山藥汁液中羥基磷灰石生物復合物的仿生合成

嵇明翔，謝安建，沈玉華

（安徽大學化學化工學院，安徽合肥230601）

山藥汁液中羥基磷灰石生物復合物的仿生合成

嵇明翔，謝安建，沈玉華

（安徽大學化學化工學院，安徽合肥230601）

選用天然植物山藥中富含的生物分子作為反應物和模板，在常溫、常壓下仿生制備了羥基磷灰石生物復合物。研究結果表明，在山藥表面生成的是卵石狀羥基磷灰石晶體，而山藥榨汁液中生成復合物的形貌和晶型與構晶離子的添加順序有關，分別出現了立方體晶態納米顆粒和多孔疏松的無定型結構，可能歸結于山藥中可溶性與不可溶的生物分子所含不同極性基團在羥基磷灰石形成過程中起到的不同誘導和調控作用。

仿生合成；生物大分子；羥基磷灰石；山藥；生物復合物

1　前言

自然界中的許多無機納米材料，如珍珠、貝殼等，擁有特殊的形貌，且容易被生物體吸收和利用，具有極佳的生物適配性［1-3］。這些無機納米材料的形成主要是通過利用生物體所分泌的具有特定結構和官能團的生物分子，例如氨基酸、蛋白質、多糖等，作為模板物質［4］，在常規條件下與無機離子相互作用，最終沉積而形成的［5］。因此利用生物礦化的機理，制備無機納米材料不僅是一種綠色的合成方法，而且已成為材料、化學、生物、醫學等多學科領域之間相互交叉的前沿課題［6-7］。

羥基磷灰石（Ca10（PO4）6（OH）2，HA）是生物體中骨骼和牙齒的主要無機材料成分，因其良好的生物相容性，被作為骨替代和骨修復材料［8］，也是目前最廣泛應用于組織工程中并最得到普遍接受的組織修復材料。但由于HA其本身具有的脆性大，易斷裂等缺點，在實際應用過程中受到了極大地限制［9］。于是，人們通過利用其它材料對HA進行改性，制備HA的復合材料，追求理想的使用效果。目前已有同蠶絲蛋白、殼聚糖和膠原蛋白等生物材料相互作用制備的復合材料［10-13］，但利用植物提取汁液中的可溶性生物分子和植物本身難溶性生物分子作為模板兼反應物、常溫常壓下仿生合成HA生物復合材料鮮見報道。

同時由于HA的強吸附性能和pH敏感性，用作為藥物載體、用于藥物的控制釋放也得到人們的高度重視。如Yang［14］等人利用碳酸鈣為模板，制備了空心介孔HA，將藥物有效的負載于其內部，利用HA的pH敏感性緩釋藥物。而Qi［15］等人利用DNA分子為模板，制備片狀HA，作為良好的藥物載體。而使用植物提取汁液中的生物分子作模板制備具有多孔結構的HA用于藥物載體材料也未見報道。

山藥（Chinese yam），又稱薯蕷，具有很高的營養價值。其汁液中內含豐富的植物蛋白、氨基酸，多糖等，還含有大量的皂苷成分，可以使得生成的產物有效分散在溶液中，不易聚結，且具有原料豐富、廉價易得的優勢。因此，本文直接利用山藥汁液與Ca2+-H2PO4--HPO42-體系反應，一步合成了HA生物復合物，并探索了離子添加順序的不同對于HA最終復合產物的影響。還研究了山藥表面不溶性生物大分子對羥基磷灰石誘導和調控作用。

2　實驗部分

2.1試劑與儀器

無水氯化鈣（CaCl2）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4）均購自國藥試劑有限公司，皆為分析純；水為二次水；實驗所用的山藥購于安徽省合肥市九龍街菜市場。

紅外光譜采用NEXUS-870 FTIR型傅里葉變換紅外光譜儀檢測，掃描范圍為4000-400 cm-1；物相測試使用DX-2700型X射線衍射儀完成，測試電壓為40 kV，電流100 mA，掃描速度為4°/min；產物的形貌在SU1510型掃描電子顯微鏡上觀測，加速電壓為10 kV；高分辨透射電鏡對產物的晶格進行觀察。

2.2山藥榨汁液中HA的合成

取二次水洗凈的去皮山藥200 g，加200 mL二次水榨汁，過濾后離心（12000 r/min，5min）除去固體，取上清液。接著取30 mL榨汁液、依次加入30 mL CaCl2溶液（40 mmol/L）、18 mL Na2HPO4（24 mmol/L）+18 mL NaH2PO4（15.12 mmol/L）緩沖溶液，攪拌5 min后靜置一天，將混合液離心，用無水乙醇洗滌固體產物三次，烘干后得到產物1。

對照試驗1：實驗方法同上，只是在30 mL榨汁液中，先加入18 mL Na2HPO4（24 mmol/L）+18 mL NaH2PO4（15.12 mmol/L）緩沖溶液，再加入30 mL CaCl2溶液（40 mmol/L），得到產物2。

對照試驗2：取二次水洗凈的去皮山藥30 g，切割成小塊，加入30 mL二次水中進行分散，然后加入構晶離子溶液，其加入的量和順序以及制備方法同制備產物1。最后，用二次水洗滌反應后的山藥若干次，得產物3，切片并做SEM分析。

3　結果與討論

3.1產物的XRD譜圖和高分辨透射電鏡圖片

圖1在（a）純水和（b）山藥榨汁液中得到產物1的XRD圖譜及（c）山藥榨汁液中獲得產物1的高分辨透射電鏡圖

圖1a，b為在不同體系中所制備產物的XRD圖譜。在純水中生成產物的XRD圖譜如圖1a所示。可見樣品在2θ為10.82°、25.86°、31.74°、34.05°、39.76°、46.66°、49.46°處出現較強或中等強度的衍射峰，分別對應HA的（100）、（201）、（211）、（202）、（130）、（222）、（230）晶面，與HA的標準卡相一致（JCPDS card No.09-0432），說明了HA的生成。圖1b是在山藥汁液中反應產物1的XRD圖，其衍射峰對應位置與圖1a相似，但峰的相對強度有變化，位于2θ為10.8°處的（100）晶面的峰大大增強，顯示出HA在這個面上的定向生長得到了強化，易于形成立方體結構，表明山藥汁液中多糖、蛋白等生物大分子起了誘導HA晶體取向生長的作用。另外還可以看到XRD圖有寬化現象，推測可能是山藥汁液中的生物分子與HA結合形成了復合物［16-17］。圖1c為山藥榨汁液中所得到產物1的高分辨透射電鏡圖，在選取的微區中可以發現晶格的間距為0.82 nm，與HA的（100）晶面的間距一致，符合XRD中HA的（100）晶面定向生長得到強化的結果。并可發現HA周圍呈現無定型結構，可能是榨汁液中作為模板的有機生物分子，進一步說明HA生物復合物的成功制備。

3.2產物的FTIR譜圖

圖2（a）山藥榨汁液、（b）山藥榨汁液-Ca2+復合物溶液、（c）HA生物分子復合物和（d）HA的FTIR圖譜

圖2是不同樣品的FTIR圖譜。山藥汁液的FTIR圖譜見圖2a，可以觀察到位于1730 cm-1的復合物溶液中羧基中C=O伸縮振動峰、蛋白質酰胺I帶（羰基的伸縮振動，1654 cm-1）、酰胺II帶（N-H伸縮振動，1570 cm-1）和酰胺III帶（C-N彎曲振動，1240 cm-1）［18］。還可以發現圖中900-650 cm-1區域出現的N-H剪式振動吸收峰、位于2850-3000 cm-1處的C-H伸縮振動峰以及3500-3300 cm-1處的氫鍵特征吸收峰，表明山藥汁液中主要的生物大分子是多糖、蛋白質等生物分子。圖2b是山藥榨汁液-Ca2+復合物溶液的FTIR圖譜。可以觀察到，在山藥汁液中加入Ca2+溶液后，位于1730 cm-1的復合物溶液中C=O伸縮振動峰幾乎消失，蛋白質的酰胺I帶和II帶的相對強度也發生明顯的變化，表明鈣離子與山藥榨汁液生物分子的羧基和羰基等極性基團存在著強烈的相互作用，因此含有極性基團的生物分子可以為HA的仿生礦化提供有效的成核位點，有利于形成特定的結構形貌。圖2d是在純水中制備的HA的FT-IR圖譜，1080 cm-1附近的強吸收峰為PO43-的強伸縮振動峰，而560 cm-1附近的吸收譜帶為此基團的彎曲振動特征吸收［19］，3500-3300 cm-1的強寬峰為氫鍵的特征吸收峰，強烈的結合水吸收峰導致了3572 cm-1處νOH的特征吸收峰不顯著，以上圖譜的分析表明此樣品為HA。圖2c是在山藥汁液中制備的HA生物分子復合物的FTIR圖譜。與圖2a，b，d對比可知，該產物既含有山藥汁液中生物大分子的特征峰，也含有HA的特征峰，表明產物是HA與生物大分子形成的復合物。認真分析后可以發現，這些特征峰的位置和強度與單一組分或山藥榨汁液-Ca2+復合物比較，均發生了較大的變化，表明山藥汁液中生物大分子不僅作為誘導HA生長的模板劑，也參與了反應，作為產物成分之一與HA緊密結合形成復合物。

3.3產物的SEM分析

圖3　山藥榨汁液中制備的（a，b）產物1和（c，d）產物2 的SEM圖像（圖3d中的插圖為產物2的XRD圖）

圖3a和b為將山藥榨汁液先與Ca2+反應，平衡后再加入H2PO4--HPO42-緩沖溶液的方法制得產物1的SEM圖，可見所得產物為立方體形態，棱長約300 nm，表明這種構晶離子的加入順序可以使HA在溶液中形成規整的形貌，而且從XRD圖（圖1b）可知其結晶性能良好，顯然山藥榨汁液中的生物大分子起到了誘導調控HA成核、取向生長的作用。由于無機的HA和山藥所含生物大分子均具有良好的生物相容性［20-24］，而且在強度和韌性方面各有特色，因此形成的產物結合了兩者的優勢，既具有生物相容性，又有較好的物理化學性能，在骨組織修復材料領域有潛在的應用前景。

當我們在山藥榨汁液中先添加H2PO4--HPO42-緩沖溶液，再加Ca2+時，發現所得產物2的形貌發生了很大的變化，見圖3c和d。可以看出，產物為多孔蓬松形貌，似海綿狀。這種多孔復合物具有較高的比表面積，可以作為良好的藥物載體材料。從圖3d的插圖中還可以進一步發現，產物2的XRD圖只出現一個寬化的峰，表明該復合物為無定型態。

從上述討論可知，在相同生物分子的誘導下，由于構晶離子添加的順序不同，可以導致產物的形態和結晶性能各異。根據經典成核理論，過飽和溶液中異相成核形成穩定的晶粒的自由能變化符合吉布斯自由能公式（1）：

其中R，Tg和S分別表示氣體常數，絕對溫度以及過飽和度。而溶液中的過飽和度S越大，從熱力學角度看，也有利于成核。山藥汁液中的蛋白質、多糖和氨基酸等生物分子所含有的極性基團，如-COOH，-NH2等很容易與Ca2+配位（參見紅外譜圖），形成較高的局部過度飽和微環境，并提供異相成核位點，在蛋白等生物分子的調控下，添加H2PO4--HPO42-緩沖溶液后，誘導HA的取向生長，所以易形成立方體的HA。顯然，先加入Ca2+有利于形成規整形貌和結晶態的HA復合物。而首先添加H2PO4--HPO42-緩沖溶液，蛋白等生物大分子與其結合能力較弱，較難為HA的礦化提供成核位點，所以形成的HA沒有規整形貌，且為無定型結構。因此我們可以通過改變反應條件控制合成我們所需要的產物。

3.4山藥表面制備產物的SEM分析

圖4　山藥表面制備的產物3的SEM圖

圖4a是山藥表面的SEM圖像。可以看到，山藥表面有微觀波浪狀花紋結構。圖4b和c為依次添加Ca2+-H2PO4--HPO42-體系在山藥表面反應后產物的SEM圖，所形成的HA為扁平卵石狀，粒子大小較均勻，直徑約20 μm，與在山藥榨汁液中生成的兩種產物的形貌都有很大區別，這是因為兩者誘導HA礦化的生物分子不同所導致的結果。在山藥表面主要是難溶性生物分子起誘導作用，其極性基團和空間結構與榨汁液中有所不同，所以控制產物成核、生長的行為也不同。

4　結論

本文利用山藥榨汁液與Ca2+-H2PO4--HPO42-體系反應，在溫和條件下仿生合成了HA生物復合物。研究發現，在山藥榨汁液中通過離子添加順序的不同可以控制產物的形貌和結晶性能。先添加Ca2+，后加H2PO4--HPO42-緩沖溶液則生成了立方體狀晶態HA生物復合物，而添加構晶離子順序與此相反時，則得到無定形的多孔HA生物復合物。而在山藥表面則可以調控生成卵石狀HA生物復合物。該研究的結果說明山藥表面基團及其汁液中的生物分子均可作為良好的模板調控HA的仿生合成。該研究為仿生合成無機/生物納米復合材料提供了一條新途徑。

［1］Weiner S，Addadi L.Crystallization pathways in biomineralization［J］.Annu.Rev.Mater.Res.，2011，41：21-40.

［2］Nudelman F，Sommerdijk N A J M.Biomineralization as an Inspiration for Materials Chemistry［J］.Angew.Chem.Int.Edit.，2012，51 （27）：6582-6596.

［3］Li X B，Chopp D L，Russin W A，et al.Spatial Patterns of Carbonate Biomineralization in Biofilms［J］.Appl.Environ.Microb.，2015，81：7403-7410.

［4］Patwardhan S V，Patwardhan G，Perry C C.Interactions of biomolecules with inorganic materials：principles，applications and future prospects［J］.J.Mater.Chem.，2007，17：2875-2884.

［5］Davis S A，Dujardin E，Mann S.Biomolecular inorganic materials chemistry［J］.Curr.Opin.Solid.St.M.，2003，7（4/5）：273-281.

［6］Hedrich R，Machill S，Brunner E.Biomineralization in diatoms-phosphorylated saccharides are part of Stephanopyxis turris biosilica［J］.Carbohyd.Res.，2012，365：52-60.

［7］Falini G，Albeck S，Weiner S，et al.Understanding biomineral growth and assembly for engineering novel green nanomaterials［J］. Bio-Inspired Nanotechnology，2014，13：127-140.

［8］Gong X H，Tang C Y，Hu H C，et al.Improved mechanical properties of HIPS/hydroxyapatite composites by surface modification of hydroxyapatite via in-situ polymerization of styrene［J］.J Mater Sci.-Mater.M.，2004，15（10）：1141-1146.

［9］Liu L，Li S W，Tian W D.A clinical study on immediate implantation of particulate hydroxylapatite artificial bone after teeth extraction［J］.West China Journal of Stomatology，2002，20（1）：42-44.

［10］資文華，孫俊賽，陳慶華，等.納米羥基磷灰石制備工藝的最新研究進展［J］.昆明理工大學學報（理工版），2003，28（4）：23-26.

［11］Murugan R，Ramakrishna S.Bioresorbable composite bone paste using polysaccharide based nano hydroxyapatite［J］.Biomaterials，2004，25（17）：3829-3835.

［12］WangL，NemotoR，SennaM.Changesinmicrostructureandphysico-chemicalpropertiesofhydroxyapatite-silkfibroinnanocompositewith varyingsilkfibroincontent［J］.J.Eur.Ceram.Soc.2004，24（9）：2707-2715.

［13］Wang L，Ning G L，Senna M.Microstructure and gelation behavior of hydroxyapatite-based nanocomposite sol containing chemically modifiedsilkfibroin［J］.Colloid.Surface.A，2005，254（1-3）：159-164.

［14］Yang Y H，Liu C H，Liang Y H，et al.Hollow mesoporous hydroxyapatite nanoparticles（hmHANPs）with enhanced drug loading and pH-responsive release properties for intracellular drug delivery［J］. J.Mater.Chem.B，2013（1）2447-2450.

［15］Qi C，Zhu Y J，Lu B Q，et al.Hydroxyapatite nanosheet-assembled porous hollow microspheres：DNA-templated hydrothermal synthesis，drug delivery and protein adsorption［J］.J.Mater.Chem.，2012，22：22642-22650.

［16］嵇罡，高泰瑞，Tidu A，等.熱噴涂FeAl涂層中納米晶結構的XRD分析［J］.金屬學報，2005，41（10）：1013-1019.

［17］付濤，郭振琪，張玉梅，等.幾種陽離子置換磷酸鈣生物陶瓷的XRD分析［J］.硅酸鹽學報，2000，28（3）：272-274.

［18］BouropoulosN，WeinerS，AddadiL.Calciumoxalatecrystalsin tomatoandtobaccoplants：morphologyandinvitrointeractionsofcrystalassociatedmacromolecules［J］.Chem.Eur.J.，2001，7（9）：1881-1888.

［19］Li M，Wang Y B，Liu Q，et al.In situ synthesis and biocompatibility of nano hydroxyapatite on pristine and chitosan functionalized graphene oxide［J］.J.Mater.Chem.B，2013（1）：475-484.

［20］Chen L，Mccrate J M，Lee J C M，et al.The role of surface charge on the uptake and biocompatibility of hydroxyapatite nanoparticles with osteoblast cells［J］.Nanotechnology，2011，22：105708.

［21］Vecchio K S，Zhang X，Massie J B，et al.Conversion of bulk seashells to biocompatible hydroxyapatite for bone implants［J］.Acta Biomaterialia，2007，3（6）：910-918.

［22］江捍平，王大平，阮建明，等.納米羥基磷灰石人工骨的生物相容性研究［J］.中國現代醫學雜志，2005，15（10）：1477-1480.

［23］趙宏，謝曉玲，萬金志，等.山藥的化學成分及藥理研究進展［J］.今日藥學，2009，19（3）：49-52.

［24］宋君柳.山藥品種資源及化學成分研究進展［J］.長江蔬菜，2009（6）：1-5.

［責任編輯：錢立武］

Biomimetic Synthesis of Hydroxyapitite Biocomposites in Chinese Yam Juice

Ji Mingxiang，Xie Anjian，Shen Yuhua
（School of Chemistry and Chemical Engineering，Anhui University，Hefei Anhui 230601）

The biological molecules in Chinese yam is used as reactants and templates for the biomimetic synthe?sis of hydroxyapitite（HA）biocomposite at room temperature and atmosphere.The results indicate that cobble?stone-like HA biocomposite is formed on the surface of Chinese yam while cube-shaped and porous HA biocom?posites are fabricated in the squeeze juice of Chinese yam with different addition orders of configurational ion，re?spectively，the soluble and insoluble biomolecules from the Chinese yam with diverse polar groups may play differ?ent roles in inducing and controlling the nucleation and growth of HA.

Biomimetic Synthesis；Biomacromolecule；Hydroxyapitite；Chinese Yam；Biocomposite

［中國分類號］O6-339A

1674-1102（2016）03-0035-04

10.13420/j.cnki.jczu.2016.03.008

2016-01-21

國家自然科學基金項目（21171001，51372004，21571002）。

嵇明翔（1990-），男，安徽蚌埠人，安徽大學化學化工學院碩士研究生，研究方向為納米復合材料。

沈玉華（1956-），女，安徽青陽人，安徽大學化學化工學院教授，研究方向為生物礦化，高分子，無機納米材料。