Notch2分子對慢性乙型肝炎患者CD8+T細(xì)胞功能的影響及意義

李彧　連建奇　張野　王九萍　魏欣　張鴻　曹寧家　田穎　白雪帆

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Notch2分子對慢性乙型肝炎患者CD8+T細(xì)胞功能的影響及意義

李彧連建奇張野王九萍魏欣張鴻曹寧家田穎白雪帆

目的觀察慢性乙型肝炎患者外周血CD8+T細(xì)胞中Notch2分子的表達情況，并分析Notch2分子對CD8+T細(xì)胞功能的影響。方法選擇30例慢性乙型肝炎患者和15名健康對照者，應(yīng)用密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞，應(yīng)用免疫磁珠法分離CD8+T細(xì)胞，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄實時定量PCR法檢測CD8+T細(xì)胞中Notch2 mRNA的表達水平。將分離的CD8+T細(xì)胞與HepG2.2.15細(xì)胞混合培養(yǎng)，并加入抗Notch2抗體，培養(yǎng)48 h后應(yīng)用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖，應(yīng)用ELISA法檢測上清中IFN-γ、IL-2及TNF-α的表達水平。結(jié)果慢性乙型肝炎患者CD8+T細(xì)胞中Notch2 mRNA的表達水平明顯升高，較健康對照者升高超過5倍。應(yīng)用抗Notch2抗體抑制Notch2分子信號通路后，混合培養(yǎng)細(xì)胞的增殖水平(8.88±1.56)×105較同型對照組(4.47±1.13)×105和空白對照組(4.39±0.95)×105均明顯升高，培養(yǎng)上清中的IFN-γ：3815±807 pg/mL和TNF-α：346.3±77.3 pg/mL的表達水平也較同型對照組IFN-γ：1316±484 pg/mL；TNF-α：139.8±40.1 pg/mL及空白對照IFN-γ：1383±604 pg/mL；TNF-α：124.0±45.5 pg/mL組顯著升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論HBV感染可能通過提高Notch2的表達抑制CD8+T細(xì)胞的殺傷功能，誘導(dǎo)機體免疫耐受，導(dǎo)致感染慢性化。

慢性乙型肝炎；Notch1；Notch2；CD8+T淋巴細(xì)胞

乙型肝炎嚴(yán)重威脅人類的生命健康。乙型肝炎病毒(HBV)是一種不直接引起細(xì)胞破壞的嗜肝DNA病毒，可以導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化乃至肝癌[1]。其肝臟損傷的機制主要是由機體免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的，并依賴于病毒的不斷復(fù)制。在急性自限性乙型肝炎患者體內(nèi)可以發(fā)現(xiàn)多特異性的較高強度的CTL和Th細(xì)胞反應(yīng)，而在慢性HBV感染者體內(nèi)病毒特異性CTL和Th細(xì)胞存在數(shù)量和功能上的缺陷[2]。但有關(guān)乙型肝炎患者免疫功能及感染機體對抗HBV免疫應(yīng)答的調(diào)控機制研究仍然較少。

Notch分子是一類高度保守的受體蛋白，廣泛存在于細(xì)胞表面并介導(dǎo)細(xì)胞間信號傳遞。在哺乳動物中，Notch分子可以分為4個類型，即Notch1～Notch4[3]。Notch信號通路調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡的功能涉及幾乎所有的組織和器官，在免疫細(xì)胞分化和免疫調(diào)控方面也發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，抗原提呈細(xì)胞(APC)可以通過Notch信號通路調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞的分化[4]，而Notch2胞內(nèi)活化基序(N2ICD)可與磷酸化的轉(zhuǎn)錄因子CREB1相互作用，聯(lián)合轉(zhuǎn)錄共激活因子P300共同形成復(fù)合物，作用于粒酶B基因啟動子區(qū)，促進粒酶B基因轉(zhuǎn)錄，從而增強CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用[5]。但目前尚未見有關(guān)Notch2信號在HBV感染中的研究報道。本研究主要檢測了慢性乙型肝炎患者CD8+T細(xì)胞中Notch2分子的表達水平，并進一步分析Notch2對CD8+T細(xì)胞功能的影響。

資料和方法

一、主要試劑和儀器

淋巴細(xì)胞分離液為美國Sigma公司產(chǎn)品，CD8+T細(xì)胞分離試劑盒為美國美天旎公司產(chǎn)品，RNA提取試劑盒為德國Qiagen公司產(chǎn)品，反轉(zhuǎn)錄試劑盒為日本Takara公司產(chǎn)品，實時定量PCR試劑盒為日本Takara公司產(chǎn)品，抗Notch2多克隆抗體為英國Abcam公司產(chǎn)品，CCK-8試劑盒為美國Alexis公司產(chǎn)品，干擾素(IFN)-γ、白細(xì)胞介素(IL)-2、腫瘤壞死因子(TNF)-α ELISA檢測試劑盒為美國eBioscience公司產(chǎn)品。PCR儀為美國Applied Biosystems公司的ABI 7500，分光光度儀為美國伯樂公司產(chǎn)品。日本Olympus生化分析儀進行肝功能檢測，試劑為英國朗道公司產(chǎn)品。ELISA法檢測乙型肝炎病毒血清標(biāo)志物，試劑盒由上海科華試劑有限公司提供。熒光定量RT-PCR法檢測血清HBV DNA，試劑盒由中山醫(yī)科大學(xué)達安基因股份有限公司提供。

二、研究對象

慢性乙型肝炎患者30例均為陜西省人民醫(yī)院感染性疾病科2012年5月至2013年1月的門診患者，診斷標(biāo)準(zhǔn)均符合2010年發(fā)布的《慢性乙型肝炎防治指南》，并經(jīng)ELISA檢測HBsAg、抗HBs、HBeAg、抗HBe和抗HBc，實時定量PCR檢測血清HBV DNA載量及肝功能檢測和B超檢查得以證實。入組患者從未接受過抗病毒治療，并排除其他肝炎病毒感染及合并自身免疫性、酒精性肝病等疾病。另選15例年齡和性別配對的健康人作為研究對照。入組所有病例及對照均簽署知情同意書。各組患者及健康對照入組時情況，見表1。

表1　慢性乙型肝炎患者及健康對照入組時一般情況

三、外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)和CD8+T細(xì)胞的分離

應(yīng)用EDTA抗凝管采集入組志愿者外周靜脈血20 mL，2 h內(nèi)應(yīng)用密度梯度離心法分離PBMCs，分離后調(diào)整細(xì)胞濃度至107個/管凍存于液氮備用。應(yīng)用CD8免疫磁珠(MACS)分選PBMC中的CD8+T細(xì)胞。取107個PBMC，300 g、4℃、離心5 min后棄上清，用80 μL緩沖液重懸細(xì)胞，向細(xì)胞懸液中加入20 μL CD8免疫磁珠，于4℃孵育50 min后用1 mL緩沖液洗滌，300 g、4℃、離心5 min后棄上清，用500 μL緩沖液重懸細(xì)胞。同時，用500μL緩沖液浸潤MS分離柱，將分離柱固定于磁力分離架上，將上述細(xì)胞懸液加入分離柱中，用重力作用使細(xì)胞懸液通過分離柱，CD8+T細(xì)胞結(jié)合于分離柱中，未結(jié)合免疫磁珠的細(xì)胞則通過分離柱，用500 μL緩沖液洗滌分離柱3次，然后將分離柱從磁力分離架上取下，用1 mL緩沖液洗滌，將CD8+T細(xì)胞洗脫，并計數(shù)后進行下一步實驗。

四、實時定量PCR

取1×105個CD8+T細(xì)胞，應(yīng)用RNA提取試劑盒提取總RNA，并應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，實時定量PCR法檢測Notch2分子的表達水平。Notch2的引物序列如下，上游引物：5’-GGC ATT AAT CGC TAC AGT TGT GTC T-3’；下游引物：5’-GGA GGC ACA CTC ATC AAT GTC A-3’。應(yīng)用18S rRNA作為內(nèi)參照，引物序列如下，上游引物：5’-CGC CGC TAG AGG TGA AAT TC-3’；下游引物：5’-TTG GCA AAT GCT TTC GCT C-3’。PCR反應(yīng)條件為：95℃ 10 min 1個循環(huán)，95℃ 10 s，60℃ 34 s，共45個循環(huán)[6]。應(yīng)用2-ΔΔCt法分析Notch2 mRNA的相對表達水平。

五、混合細(xì)胞培養(yǎng)

從入組的30例慢性乙型肝炎患者中選取11例患者，取2105個CD8+T細(xì)胞以RPMI 1640+10% FBS培養(yǎng)，同時加入HBV Core 18-27肽段(10 μg/mL)進行刺激3 d，然后將CD8+T細(xì)胞與HepG2.2.15細(xì)胞分別以1:6的比例進行混合培養(yǎng)，在混合培養(yǎng)室，試驗組加入抗Notch2抗體，對照組加入同型對照的多克隆抗體IgG，空白對照組僅加入等量的培養(yǎng)液。混合培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞及上清。

六、細(xì)胞增殖試驗

在培養(yǎng)的最后4 h向培養(yǎng)板中加入20 μL的CCK-8溶液。將含有已知數(shù)量的PBMC進行倍比稀釋，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。應(yīng)用分光光度儀測量450 nm的吸光度。

七、ELISA檢測

應(yīng)用ELISA檢測試劑盒對培養(yǎng)上清中的IFN-γ、IL-2和TNF-α進行檢測。

八、統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進行分析。多組數(shù)據(jù)間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)　　果

一、Notch2 mRNA在慢性乙型肝炎患者外周血CD8+T細(xì)胞中的表達升高

慢性乙型肝炎患者外周血CD8+T細(xì)胞中Notch2 mRNA的相對表達水平較健康對照者中明顯升高，升高超過5倍，兩者比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.029，圖1)。

圖1　健康對照和慢性乙型肝炎患者外周血CD8+T

二、抑制Notch2分子表達可促進細(xì)胞增殖

在混合細(xì)胞培養(yǎng)中分別加入抗Notch2抗體、同型對照抗體IgG和培養(yǎng)液，抗Notch2抗體可抑制Notch2分子的表達。如圖2所示，同型對照抗體不影響混合培養(yǎng)細(xì)胞的增殖[細(xì)胞總數(shù)為：(4.47±1.13)×105]，而加入抗Notch2抗體的混合培養(yǎng)細(xì)胞的增殖水平明顯升高[細(xì)胞總數(shù)為：(8.88±1.56)×105]，與同型對照組(P=0.0037)和空白對照組[細(xì)胞總數(shù)為：(4.39±0.95)×105，P=0.0026]，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2　抗Notch2抗體和同型對照抗體對混合培養(yǎng)細(xì)胞增殖的影響

三、抑制Notch2分子表達增加IFN-γ和TNF-α的表達

混合培養(yǎng)48 h后收集培養(yǎng)上清，應(yīng)用ELISA法對培養(yǎng)上清中的IFN-γ、IL-2和TNF-α水平進行檢測。在所有細(xì)胞培養(yǎng)上清中均未檢測到IL-2的表達。如圖3所示，抑制Notch2分子表達可明顯增加IFN-γ(3815±807) pg/mL和TNF-α(346.3±77.3) pg/mL的表達，與同型對照抗體(IFN-γ：1316±484 pg/mL；TNF-α：139.8±40.1 pg/mL)和空白對照(IFN-γ：1383±604 pg/mL；TNF-α：124.0±45.5 pg/mL)組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖3　混合培養(yǎng)上清中IFN-γ(A)和TNF-α(B)的表達水平

討　　論

病毒感染細(xì)胞后，病毒抗原或病毒自身均可作為內(nèi)源性抗原被抗原提呈細(xì)胞的MHC-I類分子提呈，主要激發(fā)機體T細(xì)胞免疫，尤其是CD8+T細(xì)胞的CTL功能的激活，是機體清除病毒的主力軍。HBV感染亦是如此，CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答在病毒清除中發(fā)揮著中樞作用[7]。而對于HBV感染慢性化的患者而言，機體CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答的低反應(yīng)性是造成免疫耐受和免疫逃逸現(xiàn)象的重要原因。在急性自限性HBV感染者體內(nèi)存在強烈的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，機體可以高效清除病毒感染；而慢性乙型肝炎患者免疫水平底下，機體處于免疫耐受或免疫抑制狀態(tài)，病毒特異性CD8+T細(xì)胞數(shù)量和應(yīng)答水平下降，免疫功能降低甚至消失殆盡，無法清除HBV，導(dǎo)致持續(xù)慢性病毒感染[8-11]。但是，CD8+T細(xì)胞功能低下的確切機制尚未完全闡明。研究者們試圖從高病毒載量和高抗原量導(dǎo)致特異性CD8+T 細(xì)胞數(shù)量和功能下降、樹突狀細(xì)胞功能低下、肝臟局部免疫耐受、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞免疫抑制和免疫抑制分子等角度闡明此問題[11-13]。但現(xiàn)有的研究仍沒有取得突破性進展。

Notch信號通路可以調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的功能。同時，Notch信號通路也可直接調(diào)控肝細(xì)胞和肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)活性，在維持肝臟穩(wěn)態(tài)和促進肝細(xì)胞再生過程中發(fā)揮重要作用[14]。因此，Notch信號通路在HBV感染免疫中也可能發(fā)揮重要作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，HBV X蛋白可通過活化Notch信號通路促進肝細(xì)胞的增殖與分化[15]。Pei等[16]對Notch1在HBV中的作用進行了研究，Notch1在慢性乙型肝炎CD4+T細(xì)胞中的表達升高，但在急性乙型肝炎中的表達與健康對照者比較未見明顯變化。阻斷Notch1信號通路可以明顯抑制Th2類細(xì)胞因子和GATA-3的表達，而Th1類細(xì)胞因子和T-bet的表達卻顯著升高。這提示在慢性乙型肝炎患者中，Notch1信號通路可通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA-3的表達使Th1/Th2的免疫失衡，促進感染慢性化。而既往研究發(fā)現(xiàn)，在生理狀態(tài)下，Notch2可增強CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞殺傷功能[5]。但本研究發(fā)現(xiàn)，在HBV感染過程中，Notch2的表達較健康對照者明顯升高，由于慢性乙型肝炎患者存在CD8+T細(xì)胞的功能低下，提示在慢性HBV感染過程中Notch2可能抑制CD8+T細(xì)胞的功能。進一步應(yīng)用抗Notch2抗體阻斷Notch2信號通路，觀察阻斷Notch2信號通路對CD8+T細(xì)胞功能的影響。研究發(fā)現(xiàn)，阻斷Notch2信號通路可顯著促進培養(yǎng)細(xì)胞的增殖，增加細(xì)胞因子的分泌。這進一步證實了在HBV感染過程中，Notch2對CD8+T細(xì)胞存在負(fù)性調(diào)控作用。但由于本研究標(biāo)本數(shù)量偏少，且均為體外實驗，還需擴大樣本及應(yīng)用HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型進行體內(nèi)試驗進一步證明本結(jié)論。

總之，慢性HBV感染可能通過提高Notch2的表達水平進而抑制CD8+T細(xì)胞的功能，從而誘導(dǎo)機體的免疫耐受，促進感染慢性化。Notch2也可能作為抗HBV治療新的靶點，為抗病毒治療和打破免疫耐受提供新的思路。

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(本文編輯：易玲)

2015-03-24)

陜西省自然科學(xué)基金資助項目(編號：2013JQ4013)

710054陜西西安陜西省人民醫(yī)院感染性疾病科 (李彧、張鴻、曹寧家)；第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院感染科(白雪帆、連建奇、張野、魏欣)；第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院感染科(王九萍)；陜西省中醫(yī)醫(yī)院婦科(田穎)

白雪帆，Email：xfbai2011@163.com