Notch2分子對慢性乙型肝炎患者CD8+T細胞功能的影響及意義

李彧　連建奇　張野　王九萍　魏欣　張鴻　曹寧家　田穎　白雪帆

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Notch2分子對慢性乙型肝炎患者CD8+T細胞功能的影響及意義

李彧連建奇張野王九萍魏欣張鴻曹寧家田穎白雪帆

目的觀察慢性乙型肝炎患者外周血CD8+T細胞中Notch2分子的表達情況，并分析Notch2分子對CD8+T細胞功能的影響。方法選擇30例慢性乙型肝炎患者和15名健康對照者，應用密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，應用免疫磁珠法分離CD8+T細胞，應用反轉錄實時定量PCR法檢測CD8+T細胞中Notch2 mRNA的表達水平。將分離的CD8+T細胞與HepG2.2.15細胞混合培養，并加入抗Notch2抗體，培養48 h后應用CCK-8法檢測細胞增殖，應用ELISA法檢測上清中IFN-γ、IL-2及TNF-α的表達水平。結果慢性乙型肝炎患者CD8+T細胞中Notch2 mRNA的表達水平明顯升高，較健康對照者升高超過5倍。應用抗Notch2抗體抑制Notch2分子信號通路后，混合培養細胞的增殖水平(8.88±1.56)×105較同型對照組(4.47±1.13)×105和空白對照組(4.39±0.95)×105均明顯升高，培養上清中的IFN-γ：3815±807 pg/mL和TNF-α：346.3±77.3 pg/mL的表達水平也較同型對照組IFN-γ：1316±484 pg/mL；TNF-α：139.8±40.1 pg/mL及空白對照IFN-γ：1383±604 pg/mL；TNF-α：124.0±45.5 pg/mL組顯著升高，差異均具有統計學意義。結論HBV感染可能通過提高Notch2的表達抑制CD8+T細胞的殺傷功能，誘導機體免疫耐受，導致感染慢性化。

慢性乙型肝炎；Notch1；Notch2；CD8+T淋巴細胞

乙型肝炎嚴重威脅人類的生命健康。乙型肝炎病毒(HBV)是一種不直接引起細胞破壞的嗜肝DNA病毒，可以導致慢性肝炎、肝硬化乃至肝癌[1]。其肝臟損傷的機制主要是由機體免疫系統介導的，并依賴于病毒的不斷復制。在急性自限性乙型肝炎患者體內可以發現多特異性的較高強度的CTL和Th細胞反應，而在慢性HBV感染者體內病毒特異性CTL和Th細胞存在數量和功能上的缺陷[2]。但有關乙型肝炎患者免疫功能及感染機體對抗HBV免疫應答的調控機制研究仍然較少。

Notch分子是一類高度保守的受體蛋白，廣泛存在于細胞表面并介導細胞間信號傳遞。在哺乳動物中，Notch分子可以分為4個類型，即Notch1～Notch4[3]。Notch信號通路調控細胞增殖、分化和凋亡的功能涉及幾乎所有的組織和器官，在免疫細胞分化和免疫調控方面也發揮重要作用。研究發現，抗原提呈細胞(APC)可以通過Notch信號通路調節CD4+T細胞的分化[4]，而Notch2胞內活化基序(N2ICD)可與磷酸化的轉錄因子CREB1相互作用，聯合轉錄共激活因子P300共同形成復合物，作用于粒酶B基因啟動子區，促進粒酶B基因轉錄，從而增強CD8+T細胞的細胞毒性作用[5]。但目前尚未見有關Notch2信號在HBV感染中的研究報道。本研究主要檢測了慢性乙型肝炎患者CD8+T細胞中Notch2分子的表達水平，并進一步分析Notch2對CD8+T細胞功能的影響。

資料和方法

一、主要試劑和儀器

淋巴細胞分離液為美國Sigma公司產品，CD8+T細胞分離試劑盒為美國美天旎公司產品，RNA提取試劑盒為德國Qiagen公司產品，反轉錄試劑盒為日本Takara公司產品，實時定量PCR試劑盒為日本Takara公司產品，抗Notch2多克隆抗體為英國Abcam公司產品，CCK-8試劑盒為美國Alexis公司產品，干擾素(IFN)-γ、白細胞介素(IL)-2、腫瘤壞死因子(TNF)-α ELISA檢測試劑盒為美國eBioscience公司產品。PCR儀為美國Applied Biosystems公司的ABI 7500，分光光度儀為美國伯樂公司產品。日本Olympus生化分析儀進行肝功能檢測，試劑為英國朗道公司產品。ELISA法檢測乙型肝炎病毒血清標志物，試劑盒由上海科華試劑有限公司提供。熒光定量RT-PCR法檢測血清HBV DNA，試劑盒由中山醫科大學達安基因股份有限公司提供。

二、研究對象

慢性乙型肝炎患者30例均為陜西省人民醫院感染性疾病科2012年5月至2013年1月的門診患者，診斷標準均符合2010年發布的《慢性乙型肝炎防治指南》，并經ELISA檢測HBsAg、抗HBs、HBeAg、抗HBe和抗HBc，實時定量PCR檢測血清HBV DNA載量及肝功能檢測和B超檢查得以證實。入組患者從未接受過抗病毒治療，并排除其他肝炎病毒感染及合并自身免疫性、酒精性肝病等疾病。另選15例年齡和性別配對的健康人作為研究對照。入組所有病例及對照均簽署知情同意書。各組患者及健康對照入組時情況，見表1。

表1　慢性乙型肝炎患者及健康對照入組時一般情況

三、外周血單個核細胞(PBMCs)和CD8+T細胞的分離

應用EDTA抗凝管采集入組志愿者外周靜脈血20 mL，2 h內應用密度梯度離心法分離PBMCs，分離后調整細胞濃度至107個/管凍存于液氮備用。應用CD8免疫磁珠(MACS)分選PBMC中的CD8+T細胞。取107個PBMC，300 g、4℃、離心5 min后棄上清，用80 μL緩沖液重懸細胞，向細胞懸液中加入20 μL CD8免疫磁珠，于4℃孵育50 min后用1 mL緩沖液洗滌，300 g、4℃、離心5 min后棄上清，用500 μL緩沖液重懸細胞。同時，用500μL緩沖液浸潤MS分離柱，將分離柱固定于磁力分離架上，將上述細胞懸液加入分離柱中，用重力作用使細胞懸液通過分離柱，CD8+T細胞結合于分離柱中，未結合免疫磁珠的細胞則通過分離柱，用500 μL緩沖液洗滌分離柱3次，然后將分離柱從磁力分離架上取下，用1 mL緩沖液洗滌，將CD8+T細胞洗脫，并計數后進行下一步實驗。

四、實時定量PCR

取1×105個CD8+T細胞，應用RNA提取試劑盒提取總RNA，并應用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，實時定量PCR法檢測Notch2分子的表達水平。Notch2的引物序列如下，上游引物：5’-GGC ATT AAT CGC TAC AGT TGT GTC T-3’；下游引物：5’-GGA GGC ACA CTC ATC AAT GTC A-3’。應用18S rRNA作為內參照，引物序列如下，上游引物：5’-CGC CGC TAG AGG TGA AAT TC-3’；下游引物：5’-TTG GCA AAT GCT TTC GCT C-3’。PCR反應條件為：95℃ 10 min 1個循環，95℃ 10 s，60℃ 34 s，共45個循環[6]。應用2-ΔΔCt法分析Notch2 mRNA的相對表達水平。

五、混合細胞培養

從入組的30例慢性乙型肝炎患者中選取11例患者，取2105個CD8+T細胞以RPMI 1640+10% FBS培養，同時加入HBV Core 18-27肽段(10 μg/mL)進行刺激3 d，然后將CD8+T細胞與HepG2.2.15細胞分別以1:6的比例進行混合培養，在混合培養室，試驗組加入抗Notch2抗體，對照組加入同型對照的多克隆抗體IgG，空白對照組僅加入等量的培養液。混合培養48 h后，收集細胞及上清。

六、細胞增殖試驗

在培養的最后4 h向培養板中加入20 μL的CCK-8溶液。將含有已知數量的PBMC進行倍比稀釋，制作標準曲線。應用分光光度儀測量450 nm的吸光度。

七、ELISA檢測

應用ELISA檢測試劑盒對培養上清中的IFN-γ、IL-2和TNF-α進行檢測。

八、統計學分析

數據采用SPSS 17.0進行分析。多組數據間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

結　　果

一、Notch2 mRNA在慢性乙型肝炎患者外周血CD8+T細胞中的表達升高

慢性乙型肝炎患者外周血CD8+T細胞中Notch2 mRNA的相對表達水平較健康對照者中明顯升高，升高超過5倍，兩者比較差異具有統計學意義(P=0.029，圖1)。

圖1　健康對照和慢性乙型肝炎患者外周血CD8+T

二、抑制Notch2分子表達可促進細胞增殖

在混合細胞培養中分別加入抗Notch2抗體、同型對照抗體IgG和培養液，抗Notch2抗體可抑制Notch2分子的表達。如圖2所示，同型對照抗體不影響混合培養細胞的增殖[細胞總數為：(4.47±1.13)×105]，而加入抗Notch2抗體的混合培養細胞的增殖水平明顯升高[細胞總數為：(8.88±1.56)×105]，與同型對照組(P=0.0037)和空白對照組[細胞總數為：(4.39±0.95)×105，P=0.0026]，比較差異均有統計學意義。

圖2　抗Notch2抗體和同型對照抗體對混合培養細胞增殖的影響

三、抑制Notch2分子表達增加IFN-γ和TNF-α的表達

混合培養48 h后收集培養上清，應用ELISA法對培養上清中的IFN-γ、IL-2和TNF-α水平進行檢測。在所有細胞培養上清中均未檢測到IL-2的表達。如圖3所示，抑制Notch2分子表達可明顯增加IFN-γ(3815±807) pg/mL和TNF-α(346.3±77.3) pg/mL的表達，與同型對照抗體(IFN-γ：1316±484 pg/mL；TNF-α：139.8±40.1 pg/mL)和空白對照(IFN-γ：1383±604 pg/mL；TNF-α：124.0±45.5 pg/mL)組相比，差異均具有統計學意義。

圖3　混合培養上清中IFN-γ(A)和TNF-α(B)的表達水平

討　　論

病毒感染細胞后，病毒抗原或病毒自身均可作為內源性抗原被抗原提呈細胞的MHC-I類分子提呈，主要激發機體T細胞免疫，尤其是CD8+T細胞的CTL功能的激活，是機體清除病毒的主力軍。HBV感染亦是如此，CD8+T細胞介導的免疫應答在病毒清除中發揮著中樞作用[7]。而對于HBV感染慢性化的患者而言，機體CD8+T細胞免疫應答的低反應性是造成免疫耐受和免疫逃逸現象的重要原因。在急性自限性HBV感染者體內存在強烈的CD8+T細胞應答，機體可以高效清除病毒感染；而慢性乙型肝炎患者免疫水平底下，機體處于免疫耐受或免疫抑制狀態，病毒特異性CD8+T細胞數量和應答水平下降，免疫功能降低甚至消失殆盡，無法清除HBV，導致持續慢性病毒感染[8-11]。但是，CD8+T細胞功能低下的確切機制尚未完全闡明。研究者們試圖從高病毒載量和高抗原量導致特異性CD8+T 細胞數量和功能下降、樹突狀細胞功能低下、肝臟局部免疫耐受、調節性T細胞免疫抑制和免疫抑制分子等角度闡明此問題[11-13]。但現有的研究仍沒有取得突破性進展。

Notch信號通路可以調節CD4+T細胞和CD8+T細胞的功能。同時，Notch信號通路也可直接調控肝細胞和肝血竇內皮細胞的生物學活性，在維持肝臟穩態和促進肝細胞再生過程中發揮重要作用[14]。因此，Notch信號通路在HBV感染免疫中也可能發揮重要作用。既往研究發現，HBV X蛋白可通過活化Notch信號通路促進肝細胞的增殖與分化[15]。Pei等[16]對Notch1在HBV中的作用進行了研究，Notch1在慢性乙型肝炎CD4+T細胞中的表達升高，但在急性乙型肝炎中的表達與健康對照者比較未見明顯變化。阻斷Notch1信號通路可以明顯抑制Th2類細胞因子和GATA-3的表達，而Th1類細胞因子和T-bet的表達卻顯著升高。這提示在慢性乙型肝炎患者中，Notch1信號通路可通過調節轉錄因子T-bet和GATA-3的表達使Th1/Th2的免疫失衡，促進感染慢性化。而既往研究發現，在生理狀態下，Notch2可增強CD8+T細胞的細胞殺傷功能[5]。但本研究發現，在HBV感染過程中，Notch2的表達較健康對照者明顯升高，由于慢性乙型肝炎患者存在CD8+T細胞的功能低下，提示在慢性HBV感染過程中Notch2可能抑制CD8+T細胞的功能。進一步應用抗Notch2抗體阻斷Notch2信號通路，觀察阻斷Notch2信號通路對CD8+T細胞功能的影響。研究發現，阻斷Notch2信號通路可顯著促進培養細胞的增殖，增加細胞因子的分泌。這進一步證實了在HBV感染過程中，Notch2對CD8+T細胞存在負性調控作用。但由于本研究標本數量偏少，且均為體外實驗，還需擴大樣本及應用HBV轉基因小鼠模型進行體內試驗進一步證明本結論。

總之，慢性HBV感染可能通過提高Notch2的表達水平進而抑制CD8+T細胞的功能，從而誘導機體的免疫耐受，促進感染慢性化。Notch2也可能作為抗HBV治療新的靶點，為抗病毒治療和打破免疫耐受提供新的思路。

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(本文編輯：易玲)

2015-03-24)

陜西省自然科學基金資助項目(編號：2013JQ4013)

710054陜西西安陜西省人民醫院感染性疾病科 (李彧、張鴻、曹寧家)；第四軍醫大學唐都醫院感染科(白雪帆、連建奇、張野、魏欣)；第四軍醫大學西京醫院感染科(王九萍)；陜西省中醫醫院婦科(田穎)

白雪帆，Email：xfbai2011@163.com