激活VEGF-C/VEGFR-3信號通路調(diào)控淋巴管生成對慢性結(jié)腸炎的影響

趙　靜　王曉蕾

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激活VEGF-C/VEGFR-3信號通路調(diào)控淋巴管生成對慢性結(jié)腸炎的影響

趙靜王曉蕾

200065上海，同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院消化內(nèi)科

炎癥性腸病(IBD)是一組病因及發(fā)病機(jī)制尚未明確的慢性非特異性腸道炎性疾病，主要包括克羅恩病(CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(UC)。近年來研究表明，IBD的發(fā)病及病情遷延與淋巴管生成有關(guān)。早在20世紀(jì)初期就有大量報(bào)道指出CD患者的病變腸道中可見淋巴管阻塞、組織水腫等表現(xiàn)，表明慢性淋巴管炎的存在。但目前關(guān)于淋巴管與IBD的病情進(jìn)展與維持的關(guān)系研究并不多。腫瘤、皮膚慢性炎性反應(yīng)實(shí)驗(yàn)研究顯示，淋巴管特異性血管內(nèi)皮生長因子受體3(VEGFR-3)可經(jīng)血管內(nèi)皮生長因子-C(VEGF-C)激活，促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和淋巴管新生，在腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、促進(jìn)炎癥引流方面有一定作用。因此，本研究將以葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的小鼠慢性結(jié)腸炎模型為研究對象，通過高表達(dá)VEGF-C激活VEGFR-3信號通路，檢測小鼠疾病活動指數(shù)(DAI)、結(jié)腸組織病理學(xué)評分、淋巴管密度(LVD)及管徑大小的變化，探討淋巴管生成對慢性結(jié)腸炎的影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物

8～10周齡健康雌性C57BL/6小鼠25只，購于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司，飼養(yǎng)于上海市同濟(jì)醫(yī)院SPF級動物實(shí)驗(yàn)室，溫度維持在20℃～24℃，相對濕度維持在40%～70%，12 h光照再12 h黑暗。

1.2慢性結(jié)腸炎模型制備及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以無菌純水配制的2% DSS溶液飼喂小鼠5 d后更換為無菌純水飼喂5 d，此作為一個(gè)循環(huán)，重復(fù)飼喂3個(gè)循環(huán)建立慢性結(jié)腸炎模型。正常組(5只)小鼠不進(jìn)行處理；DSS模型組(10只)小鼠依上述方法誘導(dǎo)慢性結(jié)腸炎模型；高表達(dá)VEGF-C腺病毒(Ad-VEGF-C-EGFP)刺激組(10只)小鼠建立慢性結(jié)腸炎模型，且于每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)尾靜脈注射Ad-VEGF-C-EGFP(5×108～5×109pfu/mL) 100 μL。3個(gè)循環(huán)結(jié)束后第7 天處死小鼠，留取全結(jié)腸標(biāo)本。所有小鼠均自由取食滅菌飼料，DSS溶液隔天更換。

1.3Ad-VEGF-C-EGFP構(gòu)建及主要試劑

1.4DAI監(jiān)測

在建模過程中，隔日觀察并記錄小鼠的體質(zhì)量、糞便性狀、腸道出血情況這3個(gè)指標(biāo)，計(jì)算小鼠DAI得分，間接評價(jià)結(jié)腸炎性反應(yīng)的嚴(yán)重程度。DAI評分標(biāo)準(zhǔn)如下：體質(zhì)量減輕程度(無減輕為0分，1%～5%為1分，5%～10%為2分，10%～20%為3分，>20%為4分)，糞便性狀(正常為0分，松散糞便為2分，腹瀉為4分)，腸道出血情況(無出血為0分，糞便隱血為2分，肉眼血便為4分)；DAI得分即為上述指標(biāo)總和[1]。

1.5組織病理學(xué)評分

取遠(yuǎn)端結(jié)腸組織(0.5 cm)于4%甲醛溶液中固定，常規(guī)處理切片后經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)染色，觀察結(jié)腸組織炎性反應(yīng)的嚴(yán)重程度。組織病理學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)如下：隱窩結(jié)構(gòu)(正常為0分，嚴(yán)重的隱窩變形為3分)，炎性細(xì)胞浸潤程度(正常為0分，稠密的炎性細(xì)胞浸潤為3分)，肌層增厚情況(隱窩基底位于黏膜肌層上為0分，肌層顯著增厚為3分)，杯狀細(xì)胞損失(無為0分，有為1分)，隱窩膿腫(無為0分，有為1分)；組織病理學(xué)得分即為上述指標(biāo)總和。

1.6結(jié)腸LYVE-1免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果評估

標(biāo)本取自遠(yuǎn)端結(jié)腸組織，切片(4 μm)常規(guī)脫蠟，置檸檬酸鈉溶液中微波爐加熱進(jìn)行抗原修復(fù)，切片經(jīng)3%牛血清蛋白室溫封閉后，依次孵育兔抗鼠LYVE-1多克隆抗體(1∶200)及酶標(biāo)山羊抗兔二抗。經(jīng)DAB顯色后，常規(guī)脫水、透明、封片。LYVE-1表達(dá)陽性的管腔即為淋巴管[2-3]。光學(xué)顯微鏡(×100)下觀察LYVE-1陽性管腔。每張片子選取5處淋巴管高密度區(qū)，計(jì)數(shù)該區(qū)域LYVE-1陽性管腔數(shù)，取平均值即為LVD，同時(shí)測量淋巴管的管徑大小(取長徑)，比較各組間LVD及管腔擴(kuò)張。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)圖片由GraphPad Prism 5.0處理生成。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

回到家，我趕緊把這個(gè)好消息告訴爸爸媽媽。媽媽表揚(yáng)了我，并答應(yīng)送我一個(gè)禮物。我有些得意忘形，把頭轉(zhuǎn)向爸爸，期待他的表揚(yáng)。沒想到，他只是輕描淡寫地看了一眼，臉上的神情很冷淡，“考得不怎么樣，簡答題還不夠完整?！?/p>

2結(jié)果

2.1體外VEGF-C表達(dá)

以Ad-VEGF-C-EGFP及Ad-EGFP轉(zhuǎn)染人胚腎293細(xì)胞，RT-qPCR檢測體外VEGF-C表達(dá)。結(jié)果顯示，與Ad-EGFP感染細(xì)胞、未感染細(xì)胞相比較，Ad-VEGF-C-EGFP感染293細(xì)胞中VEGF-C蛋白的表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

2.2小鼠DAI的變化

統(tǒng)計(jì)分析顯示，與正常組(0.03±0.02)相比較，VEGF-C組小鼠(1.94±0.15)、DSS組(2.52±0.21)的DAI明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；VEGF-C組小鼠DAI相較于DSS組明顯下降，尤其在實(shí)驗(yàn)第9天、第15天、第27天的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3結(jié)腸組織病理學(xué)評分

光鏡下每張HE染色片子隨機(jī)選取3個(gè)視野，依據(jù)上述評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分，取平均值作為該結(jié)腸組織的病理學(xué)得分。光鏡下可見DSS組、VEGF-C組結(jié)腸均出現(xiàn)隱窩結(jié)構(gòu)變形紊亂、炎性細(xì)胞浸潤、杯狀細(xì)胞缺失、黏膜下水腫改變(見圖1)。統(tǒng)計(jì)分析顯示，與正常組(0.67±0.58)相比較，DSS組(7.67±0.58)、VEGF-C組(4±0.71)的組織損傷較明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與VEGF-C組相比較，DSS組的組織病理學(xué)得分更高(P<0.01)。

圖1結(jié)腸HE染色及組織病理學(xué)得分ADSS組(×100)BVEGF-C組(×200)C各組結(jié)腸組織病理學(xué)得分

2.4結(jié)腸淋巴管數(shù)量及分布情況

光鏡下免疫組織化學(xué)切片顯示，與正常組相比較，DSS組與VEGF-C組的LVD有所增加，且VEGF-C組結(jié)腸淋巴管的管腔擴(kuò)張更明顯(見圖2)。統(tǒng)計(jì)分析顯示，與正常組(16.73±2.52)相比較，DSS組(19.67±1.67)、VEGF-C組(20.43±3.47)小鼠結(jié)腸LVD變化的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。淋巴管管徑分析顯示，與正常組(102.65±21.00)相比，DSS組(166.06±10.16)、VEGF-C組(196.97±7.08)淋巴管的管徑明顯擴(kuò)張，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，VEGF-C組小鼠淋巴管擴(kuò)張相較于DSS組更顯著(P<0.05)。

圖2結(jié)腸LYVE-1免疫組織化學(xué)染色及淋巴管情況A正常組(×200)BDSS組(×200)CVEGF-C組(×200)D各組結(jié)腸LVD檢測E各組結(jié)腸淋巴管管徑測量

3討論

生理狀態(tài)下，淋巴管系統(tǒng)具有維持組織間質(zhì)液體平衡、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、引流白細(xì)胞和清除細(xì)菌等重要功能。淋巴管積極參與了慢性炎性反應(yīng)。盡管淋巴管在IBD發(fā)病及疾病維持中的作用尚無定論，但是IBD患者的結(jié)腸組織一直存在淋巴管阻塞、功能失調(diào)等現(xiàn)象[4-5]。有研究指出，IBD中的淋巴管生成是炎性反應(yīng)早期機(jī)體的一種代償反應(yīng)，可減輕組織水腫、緩解炎性反應(yīng)。隨著炎性反應(yīng)的進(jìn)展，組織水腫加重，淋巴管炎出現(xiàn)，淋巴管引流白細(xì)胞和液體的功能障礙，導(dǎo)致局部炎性反應(yīng)加重并持續(xù)[3,6-7]。目前已有研究表明，IBD患者、小鼠慢性結(jié)腸炎模型中炎性結(jié)腸組織淋巴管數(shù)量明顯增加[1,6-7]。

VEGFR-3(又稱Flt4)是較早被識別的淋巴管特異性生長因子受體[8]，可特異性結(jié)合VEGF-C、VEGF-D配體后被激活，促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和淋巴管新生。Tammela等[9]研究顯示，通過高表達(dá)VEGF-C激活VEGFR-3通路，可使小鼠集合淋巴管向淋巴結(jié)引流功能恢復(fù)。在小鼠慢性關(guān)節(jié)炎中，經(jīng)高表達(dá)VEGF-C病毒處理后的小鼠，其關(guān)節(jié)積液量明顯減少、炎性反應(yīng)好轉(zhuǎn)，同時(shí)關(guān)節(jié)組織中淋巴管生成增多、管徑擴(kuò)張、局部淋巴管引流功能增加[10]。特異性抗體阻斷VEGFR-3通路可見組織中淋巴管生成減少，淋巴管引流功能下降，組織炎性反應(yīng)加重[2,11-12]。由此可見，VEGF-C/VEGFR-3信號通路可通過調(diào)控淋巴管生成、增強(qiáng)淋巴管引流功能來控制慢性炎性反應(yīng)。

本研究通過高表達(dá)VEGF-C腺病毒對小鼠慢性結(jié)腸炎進(jìn)行干預(yù)，激活VEGF-C/VEGFR-3通路。統(tǒng)計(jì)分析顯示，經(jīng)VEGF-C刺激后小鼠DAI明顯下降，尤其在飼喂DSS誘導(dǎo)炎性反應(yīng)加重后較DSS組下降顯著，提示可緩解炎性反應(yīng)。結(jié)腸組織病理學(xué)評分顯示VEGF-C組較DSS組顯著下降，但仍未達(dá)到正常水平，表明刺激VEGF-C/VEGFR-3通路可一定程度上緩解慢性結(jié)腸炎。LYVE-1免疫組織化學(xué)染色分析顯示，3組小鼠的結(jié)腸組織間淋巴管密度未見明顯差異，但VEGF-C組與DSS組淋巴管管徑較正常組擴(kuò)張明顯，且VEGF-C組管徑擴(kuò)張更為顯著。目前大量研究顯示，促進(jìn)淋巴管生成、增強(qiáng)淋巴管引流功能在控制慢性炎性反應(yīng)方面具有巨大潛力，而IBD患者的結(jié)腸組織已表現(xiàn)為淋巴管數(shù)量增加、淋巴管阻塞、淋巴管炎，但結(jié)腸炎性反應(yīng)未見緩解，提示單純增加淋巴管數(shù)量對控制炎性反應(yīng)的效果不佳，恢復(fù)、提升組織淋巴管引流功能才是促進(jìn)炎癥緩解的重點(diǎn)。本研究中VEGF-C組小鼠DAI及組織病理學(xué)評分提示炎癥緩解，而結(jié)腸淋巴管數(shù)量未見明顯增加，僅管腔擴(kuò)張顯著，由此可見，促進(jìn)淋巴管擴(kuò)張可增強(qiáng)淋巴管對炎癥引流，緩解慢性結(jié)腸炎癥。

綜上所述，刺激VEGF-C/VEGFR-3通路主要通過刺激淋巴管進(jìn)一步擴(kuò)張、增加對炎癥的引流來緩解慢性結(jié)腸炎癥。VEGF-C在控制IBD病情進(jìn)展方面具有重要的治療意義。

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(本文編輯：周駿)

基金項(xiàng)目：國家自然基金青年基金(81200260)

通信作者：王曉蕾，Email: wangxiaolei@tongji.edu.cn

DOI:10.3969/j.issn.1673-534X.2016.03.015

(收稿日期：2016-01-30)