植物番茄紅素生物合成及分子調(diào)控機理研究進展

呂慧芳，劉四運

（池州學院 a.美術與設計學院；b.化學與材料工程學院，安徽 池州 247000）

植物番茄紅素生物合成及分子調(diào)控機理研究進展

呂慧芳a，劉四運b

（池州學院 a.美術與設計學院；b.化學與材料工程學院，安徽 池州 247000）

番茄紅素是植物中含有的一種天然紅色色素，人體從膳食中攝取番茄紅素，對人體健康非常有益。目前番茄紅素生物合成相關酶基因已經(jīng)從很多植物中克隆出來，且已對關鍵酶基因進行了功能驗證，為利用基因工程技術調(diào)控番茄紅素合成途徑提供研究基礎。文章綜述了植物番茄紅素生物合成途徑、相關酶基因及其在基因工程上應用的最新研究成果，并探討了運用基因工程技術調(diào)控番茄紅素合成的前景。

番茄紅素；生物合成；酶基因；基因

番茄紅素（Lycopene）是植物中含有的一種天然類胡蘿卜素，已有上百年的研究歷史。在西瓜、番茄、草莓等蔬菜和水果中含量較高，對人體具有多種生理保健功能。番茄紅素不僅是一種對人體健康很重要的色素，且還具有防癌、抗腫瘤、保護心血管、提高免疫力等多種生理作用，在保健食品研發(fā)方面?zhèn)涫荜P注［1］。大量研究表明在番茄紅素含量高的西瓜果實中，番茄紅素的有效性比番茄多出40%，人體的吸收利用率很高，而番茄中的番茄紅素較難被人體直接吸收利用［2］。西瓜瓜瓤越鮮艷，番茄紅素含量越高，果實營養(yǎng)價值越高。因此，為了提高果實中的番茄紅素含量并培育出高番茄紅素含量的植物品種，人們對番茄紅素生物合成代謝途徑及相關酶基因的功能鑒定進行了較多研究。

1　番茄紅素的生物合成

在果實生長發(fā)育期中，合成番茄紅素主要表現(xiàn)在兩個階段：一是轉色和成熟階段的果實色澤變化明顯，番茄紅素開始大量合成、迅速積累直至達到最高含量，之前果實中番茄紅素含量甚微，如番茄、西瓜；二是幼果階段番茄紅素開始較緩慢的合成，而在成熟階段其大量合成，并在果實中快速積累，如紅肉臍橙［3］。這些說明不同植物基因型的差異及特定組織器官發(fā)育階段的不同均會導致番茄紅素合成速率的差異。

圖1　植物番茄紅素生物合成途徑

番茄紅素的合成是植物類胡蘿卜素生物合成代謝過程中的一個分支部分，只有系統(tǒng)地研究類胡蘿卜素的代謝途徑，才能闡明番茄紅素的生物合成過程。早在20世紀50、60年代類胡蘿卜素合成代謝的主要途徑已經(jīng)基本明確（圖1），近年來大量研究表明，合成途徑中關鍵酶基因已從許多植物中克隆出來，并進行相關基因功能驗證分析，這為利用植物基因工程手段定向調(diào)控其合成途徑提供依據(jù)。

IPP（異戊烯焦磷酸）是番茄紅素合成的最直接前體物質(zhì)，也是異戊二烯化合物合成途徑的共同前體。高等植物體進行光合作用，從葡萄糖合成開始，經(jīng)過各種途徑合成異戊烯焦磷酸（IPP）。二甲基丙烯基二磷酸（DMAPP）是IPP在IPP異構酶（IPPI）催化下生成的物質(zhì)，然后DMAPP在GGPP合成酶（GGPS）作用下與3分子IPP縮合，分別生成牻牛兒焦磷酸（GPP）、法呢基焦磷酸（FPP）、牻牛兒基牻牛兒焦磷酸（GGPP）。GPP為番茄紅素、單萜類物質(zhì)的合成提供前體。萜類衍生物如長醇、甾醇、倍半萜等和類胡蘿卜素的合成前體物質(zhì)是FPP。GGPP的直接產(chǎn)物是八氫番茄紅素、葉綠素、維生素A、赤霉素、磷酸甘油醛、質(zhì)體醌、泛醌等物質(zhì)。

在八氫番茄紅素合成酶（PSY）催化作用下2個GGPP在質(zhì)體中縮合形成最初產(chǎn)物C40類胡蘿卜素八氫番茄紅素。之后，番茄紅素在ζ-胡蘿卜素脫氫酶（ZDS）、八氫番茄紅素脫氫酶（PDS）和類胡蘿卜素異構酶（CRTISO）的共同催化作用下，經(jīng)過持續(xù)的脫氫反應產(chǎn)生。也就是說，八氫番茄紅素合成酶的直接產(chǎn)物是番茄紅素。番茄紅素環(huán)化酶在類胡蘿卜素生物合成代謝過程中催化番茄紅素的降解，即番茄紅素在番茄紅素β-環(huán)化酶（LCYb）和ε-環(huán)化酶（LCYe）的協(xié)同作用下生成α-胡蘿卜素；在β-環(huán)化酶（LCYb）的作用下合成β-胡蘿卜素。

2　番茄紅素合成途徑中的重要酶及相關基因在基因工程上應用的研究

近幾年，人們對番茄紅素生物合成途徑中的一些重要酶做了大量的研究，并取得了新的突破。但是對植物體內(nèi)番茄紅素形成的調(diào)控機制及其轉錄表達的研究還處于探索階段。所以對番茄紅素合成代謝途徑的調(diào)控是復雜的，可能由多個基因以多種方式進行調(diào)控。

2.1異戊烯基焦磷酸異構酶（IPPI）

IPP異構酶（IPP）催化DMAPP形成IPP。目前已從一些植物的質(zhì)體中純化出來如辣椒、番茄和水仙。已經(jīng)從福壽草、芒果、擬南芥、歐洲榛、煙草、萵苣、玉米、葡萄和甘薯等植物中克隆出來。在許多植物中IPPI以基因家族的形式存在的，擬南芥和煙草中有IPP1和IPP2兩個IPP異構酶。將IPP異構酶轉入大腸桿菌中，類胡蘿卜素在原菌株中的積累明顯增多［4］。姚健等將靈芝IPI基因轉入大腸桿菌中，明顯促進了轉基因菌株中β-胡蘿卜素的積累［5］。據(jù)此可以推測類胡蘿卜素生成的限制因子可能是IPPI。

2.2耗牛兒基耗牛兒基焦磷酸合成酶（GGPS）

GGPP是由三分子IPP和一分子DMAPP在縮合而成，催化酶為GGPP合成酶。八氫番茄紅素合成的直接前體物質(zhì)是GGPP，它對番茄紅素的合成起著重要作用。

已從辣椒、番茄、玉米、柑橘、馬鈴薯、白羽扇豆、長春花、擬南芥、煙草、甘草、銀杏、黃瓜、西瓜和甜瓜等植物中克隆出GGPS基因。GGPS常以多基因家族的形式存在植物中，在擬南芥中克隆了5個不同的GGPS，有2個具有GGPS活性［6］。孫桂樂為提高番茄果實中的番茄紅素含量，將多毛番茄GGPS作為目的基因通過根瘤農(nóng)桿菌EHA105介導導入到普通番茄中，番茄紅素含量顯著增加［7］。鄒芳玲等將多毛番茄GGPS基因轉入到番茄中，番茄紅素的積累增加，含量的也明顯提高［8］。呂品等從西瓜果實中克隆GGPS的cDNA全長1445 bp，與甜瓜和黃瓜的GGPS同源性相似度高達90%以上。實時定量PCR分析表明紅瓤西瓜果實GGPS的表達量最高，白瓤中最低［9］。

2.3八氫番茄紅素合成酶（PSY）

兩分子的GGPP在PSY作用下形八氫番茄紅素。PSY基因是植物番茄紅素合成的第一個關鍵酶基因。PSY基因最早是從番茄中分離出來的。編碼PSY基因已從柑橘、玉米、擬南芥、煙草、水稻、甜橙、甜瓜和西瓜等植物中克隆出來。研究發(fā)現(xiàn)，在很多數(shù)植物中PSY基因表達呈現(xiàn)單一，但在一些植物中PSY常常以家族基因的形式存在。如在木薯、玉米、胡蘿卜、煙草、甜瓜、番茄等植物中有兩個PSY基因（PSY1、PSY2）表達，而在水稻、西瓜中有三個PSY基因表達，龍膽、蘋果中有4個PSY。盧鋼等將同源克隆的PSY基因反義導入中國水仙，結果抑制了GGPP向八氫番茄紅素的轉化［10］。利用RNAi手段，抑制了轉基因蘭花PSY基因的表達，減少了類胡蘿卜含量的積累，同時番茄紅素含量明顯下降［11］。Kim等發(fā)現(xiàn)在辣椒果實成熟過程中，PSY基因上有一個位點突變，致使橙色果實中PSY基因表達量顯著高于紅色果實。說明PSY基因剪接受體位點突變可以減少果實著色［12］。EjPSY2A基因在白肉枇杷果實中發(fā)生突變?nèi)笔В瑢е虏荒茉诠庵蟹e累類胡蘿卜素［13］。將ChPSY導入番茄植株中，ChPSY基因在轉基因番茄中的高量表達使總類胡蘿卜素、番茄紅素含量顯著增加［14］。Zhang等從柑橘中克隆得到PSY基因，將其導入植物中PSY基因表達量顯著增加，番茄紅素、β-胡蘿卜素等在果實中的積累明顯增多［15］。朱海生在草莓中克隆得到PSY基因，研究表明PSY在草莓不同組織的表達量存在差異，PSY基因表達量最高的部位是花，在果實、老葉組織中依次減少、新葉中表達量最低。隨著果實的生長，表達量呈遞增趨勢，在成熟果實中的表達量最強［16］。Yan等將西瓜中PSY-C基因導入甜瓜，PSY-C在所有組織中均表達，果皮中表達量高于果肉和胎座組織，但僅在果皮中檢測到番茄紅素；轉基因甜瓜果實β-胡蘿卜素和番茄紅素含量顯著增加［17］。

2.4八氫番茄紅素去飽和酶（PDS）、ζ-胡蘿卜素去飽和酶（ZDS）和類胡蘿卜素異構酶（CRTISO）

八氫番茄紅素在PDS作用下生成ζ-胡蘿卜素；ζ-胡蘿卜素在ZDS催化下轉化為番茄紅素；因此，PDS和ZDS是植物番茄紅素合成過程中很重要的酶基因，參與類胡蘿卜素生成。大量研究表明，PDS基因也從玉米、甘薯、大豆、水稻、黃水仙和煙草等植物中克隆出來；從擬南芥、黃水仙、龍膽草、木瓜、辣椒及小麥等植物中分離出ZDS基因。Chamovitz等最早將PDS基因從藍藻中分離出來，通過對抗除草劑藍藻突變體的研究，結果表明PDS是類胡蘿卜素合成途徑的限速酶［18］。Yan等CpPDS 和CpZDS基因從番木瓜中分離純化出來，在植株的各個組織中都有表達，在成熟果實中大量表達［19］。Rodrigo等從成熟柑橘果實中分別分離出了PDS和ZDS兩個基因，兩個基因的表達，促進了果實中類胡蘿卜素的積累及含量的提高［20］。

反式結構的番茄紅素是植物果實中的主要存在形式，CRTISO能將順式結構的原番茄紅素異構成反式結構，目前已從番茄、玉米、柑橘、黃花水仙和金盞銀臺等作物中分離出CRTISO基因。Isaacson等發(fā)現(xiàn)番茄植株中缺少CRTISO酶基因，增加了果實中7，9，7′，9′-四順式-番茄紅素的積累，原核表達試驗也表明，CRTISO在植物綠色組織中均有表達，但在果實成熟期大量表達［21］。

2.5番茄紅素β-環(huán)化酶（LCYB）和番茄紅素ε-環(huán)化酶（LCYE）

植物體內(nèi)存在分別催化番茄紅素生成β環(huán)的LCY-b和ε環(huán)的LCY-e的兩種番茄紅素環(huán)化酶，它們參與番茄紅素的環(huán)化反應，是番茄紅素向胡蘿卜素轉化的2個關鍵酶。LCY-e催化番茄紅素生成δ-胡蘿卜素；番茄紅素分子兩個末端在LYC-b催化作用下均形成β-環(huán)后，生成β-胡蘿卜素，α-胡蘿卜素是在β及ε兩種環(huán)化酶共同催化時才能生成［22］。LCYB基因（Lcyb）最早從擬南芥中克隆得到的。Cunningham等將LCY-b和LCY-e分別從擬南芥中克隆出來，這兩個基因氨基酸序列同源性達36%，均以單拷貝形式存在，在結構上也較為相似［23］。目前已從辣椒、番茄、胡蘿卜、黃水仙、金盞菊、柑橘、黃龍膽、馬鈴薯和枸杞等眾多植物中分離出編碼LCYB的基因；LCYE基因也從番茄、擬南芥和柑橘等植物中克隆出來。Ronen等發(fā)現(xiàn)番茄中存在2個Lcyb拷貝，且都能調(diào)控番茄紅素的形成［24］。將DcLcyb基因導入了胡蘿卜中，DcLcyb1基因的過量表達，使轉基因胡蘿卜中總類胡蘿卜素和β-胡蘿卜素含量顯著增加［25］。Davuluri等利用RNAi技術使LYC-e基因不表達，促進了番茄果實中番茄紅素的積累，與對照相比，番茄紅素含量差異不太顯著［26］。利用RNAi技術，對LYC-b基因進行調(diào)控，結果抑制LCY-b基因的表達，轉基因番茄中番茄紅素含量顯著增加［27］。Rosati等將番茄紅素β-環(huán)化酶基因導入番茄植株，通過正調(diào)節(jié)顯著提高番茄果實β-胡蘿卜素含量；而負調(diào)節(jié)能50%抑制果實中Lcy-b基因的表達量［28］。王巧麗等構建了LYC-B干擾載體，并證明了其在不同果皮顏色的番茄果實、種子和葉片部位都能表達［29］。

3　番茄紅素合成中相關酶基因轉錄表達水平的研究

Wang等研究表明在胡蘿卜根發(fā)育過程中，DcPSY1和DcPSY2的表達量和類胡蘿卜素含量呈正相關；成熟葉中DcPSY1的表達量明顯高于DcPSY2，總類胡蘿卜素含量顯著高于根中；這些結果表明DcPSY1似乎對葉片中類胡蘿卜素的積累有促進作用，但它們不是根顏色形成的重要因子［30］。張玲等研究表明黃肉枇杷果皮和果實中β-胡蘿卜素含量呈增加趨勢，而白肉枇杷果皮表現(xiàn)持續(xù)增加，果肉呈下降趨勢；PSY和CYCB在果皮部位中有較高的表達量，而CYCB和BCH在果肉部位高量表達，揭示枇杷果實不同發(fā)育期類胡蘿卜素的形成由PSY、CYCB、BCH基因的協(xié)同調(diào)控［31］。Korakot等研究了南瓜種間雜交自交系及其父本果實發(fā)育過程中類胡蘿卜素合成相關基因（PSY1，PDS，ZDS，LCYB，LCYE，CHYB，ZEP，andCCD1）的轉錄表達，發(fā)現(xiàn)中國南瓜SPY1和其他基因表達量均較低，導致類胡蘿卜含量較低；CHYB和ZEP基因表達導致成熟印度南瓜紫黃質(zhì)和葉黃素含量增加；種間雜交自交系SPY1和CHYB基因高量表達，可能引起類胡蘿卜素葉黃素積累增加［32］。Qin等對哈密瓜的不同組織進行了CmPSY1和CmPSY2的轉錄表達研究，CmPSY1在葉、莖、花和果實中均表達，CmPSY2僅在根中表達；CmPSY1在授粉后40天的果實中表達量最高［33］。

近幾年已經(jīng)對不同物種間相關酶基因進行了大量研究，對同一物種不同特性相關基因的轉錄表達也相續(xù)開展。對五個西瓜不同瓤色Psy，Pds，Zds，CrtIso，Lcyb，Chyb，Nced1，Nced2，Nced3酶基因表達研究發(fā)現(xiàn)，在紅色和粉色品種中，Lcyb和Chyb表達下降，可能與番茄紅素和β-胡蘿卜素大量積累相一致；淡黃瓤品種中沒有檢測到CRTISO基因表達，橙黃色西瓜瓤中CRTISO呈現(xiàn)較低表達量，而其它基因在不同瓤色和組織中表達量均未達到顯著差異水平［34］。袁平麗等研究發(fā)現(xiàn)西瓜果實發(fā)育前期番茄紅素合成關鍵酶基因（PSY-A和LCYB表達量逐漸升高，成熟時又急劇下降。在不同倍性品種不同發(fā)育期PSY-A和LCYB基因的表達量也存在明顯差異，三倍體明顯高于二倍體和四倍體［35］。Grassi等報道在西瓜發(fā)育過程中LCYB和LCYE表達一直維持在較低的水平，導致番茄紅素在紅瓤西瓜中積累［36］。

基因表達調(diào)控是植物番茄紅素和類胡蘿卜素積累的一個至關重要的調(diào)節(jié)機制。然而，僅僅從基因表達方面解釋番茄紅素及類胡蘿卜素在不同組織中的積累機制還不夠。為了更好的理解番茄紅素和類胡蘿卜素的積累機制，進一步研究轉錄和轉錄后調(diào)控色素體生物起源是必須的。

4　結語

植物番茄紅素生物合成是一個比較復雜的過程，合成酶基因片段或全片段已經(jīng)先后從很多植物中分離克隆出來，并對這些酶基因的功能及表達調(diào)控進行了大量的研究，也取得新的進展。以往人們對植物番茄紅素的研究主要集中在影響番茄紅素合成的因素、番茄紅素測定方法及對SPY和LCYb的調(diào)控等方面。目前番茄紅素生物合成途徑中相關酶基因的克隆轉化、基因功能驗證及利用基因工程手段調(diào)控番茄紅素的合成代謝等方面已成為眾多研究者關注的焦點。用基因調(diào)控的方法對類胡蘿卜素代謝實施“定向調(diào)節(jié)”以增強目的基因的超量表達，或利用反義RNA技術抑制植物番茄紅素合成相關酶基因表達等都有較多的研究成果。因此，利用基因工程技術正向或反向調(diào)控番茄紅素代謝成為一個新的研究熱點。在生物信息學、轉錄組學、基因組學等生物技術的推動下，己研發(fā)出適合不同條件的基因克隆方法，利用以上方法可以有效地進行番茄紅素合成途徑中相關酶基因分離純化，提高外源基因在植物中的超量表達，或使外源基因沉默，使植物番茄紅素大量合成成為現(xiàn)實；并有助于進一步明確重要基因的特殊功能，為轉基因的研究提供理論基礎。近年來，芯片技術和高通量測序技術和TALENs等靶向基因修飾技術的應用為提高植物體番茄紅素含量，改良植物營養(yǎng)品質(zhì)提供科學手段，為進一步深入開展番茄紅素的研究提供依據(jù)。

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［責任編輯：錢立武］

Q946

A

1674-1102（2016）03-0043-05

10.13420/j.cnki.jczu.2016.03.0010

2016-01-21

安徽省高等學校自然科學研究項目（KJ2013B171）。

呂慧芳（1982-），女，河南開封人，池州學院美術與設計學院講師，碩士，研究方向為蔬菜品質(zhì)調(diào)控，連作與土壤的互作效應及其調(diào)控；劉四運（1963-），男，安徽懷寧人，池州學院化學與材料工程學院副教授，研究方向為新型無機納米材料及其應用。