白藜蘆醇誘導前列腺癌細胞系PC-3凋亡的實驗研究

郭　勇，田曉麗，范瓊瑛，任秋霞，吳亞坤，蘇軍華*

(1.河北省石家莊市第一醫院泌尿外科，河北 石家莊 050011；2.河北醫科大學第二醫院檢驗科，河北 石家莊 050000；3.中國人民解放軍白求恩國際和平醫院腦內科，河北 石家莊 050082)

?

·論著·

白藜蘆醇誘導前列腺癌細胞系PC-3凋亡的實驗研究

郭勇1，田曉麗2，范瓊瑛1，任秋霞3，吳亞坤2，蘇軍華2*

(1.河北省石家莊市第一醫院泌尿外科，河北 石家莊 050011；2.河北醫科大學第二醫院檢驗科，河北 石家莊 050000；3.中國人民解放軍白求恩國際和平醫院腦內科，河北 石家莊 050082)

[摘要]目的探討白藜蘆醇誘導前列腺癌細胞系PC-3細胞凋亡的作用。方法采用MTT比色法檢測白藜蘆醇對前列腺癌細胞系PC-3細胞的增殖抑制情況；采用流式細胞術檢測前列腺癌細胞系PC-3細胞周期阻滯、誘導凋亡情況；采用RT-PCR法檢測相關凋亡基因mRNA表達的情況。結果 B、C、D組PC-3細胞均有不同程度的抑制。24、48、72 h C、D組細胞生長抑制率高于B組，D組細胞生長抑制率高于C組(P<0.05)。B、C、D組48、72 h細胞生長抑制率高于24 h，72 h細胞生長抑制率高于48 h(P<0.05)。S期、G2/M期細胞比例明顯下降,G0/G1期細胞比例明顯上升, 且隨藥物濃度的增加，凋亡率明顯上升,差異有統計學意義(P<0.05)。C、D組PC-3細胞bcl-2表達水平低于A組，D組低于B組(P<0.05)；B、C、D組PC-3細胞bax表達水平高于A組，C、D組高于B組，D組高于C組(P<0.05)。結論白藜蘆醇具有誘導細胞凋亡、抑制細胞增殖、阻滯細胞周期等作用，能達到很好的抗腫瘤效果，值得臨床上廣泛應用。

[關鍵詞]前列腺癌;白藜蘆醇;PC-3;細胞凋亡

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.07.025

前列腺癌好發于老年男性，在我國發現時常為晚期，失去手術機會。由于目前沒有徹底有效的治愈方法，因此研究新的治療前列腺癌的方法顯得尤為重要。白藜蘆醇是從藜蘆的根部分離而得，已發現在72種植物中可以獲得。白藜蘆醇的作用非常廣泛，包括抗菌、免疫調節、抗癌、神經保護、心血管保護等多方面。在臨床方面，白藜蘆醇對多種惡性晚期腫瘤的治療都有一定的效果[1-3]。本研究對白藜蘆醇誘導前列腺癌細胞系PC-3凋亡的作用進行探討，現報告如下。

1　資料與方法

1.1主要試劑與儀器 白藜蘆醇(購自美國Sigma公司)，前列腺癌細胞系PC-3細胞(來自河北醫科大學第二醫院實驗室)，RPMI1640培養液(Gibcobrl公司)，PCR提取及擴增試劑盒(購自Takara 公司)。Biorad凝膠成像分析系統(江蘇捷達公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養及白藜蘆醇工作液配制將前列腺癌細胞系PC-3細胞接種于RPMI 1640培養基中(含10%胎牛血清和100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素)，培養液中含300 mg/L谷氨酰胺、10%新生牛血清，5%CO2培養箱為37 ℃飽和濕度溫箱。每天更換培養液，待細胞培養約85%貼壁時，2 d傳1代。白藜蘆醇用雙蒸水100%二甲基亞砜溶解后,滅菌，離心，取上清分別配制濃度為0.2、0.5、0.8 g/L白藜蘆醇工作液，置于4 ℃冰箱避光保存。

1.2.2實驗分組實驗分為對照組(A組)和實驗組(B、C、D組)。B組為加入濃度0.2 g/L白藜蘆醇后的PC-3細胞，C組為加入濃度0.5 g/L白藜蘆醇后的PC-3細胞，D組為加入濃度0.8 g/L白藜蘆醇后的PC-3細胞。

1.2.3MTT比色法檢測白藜蘆醇對前列腺癌細胞系PC-3細胞的增殖抑制情況。取對數期人前列腺癌PC-3細胞株接種120孔板，每孔100 μL。A組接種10孔在37 ℃，5%CO2培養箱內常規培養24、48、72 h；B組接種30孔，其中10孔使藥物作用24 h，10孔使藥物作用48 h，10孔使藥物作用72 h；C組接種30孔，其中10孔使藥物作用24 h，10孔使藥物作用48 h，10孔使藥物作用72 h；D組接種30孔，其中10孔使藥物作用24 h，10孔使藥物作用48 h，10孔使藥物作用72 h。24、48、72 h后每孔加入MTT 50 μL，孵育4 h后去除培養液 ,再加入二甲基亞砜100 μL，振蕩10 min，使絮狀物完全溶解。590 nm波長酶聯免疫檢測儀上分別測定吸光度(optical density，OD)值，實驗重復3次，取均值，并計算細胞生長抑制率=(對照組平均OD值-實驗組平均OD值)/對照組平均OD值×100%。

1.2.4流式細胞術檢查前列腺癌細胞系PC-3細胞周期阻滯、誘導凋亡情況。A、B、C、D 4組細胞各30孔，均采用70%冷乙醇固定,PBS液沖洗2次,過夜，之后用PBS液沖洗1次,加入RNA酶酶切、碘化丙啶染色后, 室溫避光孵育15 min，采用流式細胞儀檢測細胞周期,結果用細胞周期擬合軟件Modfit分析，得出細胞凋亡比例及周期分布。G2/M阻滯用G2期細胞所占比率表示[4]。

1.2.5RT-PCR法檢測相關凋亡基因mRNA的表達情況。經白藜蘆醇作用24 h后，用胰蛋白酶適度消化、收集PC-3細胞, TRIzol法提取細胞總mRNA；NanoDrop(Thermo)聯合瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質量。隨后根據PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)所提供的方法對提取出的RNA進行反轉錄，反轉錄體系為20 μL。bax：sense 5′-TTTCTGACGGCAACTTCAACTG-3′, antisense 5′-CAACCACCCTGGTCTTGGAT-3′；bcl-2：sense 5′-CGCAGAGGGGCTACGAGT-3′, antisense 5′-GTTGACGCTCTCCACACACAT-3′。反應條件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個循環后，72 ℃延伸10 min。進行RT-PCR，反應后的PCR產物于1.2%的瓊脂糖凝膠中電泳,用Biorad凝膠圖像采集與分析系統進行掃描分析,用Chemi-Imager5500 軟件測定OD值。

1.3統計學方法應用SPSS 13.0軟件包進行數據處理。計量資料比較分別采用單因素方差分析和q檢驗；等級資料比較采用秩和檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2　結　　果

2.1細胞生長抑制率比較A組無細胞生長抑制，B、C、D組PC-3細胞均有不同程度的抑制。24、48、72 h C、D組細胞生長抑制率高于B組，D組細胞生長抑制率高于C組(P<0.05)。B、C、D組48、72 h細胞生長抑制率高于24 h，72 h細胞生長抑制率高于48 h(P<0.05)。隨白藜蘆醇濃度增加及時間的延長，PC-3細胞生長抑制率明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1各組細胞生長抑制率比較

組別細胞生長抑制率24h48h72hFPA組000B組13.25±1.0228.64±3.12△36.84±3.15△▲207.8970.000C組21.92±2.34*41.28±6.23*△54.31±5.64*△▲104.7140.000D組32.85±3.14*#58.15±7.28*#△64.04±6.23*#△▲81.0260.000F176.72464.75970.75P0.0000.0000.000

*P<0.05與B組比較#P<0.05與C組比較△P<0.05與24 h比較▲P<0.05與48 h比較(q檢驗)

2.2細胞周期分布及誘導凋亡情況比較S期、G2/M期PC-3細胞比例明顯下降,G0/G1期細胞比例明顯上升；隨藥物濃度的增加，凋亡率明顯上升,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2 。

表2　各組細胞周期分布及誘導凋亡情況比較　(n=30，例數，%)

*P<0.05與A組比較(秩和檢驗)

2.3凋亡相關基因表達比較4組bcl-2和bax差異有統計學意義(P<0.05)。C、D組PC-3細胞bcl-2表達水平低于A組，D組低于B組；B、C、D組的PC-3細胞bax表達水平高于A組，C、D組高于B組，D組高于C組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3各組PC-3細胞bcl-2、bax蛋白表達水平比較

組別OD值bcl-2baxA組0.042±0.0020.035±0.004B組0.039±0.0030.041±0.003*C組0.037±0.003*0.052±0.004*#D組0.035±0.002*#0.061±0.003*#△F8.38479.144P0.0000.000

*P<0.05與A組比較#P<0.05與B組比較△P<0.05與C組比較(q檢驗)

3　討　　論

前列腺癌是中老年男性發病率較高的腫瘤之一，是引起美國男性死亡的第二大癌癥，而在我國前列腺癌發病率也在迅速增加[5-6]。由于前列腺癌的發病機制極其復雜，目前并無有效的藥物能夠根治。有研究證實，黃酮和多酚類化合物能夠很好地預防、治療前列腺癌[7]。

白藜蘆醇屬于多酚類化合物，具有廣泛的生物學作用，如抗腫瘤、抑制血小板聚集、免疫調節作用、調節腫瘤相關酶、抗炎、心血管保護等[8]。此外，白藜蘆醇還具有抗肝纖維化、治療休克、抗衰老、抗氧化、減肥、美容等多種功效。臨床大量研究均表明，在治療如肝癌[9]、卵巢癌[10]、乳腺癌[11]、肺癌[12]等多種晚期惡性腫瘤患者時，應用化療藥物聯合白藜蘆醇臨床療效顯著。針對胃腸道等消化系統惡性腫瘤，白藜蘆醇能抑制腫瘤增殖，可綜合性多靶位地調節腫瘤細胞的各個層次的分子,起到調節平衡的作用[13-14]。還能抑制轉移性前列腺癌細胞PC-3M-IE8增殖和減弱腫瘤侵襲能力。本研究結果顯示，在前列腺癌系PC-3細胞中，加入0.8 g/L的白藜蘆醇作用72 h后，PC-3細胞生長抑制率能達到(64.04±6.23)%。充分證實了白藜蘆醇抑制細胞增殖的作用。

細胞凋亡是在多種基因調控下，細胞啟動預定的凋亡程序，發生生理死亡的過程，又稱程序性死亡，在細胞衰老、腫瘤的發生中起重要作用[15]。而誘導腫瘤細胞凋亡是抗癌藥物的重要機制，也是治療腫瘤的重要途徑之一。細胞周期阻滯能抑制腫瘤細胞增殖且會誘導腫瘤細胞凋亡[16]，細胞G2/M期受到阻滯能阻止DNA受損傷的細胞進入有絲分裂，因此細胞G2/M期的阻滯是藥物抗腫瘤機制的重要靶點。白藜蘆醇能誘導前列腺癌細胞的凋亡，一定程度上能抑制腫瘤增殖，減慢腫瘤進展、轉移。本研究結果顯示，未加入白藜蘆醇的PC-3細胞，G2/M期細胞比例為26.67%，加入0.8 g/L白藜蘆醇的PC-3細胞，G2/M期細胞比例為6.67%，表明白藜蘆醇具有顯著的增殖抑制作用和抑制集落生長作用，能夠抑制增殖和細胞周期阻滯；采用流式細胞術檢測白藜蘆醇誘導前列腺癌PC-3細胞是否進入G2/M阻滯，加入不同濃度白藜蘆醇作用24 h后，S期、M期比例明顯下降,G0/G1期細胞比例明顯上升，表明白藜蘆醇能降低DNA的合成,抑制腫瘤細胞增殖。

bax和bcl-2是bcl2家族中重要的調控凋亡的基因，細胞凋亡或增殖是由二者的相互作用決定的，其中bax促進細胞凋亡,bcl-2抑制細胞凋亡[17]。bax主要分布在細胞基質中，通過促進PT孔通道開放，使色素細胞C從線粒體釋放入細胞質，從而激活caspase級聯反應誘導細胞凋亡。bcl-2屬于膜結合蛋白定位于線粒體的外膜中，一般以同源二聚體的形式存在，可以抑制細胞凋亡。本研究結果顯示，白藜蘆醇可以抑制基因(bax、bc1-2)的表達，而且隨著濃度增加，抑制作用增強。表明白藜蘆醇主要是使凋亡促進基因bax上調，同時使凋亡抑制基因bcl-2下調，進而使bcl-2/bax比值下降，最終達到誘導細胞凋亡的目的。

綜上所述，白藜蘆醇具有誘導前列腺癌細胞系PC-3細胞凋亡、阻滯細胞周期、抑制PC-3細胞基因的表達增殖等作用，高濃度的白藜蘆醇的抑制作用更強，能達到很好的抗腫瘤作用，可能是抗前列腺癌的機制之一。白藜蘆醇在人前列腺癌治療中具有廣闊的應用前景。

[參考文獻]

[1]Novelle MG,Wahl D,Diéguez C,et al. Resveratrol supplementation,where are we now and where should we go[J]. Ageing Res Rev，2015，21:1-15.

[2]Singh CK,Ndiaye MA,Ahmad N. Resveratrol and cancer:Challenges for clinical translation[J]. Biochim Biophys Acta,2014,1852(6):1178-1185.

[3]Gu Y，Chen X，Shang C，et al. Fusarochromanone induces G1 cell cycle arrest and apoptosis in COS7 and HEK293 cells[J]. PLoS One，2014，9(11)：e112641.

[4]李永軍，李巍偉，王鑫,等.白藜蘆醇對葡萄球菌抗菌活性研究[J].中國實驗診斷學，2008,12(1)：58-60.

[5]江濤，胡華剛，徐斯凡.SATB1與前列腺癌的研究進展[J].中國醫藥導報，2014,11(16)：159-161.

[6]王啟林，李瑞乾，金從國，等.蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子在前列腺癌中的表達及意義[J].中國醫藥導報，2014,11(9)：45-47.

[7]Spatafora C,Tringali C. Natural-derived polyphenols as potential anticancer agents[J]. Anticancer Agents Mgents Med Chem,2012,12(8):902-918.

[8]胡凌云，王海鈉，裴俊俊，等.白藜蘆醇防癌抗癌作用及其分子機制研究進展[J].山東醫藥，2010，50(5)：111-112.

[9]Sun J，Zhang C，Bao YL，et al. Parthenolide-induced apoptosis， autophagy and suppression of roliferation in HepG2 cells[J]. Asian Pac J Cancer Prev，2014，15(12)：4897-4902.

[10]Kwak SW，Park ES，Lee CS. Parthenolide induces apoptosis by activafing the mitochondrial and death receptor pathways and inhibits FAK-mediated cell invasion[J]. Mol Cell Biochem，2014，385(1/2)：133-144.

[11]徐杰，許曉群，鄒志孟,等.白藜蘆醇對不同乳腺癌細胞增殖的抑制作用[J].國際腫瘤學雜志，2013,40(3):232-235.

[12]何萍，張敏，袁芳,等.肺癌患者腫瘤異常蛋白的檢測意義[J].河北醫科大學學報，2012,33(10):1225-1226.

[13]王偉，李覃，陳虹,等.白藜蘆醇調節STAT3抗急性髓性白血病作用的研究[J].中國藥理學通報，2010，26(3)：346-352.

[14]陳洋,李巖,劉新莉,等.TRAIL聯合白藜蘆醇對乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡影響的研究[J].中華腫瘤防治雜志，2011，18(1)：14-17,39.

[15]顧萬，趙新閣，張幸.芒柄花黃素通過調節Bax和Bcl-2蛋白表達誘導SKOV3細胞凋亡[J].四川生理科學雜志，2014，36(2)：60-62.

[16]Weng H，Tan ZJ，Hu YP，et al. Ursolic acid induces cellcycle arrest and apoptosis of gallbladder carcinoma cells[J]. Cancer Cell Int，2014，14(1)：96.

[17]Correia S,Alves MR,Cavaco JE,et al. Estrogenic regulation of testicular expression of stem cell factor and c-kit:implications in germ cell survival and male fertility[J]. Fertil Steril,2014,102(1):299-306.

(本文編輯：趙麗潔)

[收稿日期]2016-02-24；[修回日期]2016-07-04

[作者簡介]郭勇(1976-)，男，河北石家莊人，河北省石家莊市第一醫院副主任醫師，醫學學士，從事泌尿外科疾病診治研究。 *通訊作者：E-mail:1120237924@qq.com

[中圖分類號]R737.25

[文獻標志碼]B

[文章編號]1007-3205(2016)07-0838-04