鎂離子對大鼠雪旺細胞增殖及NGF分泌的影響

李　明，宋永周，王　斌，童九輝，袁　鶴，馬　維

(河北醫科大學第二醫院骨科，河北 石家莊 050000)

?

·論著·

鎂離子對大鼠雪旺細胞增殖及NGF分泌的影響

李明，宋永周，王斌，童九輝，袁鶴，馬維*

(河北醫科大學第二醫院骨科，河北 石家莊 050000)

[摘要]目的觀察鎂離子對體外培養大鼠雪旺細胞(Schwann cells,SCs)增殖及神經生長因子(nerve growth factor,NGF)分泌的影響。方法選取出生3～5 d SD大鼠，分離雙側坐骨神經行SCs體外培養，用S-100免疫細胞化學染色鑒定細胞純度。取對數生長期SCs分別加入含不同濃度MgCl2(0、0.5、1、2 mmol/L)和10%FBS的DMEM培養基。分別于第2、4、6、8天，MTT法檢測SCs增殖情況，ELISA法檢測細胞分泌NGF水平。結果經雙30 min差速貼壁法，可以去除大部分成纖維細胞。原代培養的SCs，接種24 h后即可貼壁生長。在培養的第72 h細胞胞體出現并肩平行排列的趨勢，第7天可見細胞聚合。經免疫組織化學檢測計數，培養6 d后的SCs，其純度達到91%。各組SCs增殖活力均呈上升趨勢(A組上升幅度最大，C組上升幅度最小)，各組分泌的NGF水平至第6天達峰值后均下降(A組上升幅度最大，C組上升幅度最小)，4組組間、不同時點間、組間·不同時點間交互作用差異有統計學意義(P<0.05)。 結論適宜濃度的MgCl2對體外培養大鼠SCs的增殖和分泌功能有促進作用。

[關鍵詞]鎂；雪旺細胞；神經生長因子；大鼠

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.07.001

雪旺細胞(Schwann cells，SCs)是構成周圍神經系統中特有的膠質細胞。不僅參與髓鞘的形成，還在周圍神經損傷后，通過自身快速增殖、分裂以及分泌各種蛋白分子維護軸突的生長環境，促進神經的自我修復及再生。鎂離子是細胞正常代謝所必需的離子之一，在細胞中含量豐富，在體內參與幾百種酶反應。在局部微環境中，鎂離子作為細胞第二信使具有調節線粒體鈣緩沖能力，同時具有抗凋亡、抗氧化及抗炎作用，對于神經沖動的傳導，也具有重要意義[1]。目前，對鎂的研究多集中于對呼吸系統黏膜[2-3]和對神經系統的保護，鎂離子對神經系統保護作用的研究大多集中于顱腦損傷及脊髓損傷[4-8]，而在外周神經損傷的研究較少。本研究通過體外培養大鼠SCs，觀察鎂離子對SCs的增殖及分泌功能的影響，旨在為構建適宜SCs培養的微環境提供一定實驗依據和理論基礎。現報告如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物選用出生3～5 d無特定病原體級SD大鼠20只，雌雄不限，體質量25～30 g，由河北省實驗動物中心提供。實驗進行前，經我院科研倫理委員會批準同意。

1.2試劑DMEM培養基(Sigma公司)，胎牛血清(fetal calf serum，FBS，Sigma公司)，膠原酶(Gibco公司)，S-100多克隆抗體(Boster公司)，神經生長因子(nerve growth factor,NGF)酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(Boster公司)，免疫細胞化學試劑盒(Boster公司)，噻唑藍(methylthiazolyldiphenyl- tetrazolium bromide,MTT,Sigma公司)，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，美國R&D公司)，胰蛋白酶(Gibco公司)，氯化鎂(Sigma-Aldrich公司)。

1.3SCs培養、純化取出生3～5 d乳鼠雙側坐骨神經，剝離神經外膜后剪成小碎塊，加入0．25%胰蛋白酶及1%膠原酶各1 mL，充分晃動，待消化液變渾濁后置于37 ℃空氣搖床中振蕩消化，在顯微鏡下觀察到大部分組織塊被消化成單細胞后，加入完全培養基終止消化，過濾消化液，1 000 r/min離心5 min后棄上清，加入適量DMEM培養液，制成單細胞懸液，將其放入預先鋪有多聚賴氨酸的培養瓶中，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養30 min，將消化液移至另1個培養瓶中，以雙30 min 差速貼壁法貼走部分纖維母細胞。24 h后，加入終濃度為10-5mmol/L的阿糖胞苷，對成纖維細胞進行抑制，24 h后吸除含有阿糖胞苷的培養液，以后每隔2～3 d更換1次培養液，每日在倒置相差顯微鏡下觀察其生長情況。待細胞融合約80%時進行傳代。取第2代細胞爬片，行S-100免疫細胞化學鑒定。

1.4SCs鑒定取第2代細胞接種到預置有蓋玻片的24孔培養板上，待細胞長成單層時，取出蓋玻片，0.1 mol/L PBS沖洗，冷丙酮固定20 min，0.1%Triton-X100 浸泡8 min，加入5%BAS 封閉液，室溫下孵育25 min，滴加S-100 一抗(1∶100比例稀釋)，在37 ℃濕盒中孵育1 h，再滴加辣根酶標記二抗(1∶100比例稀釋)，37 ℃濕盒中孵育30 min，再次0.1 mol/L PBS 液充分沖洗， DAB 顯色，自來水沖洗10 min，常規脫水，透明，封片，鏡檢。

1.5MTT比色檢測SCs活性實驗分為4組，即正常培養組和A、B、C組，培養基分別為含不同濃度MgCl2(0、0.5、1、2 mmol/L)的含10%FBS的DMEM培養基。取對數生長期的第3代SCs懸液，以1×104/mL密度接種于96孔培養板中，每孔200 μL，于5%CO2、37 ℃培養箱培養24 h。培養基用含不同濃度MgCl2(0、0.5、1、2 mmol/L)含10%FBS的DMEM維持液置換原培養基。每組各6個復孔，于第2、4、6、8天取出待測樣品，每孔加入MTT(5 g/L) 20 μL，避光孵育4 h，收獲細胞棄除培養液，并加入150 μL DMSO終止溶液，振蕩10 min以充分溶解結晶，置于酶標儀上，490 nm波長下測各孔光吸收值。

1.6ELISA檢測SCs分泌NGF水平取對數生長期的第3代SCs，以1×105/mL密度接種于涂有多聚賴氨酸的24孔培養板中，共4組，每組6孔。于5%CO2、37 ℃培養箱培養24 h后，用含不同濃度MgCl2(0、0.5、1、2 mmol/L)的含10%FBS的DMEM維持液置換原培養基。培養第2、4、6、8天取各組上清液離心，將上清液移入無菌EP管中，再次離心，將上清液分別移入另1個EP管中，-20 ℃冷藏待測。待全部樣品收集后，按照試劑盒使用說明測定培養液上清標本，以及NGF標準品的吸光度值，根據樣品OD值在NGF含量標準曲線圖上查出相應NGF含量。

2　結　　果

2.1SCs培養經雙30 min差速貼壁法，可以去除大部分成纖維細胞。原代培養的SCs，一般在接種24 h后即可貼壁生長，胞核呈長形或卵圓形，胞體的立體感強，形態飽滿呈梭狀，周邊有明顯的光暈，兩端有細長的突起，通常呈雙級狀。隨著培養時間的延長，從胞體伸出的突起逐漸增長。在培養的第72 h，即可觀察到細胞胞體出現并肩平行排列的趨勢，第7天在顯微鏡下可見細胞聚合，呈“端對端，肩并肩”等旋渦排列或網狀排列，逐漸形成片狀，形如地毯(圖1)。

2.2免疫細胞化學結果SCs對抗S-100蛋白呈陽性反應，胞體呈細小梭形，邊界清晰，兩端有數量不等的突起，排列成柵欄狀或網狀。胞核比胞漿著色淺，胞漿著色為棕色。對胞漿為棕色的陽性細胞進行計數，培養6 d后的SCs，其純度達到91%(圖2)。

2.3不同濃度MgCl2對SCs增殖的影響在培養后的第2、4、6、8天不同時間點，正常培養組和C組OD值呈先升高再降低趨勢，第6天達高峰，第8天有所回落；A、B組OD值呈升高趨勢；A組上升幅度最大，C組上升幅度最小；4組組間、不同時點間、組間·不同時點間交互作用差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

圖1原代培養第7天的細胞形態(×200)

Figure 1The cell morphology on the seventh day of primary culture(×200)

圖2雪旺細胞S-100免疫細胞化學觀察(免疫組織化學 ×200)

Figure 2S-100 immunocytochemical image of schwann cells(Immunohistochemistry ×200)

表1　不同濃度MgCl2對SCs增殖活力比較Table 1　Comparison of the proliferation activity of SCs in different concentrations of MgCl2　值)

2.4不同濃度MgCl2對SCs分泌NGF水平的影響4組在培養后不同時間點NGF分泌數值呈先升高再降低趨勢，第6天達到峰值，第8天有所下降；A組上升幅度最大，C組上升幅度最小；4組組間、不同時點間、組間·不同時點間交互作用差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2各組SCs分泌NGF含量比較

組別 培養時間第2天第4天第6天第8天正常培養組 45.356±3.12172.464±6.90375.260±5.14471.672±2.882A組 43.534±6.05474.094±5.24790.085±2.43584.744±7.515B組 42.778±1.15074.490±2.64676.944±3.58274.060±6.583C組 40.194±1.35250.351±2.77265.533±8.34759.192±4.424組間 F=272.141 P=0.000不同時點間 F=739.632 P=0.000組間·不同時點間 F=24.197 P=0.000

3　討　　論

SCs是周圍神經系統中重要的膠質細胞，不僅參與髓鞘的形成，而且對于神經的修復和軸突再生均具有重要作用。在周圍神經損傷后的再生修復過程中，SCs通過吞噬軸突碎片，支持引導再生纖維生長，分泌多種NGF，促進軸突向遠端生長，同時產生細胞外基質和細胞黏附分子，防止受損神經元胞體的死亡[9]。在本研究中，通過酶消化法和差速貼壁法進行純化，再利用阿糖胞苷清除殘留的成纖維細胞，因此獲得了較高純度的SCs。在周圍神經系統中，只有成熟的SCs可以強烈表達S-100 蛋白，所以用S-100 抗體鑒定SCs是非常可靠的[10]。本研究應用免疫組織化學染色方法，觀察到培養細胞的胞漿著色為棕色。通過對陽性細胞計數，培養6 d后的SCs，其純度達到了91%，證明通過酶消化法和差速貼壁法體外培養SCs是成功的。

鎂在細胞中含量豐富，是人體內必不可少的微量元素之一。鎂在體內參與幾百種酶反應，對維持細胞膜的完整性、細胞呼吸、蛋白質合成、糖和能量代謝、Na+-K+正常交換等均具有重要作用。一般認為，鎂離子可通過對細胞功能的調節作用、N-甲基-D-天冬氨酸受體的拮抗作用、鈣離子拮抗作用等發揮神經保護作用[11]。李伯翰等[1]用鎂金屬纖維絲與SCs共培養，發現鎂離子在微環境下可以促進細胞組織的黏附以及分泌生長因子NGF作用。適宜濃度的鎂離子對SCs增殖有促進作用，同時對于SCs合成和分泌NGF也有促進作用。鄢開勝等[12]研究發現，對體外培養的螺旋神經節細胞預先給予1 mmol/L MgCl2能增加暴露于谷氨酸的螺旋神經節細胞的存活率，還能通過抑制鈣離子內流降低谷氨酸對螺旋神經節細胞的毒性，對螺旋神經節細胞損傷發揮保護作用。飲食中加入適量鎂能降低大鼠對噪聲暴露后的敏感性。對噪聲性聽力損失有防護作用[13]。呂一鳴等[14]觀察不同濃度鎂離子對成纖維細胞和成骨細胞的生長情況，結果發現成纖維細胞最適鎂離子生存的濃度為70 mmol/L，成骨細胞為30 mmol/L。

周圍神經損傷后，SCs分泌大量的內源性神經營養因子(neurotrophic factor,NTF)，包括NGF、腦源性神經營養因子、睫狀神經生長因子3大類。其中NGF對于周圍神經的修復起到了主要的促進作用，它可以誘導神經元突起生長，防止神經元變性凋亡，促進損傷神經再生及修復[15]。姚健等[16]在進行神經元體外培養時發現，神經元單獨培養時，若去除NGF培養液，其軸突出現漂浮，神經元最后死亡，然而將神經元與SCs共同培養時，即使去除NGF，神經元依然良性生長，SCs也出現明顯增殖，并包裹軸突。另有研究表明對大鼠坐骨神經切斷處局部給予NGF，能明顯改善神經移植術后的功能恢復[17]。

研究表明，鎂離子對體外培養的大腦神經元具有保護作用，但這種保護作用并不是濃度依賴性的。鄢開勝等[12]發現，鎂離子濃度過高，對體外培養的螺旋神經節細胞保護作用反而降低，原因可能是濃度過高對鈣離子通道有抑制作用[18]。本研究觀察了含0.5、1、2 mmol/L MgCl2的培養基與正常培養基對SCs增殖及NGF分泌水平的影響，結果發現0.5 mmol/L MgCl2有促進作用，2 mmol/L MgCl2對SCs增殖及NGF分泌水平有抑制作用。關于MgCl2對細胞保護及其增殖促進作用的適宜濃度，目前尚無明確的文獻報道，先前發表的研究結果并不一致，可能是所培養的細胞及培養條件不同所致[19-22]。鎂離子如何促進SCs的增殖及分泌，其具體機制仍需進行深入的研究。

[參考文獻]

[1]李伯翰,劉洪臣.鎂金屬纖維絲與雪旺細胞共培養時細胞增殖及神經生長因子的表達[J].中華老年口腔醫學雜志，2013，11(3):132-135.

[2]史軍然,薛紅霞,白瑞珍，等.硫酸鎂聯合干擾素α-1b霧化吸入治療重癥毛細支氣管炎的效果分析[J].河北醫科大學學報，2016，37(1):89-91.

[3]任善香.硫酸鎂對急性嚴重哮喘兒童臨床療效的對照研究[J].臨床薈萃，2013，28(10):1168-1170.

[4]Lee JH,Roy J,Sohn HM,et al. Magnesium in a polyethylene glycol formulation provides neuroprotection after unilateral cervical spinal cord injury[J]. Spine (Phila Pa 1976)，2010，35(23):2041-2048.

[5]李偉,馮世慶,李健輝，等.硫酸鎂聯合自體激活雪旺細胞移植治療脊髓損傷[J].天津醫藥，2009，37(6):485-488，插2.

[6]管格非,徐曉雪,呂昕瞳，等.無鎂誘導培養大鼠海馬神經元癲癇放電模型中電壓門控性鈣通道Ca-v1.2和鈣調蛋白激酶Ⅱ的表達[J].解剖科學進展，2012，18(2):122-125.

[7]王闖,黃晶晶.鎂離子濃度的改變致腦出血后腦水腫形成的作用機制[J].中國藥物經濟學，2014，(8):287-288.

[8]董亞茹,張琳.硫酸鎂對腦缺血再灌注大鼠腦組織Bcl-2表達的影響及神經保護作用[J].臨床神經病學雜志，2012，25(4):275-277.

[9]Armati PJ,Mathey EK. An update on Schwann cell biology--immunomodulation,neural regulation and other surprises[J]. J Neurol Sci，2013，333(1/2):68-72.

[10]Kraus A,Tager J,Kohler K,et al. Efficacy of various durations of in vitro predegeneration on the cell count and purity of rat Schwann-cell cultures[J]. J Neurotrauma，2010，27(1):197-203.

[11]Koltka K,Koknel-Talu G,Asik M,et al.Comparison of efficacy of intraarticular application of magnesium,levobupivacaine and lornoxicam with placebo in arthroscopic surgery[J]. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc，2011，19(11):1884-1889.

[12]鄢開勝,薛秋紅,張佳華，等.鎂離子對谷氨酸誘發的螺旋神經節細胞損傷的保護作用[J].中華醫學雜志，2006，86(22):1572-1574.

[13]鄢開勝,崔萬明,邱小雯，等.鎂對大鼠噪聲性聽力損失的防護作用[J].大連醫科大學學報，2013，35(2):127-129，153.

[14]呂一鳴，韓培，嵇偉平，等.不同濃度鎂離子對成纖維細胞和成骨細胞影響的體外實驗研究[J].中華創傷骨科雜志，2013，15(12)：1065-1070.

[15]Cui B,Wu C,Chen L,et al. One at a time,live tracking of NGF axonal transport using quantum dots[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2007,104(34):13666-13671.

[16]姚健,顧劍輝,陳罡,等.陳舊性神經損傷后雪旺細胞的變化實驗研究[J].中華手外科雜志,2005,21(6):368-371.

[17]王德勝,黃烈天,楊興桃,等.鼠神經生長因子局部注射治療周圍神經缺損傷的實驗研究[J].海南醫學,2011,22(5):7-9.

[18]Konrad M,Weber S. Recent advances in molecular genetics of hereditary magnesium-losing disorders[J]. J Am Soc Nephrol,2003,14(1):249-260.

[19]王健,馬翔宇,馮亞非,等.鎂離子對成骨細胞活力和分化的促進作用及其機制研究[J].現代生物醫學進展,2015,15(15):2836-2839.

[20]白亞玲,徐金升,馮偉勛,等.鎂離子對大鼠血管平滑肌細胞鈣化的影響[J].天津醫藥,2014,42(5):443-446.

[21]Louvet L,Buchel J,Steppan S,et al. Magnesium prevents phosphate-induced calcification in human aortic vascular smooth muscle cells[J]. Nephrol Dial Transplant,2013,28(4):869-878.

[22]吳卉,唐微,孫設宗,等.鎂離子、維生素E對CCl4誘導的肝損傷TNF-α和caspase-3含量的影響[J].山西醫科大學學報,2013,44(5):329-332.

(本文編輯：趙麗潔)

[收稿日期]2016-05-04；[修回日期]2016-05-23

[基金項目]河北省醫學科學研究重點課題(ZL20140291)

[作者簡介]李明(1980-)，男，河北隆堯人，河北醫科大學第二醫院主治醫師，醫學博士，從事骨科疾病診治研究。 *通訊作者。E-mail：15803210539@163.com

[中圖分類號]R329.26

[文獻標志碼]A

[文章編號]1007-3205(2016)07-0745-05

Effect of magnesium on proliferation and NGF secretion in Schwann cells of rat

LI Ming, SONG Yong-zhou, WANG Bin, TONG Jiu-hui, YUAN He, MA Wei*

(Department of Orthopedics, the Second Hospital of Hebei Medical University， Shijiazhuang 050000, China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of magnesium on proliferation and nerve growth factor(NGF) secretion in Schwann cells(SCs). Methods3～5 days old SD rats were used. The SCs were isolated from sciatic nerves in vitro. The positive cells were counted by using S-100 immunocytochemical staining. SCs were divided into four groups. The culture medium was DMEM containing 10% FBS and different concentrations of MgCl2(0， 0.5， 1， 2 mmol/L). MTT was used to detect the cell proliferation of the Schwann cells at 2, 4, 6, 8 d .The expression of NGF was detected by ELISA. ResultsMost collagenoblast were removed by differential adhesion about 30 minutes. The primary-cultured SCs were adherent to the plastic surface of the cell culture dish and growed 24 h after inoculation. In the 72th hour of cultivation, the cells showed the trend of parallel arrangement. In the 7th day, we could see cell aggregation under a microscope. Through counting by immunohistochemistry test, the purity of SCs reached 91% 6 days after cultivation. The purity of SCs was 91% by S-100 immunocytochemical staining. Compared with normal training group, 0.5 mmol/L MgCl2 group had a promoting effect on SCs proliferation and NGF secretion. There were significant differences in 4 groups, in different time points, and in the interaction of the groups vs time points(P<0.05). ConclusionAppropriate concentration of MgCl2 can stimulate the proliferation and NGF secretion of SCs of rat.

[Key words]magnesium； Schwann cells； nerve growth factor； rats