)作為基礎值。全程記錄再灌注后左室波動圖形；分別記錄再灌后5 min、10 min、15 min、30 min、45 min的CF、HR、LVDP、±dp/dtmax測定值，并把它們表達為其對基礎值的恢復率。取再灌注后10 min冠脈流出液，以自動生化分析儀(日立，T170A型)測定肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)；乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)。再灌注畢，快速取下心臟，濾紙吸盡心臟表面水分，剪取心尖部位約200 mg組織液氮保存，用以測定ATP。每組隨機取一例左室心肌作電鏡及用分子生物學方法測定誘導型一氧化氮合酶(iNOS)。

2結果

2.1血流動力學變化平衡期末，3組各項血流動力學指標無統計學意義。再灌后，黃芪組LVDP、±dp/dtmax在多個時間點上的恢復率均較對照組及5-HD組顯著性增高(P<0.05)。加入5-HD后其保護作用減弱，甚至消失。詳見表1。

表1　各組STH灌注后血流動力學恢復情況比較(±s) 　%

2.2心肌酶缺血復灌5 min后心肌酶值以AS組最低，對照組及5-HD組復灌后心肌酶值明顯升高。詳見表2。

IU/L

2.3心肌組織內ATP含量AS組心肌組織內ATP含量明顯較對照組及5-HD組高。AS組(35.93±7.83)μg/(g· wet)，與CON組比較有統計學意義(P<0.01)；5-HD組(22.34±2.79)μg/(g·wet)，與CON組比較無統計學意義(P>0.05)；對照組為(15.55±1.98)μg/(g·wet)。

2.4形態學改變透射電鏡觀察顯示：對照組心肌結構尚清。部分線粒體空泡變性，腫脹；部分心肌肌原纖維排列較散亂，肌節長度不一，有灶狀肌絲溶解破壞；部分線粒體內出現致密沉積物，肌質網擴張。黃芪預處理組：心肌結構清楚；肌原纖維排列整齊；肌節結構較清晰，部分肌節縮短，H帶結構不清，少數區域肌纖維肌節有破壞，Z線模糊；線粒體數量相對較少，個別區域輕度空泡變性；肌質網輕度擴張；未見糖原蓄積?？傮w印象：黃芪組心肌損傷較對照組減輕。5-HD組介于以上兩組之間。

2.5iNOS改變用PCR法測定相對含量為：AS組78.4 ng；5-HD組61.8 ng；對照組20.8 ng。

3討論

黃芪為傳統中藥，黃芪注射液臨床用于冠心病、心絞痛、竇緩等的治療療效顯著。黃芪對心肌的缺血再灌注損傷有保護作用，能降低心率、縮小心肌缺血范圍，維持內皮細胞自穩態，顯著改善心肌缺血再灌注時左室的舒張及收縮功能，還具有清除氧自由基和抗脂質過氧化、減輕鈣超載、減輕白細胞聚集等作用。

黃芪預處理對未成熟心肌有保護作用[1]，其保護作用是通過啟動內源性保護機制來完成的。黃芪是ATP依賴鉀離子通道的開放劑[2]。開放細胞膜KATP通道能縮短心肌細胞的動作電位，并由此引發保護效應。位于線粒體內膜的KATP通道在預處理過程中也發揮著重要的作用。5-羥葵酸是線粒體KATP通道的特異性阻斷劑。將黃芪加入St.ThomasⅡ號心肌保護液中，了解線粒體KATP通道能否開放，是否同樣能增強心肌保護液對未成熟兔心肌的保護作用。結果顯示，AS組無論在左心收縮舒張功能、心率、冠脈流量的恢復，還是在減少再灌后心肌酶值等方面均較單純應用心肌保護液組及5-HD組好。AS組的組織ATP含量較對照組及5-HD組明顯提高。電鏡觀察AS組心肌損傷較對照組及5-HD組減輕，分子生物學方法測定iNOS半定量，AS組明顯高于對照組及5-HD組。

線粒體不僅是細胞能量的供應站，并且具有很強的緩沖心肌細胞胞漿內Ca2+的能力。線粒體內膜內負外正的電位差是線粒體吸收Ca2+的主要動力。線粒體KATP通道在缺血過程中開放對心肌產生保護的機制可能與該通道開放后K+內流使線粒體內膜電位發生去極化有關；線粒體內膜電位絕對值降低，減小了Ca2+進入線粒體基質的動力，防止了線粒體鈣超載的發生。目前越來越多的實驗發現伴隨著缺血再灌注損傷是線粒體的鈣超載而不是細胞漿內的鈣超載。同時，隨著K+內流，線粒體內滲透壓升高，胞漿水分進入線粒體內引起線粒體基質膨脹；研究表明線粒體體積適度(10%以內)的增加能激活脂肪酸氧化和電子轉移，促進ATP的生成。此外，線粒體KATP通道開放還能減少線粒體內氧自由基的生成。

黃芪對未成熟兔心肌有保護作用的機制為黃芪可以激發未成熟兔心肌細胞啟動內源性保護：①腺苷生成增加：停跳液中加入黃芪注射液，可使缺血后心肌組織的內源性腺苷釋放明顯增加，實現腺苷多方面的心肌保護作用[3-4]。②NO濃度增加：心肌細胞缺血早期，當細胞內環磷酸鳥苷(cGMP)/環磷酸腺苷(cAMP)比值下降時，可刺激心肌細胞和內皮細胞產生緩激肽，進而作用于內皮細胞的緩激肽B2受體產生NO，緩激肽和NO均有保護心肌作用；iNOS的激活可能參與預處理的延遲保護(DP)作用。NO與缺血再灌注損傷有密切關系，其作用機制可能是通過阻礙中性粒細胞的黏附而減輕缺血再灌注損傷程度[5]。黃芪可以提高再灌注后未成熟兔心肌iNOS的含量。③開放ATP依賴鉀離子通道。對KATP通道作用機制可能為：KATP通道對K+具有高度選擇性，具有時間和電壓不依賴性，開放和關閉狀態只受ATP濃度的控制。本實驗顯示黃芪可以明顯提高心肌組織ATP含量，而5-HD組ATP含量則明顯減少，即5-HD阻斷了KATP通道，減弱了黃芪的作用，甚至消失；進而證實黃芪對未成熟心肌的保護可能是通過開放KATP通道而實現的。研究發現缺血再灌注損傷是線粒體的鈣超載而非細胞漿內的鈣超載[6]，K+內流使線粒體內膜電位發生去極化，線粒體內膜電位絕對值降低，減小了Ca2+進入線粒體基質的動力，防止了線粒體鈣超載的發生；線粒體體積適度增加(10%以內)，會促進ATP的生成[7]。隨著K+內流，線粒體內滲透壓升高，胞漿水分進入線粒體內引起線粒體基質膨脹，ATP生成增多[8-10]。黃芪可能是通過開放線粒體膜KATP通道、K+內流使線粒體內膜電位發生去極化，阻止Ca2+進入線粒體基質，防止線粒體鈣超載，同時使線粒體體積適度增加，ATP的生成增多而起到保護未成熟兔心肌的作用。

黃芪加強停跳液通過增強線粒體KATP通道的開放對未成熟兔心肌有保護作用，但對其機制仍不十分清楚，須進一步深入研究。

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(本文編輯王雅潔)

通訊作者：李志英，E-mail：leezhiyingcpb@sina.com

中圖分類號：R285.5

文獻標識碼：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.13.016

文章編號：1672-1349(2016)13-1491-03

(收稿日期：2016-05-25)