祛脂三味方對(duì)非酒精性脂肪性肝病大鼠血脂和氧化應(yīng)激的影響

鄭冊(cè)　陶然　張琴

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祛脂三味方對(duì)非酒精性脂肪性肝病大鼠血脂和氧化應(yīng)激的影響

鄭冊(cè)陶然張琴

目的探索祛脂三味方(QZSWF)對(duì)非酒精性脂肪性肝病大鼠血脂和氧化應(yīng)激的影響及機(jī)理。方法SD雄性大鼠，通過(guò)連續(xù)5周高脂飲食建立脂肪肝模型，考察中藥?kù)钪斗竭B續(xù)給藥4周后對(duì)非酒精性脂肪性肝病大鼠血脂和氧化應(yīng)激的影響。結(jié)果祛脂三味方組與模型組比較低密度脂蛋白(LDL)明顯降低(P<0.05)，與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；祛脂三味方組與模型組比較還原型谷胱甘肽(GSH)顯著升高(P<0.05)，與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；各組大鼠體重變化和各組肝臟重量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。大體標(biāo)本顯示，祛脂三味方組與模型組以局灶型脂肪變?yōu)橹鳎家姀浡灾咀儯徊±砬衅眷钪斗浇M肝臟脂肪變細(xì)胞向匯管區(qū)以放射狀排列。結(jié)論祛脂三味方具有降血脂和抗氧化作用，其機(jī)理主要是通過(guò)降低LDL、升高還原型谷胱甘肽(GSH)。

脂肪肝；血脂；氧化應(yīng)激；祛脂三味方

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指以無(wú)過(guò)量飲酒史的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變性和脂肪貯積為特征的臨床病理綜合診斷，包括非酒精性脂肪肝(NAFL)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)[1]。NASH是NAFLD的進(jìn)展形式，可發(fā)展為肝硬化，并且會(huì)增加肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)[2]。NAFLD已經(jīng)成為發(fā)達(dá)國(guó)家最常見的慢性肝病[3]，過(guò)去20 年其他慢性肝病的發(fā)病率呈下降趨勢(shì)，而NAFLD 的發(fā)病率卻逐漸增加，甚至翻番[4]。脂肪肝在我國(guó)已經(jīng)取代慢性肝炎成為第一大肝臟疾病[5]。

NASH 致病的確切機(jī)制尚未明確，目前最廣泛接受的理論是1998年Day et al[6]提出的“二次打擊”學(xué)說(shuō)。胰島素抵抗是其發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié)，脂質(zhì)代謝異常是始動(dòng)因子[7]，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)胰島素抵抗(IR)時(shí)，體內(nèi)游離脂肪酸(FFA)大量增多，發(fā)生“一次打擊”；反應(yīng)性氧化代謝產(chǎn)物引發(fā)氧化應(yīng)激則為二次打擊[8]。脂質(zhì)過(guò)氧化是氧化應(yīng)激的主要機(jī)制，氧化應(yīng)激是NAFLD進(jìn)展到NASH的中心環(huán)節(jié)[9-10]，并且氧化應(yīng)激在其脂肪變?cè)缙诰涂赡芤呀?jīng)存在[11]。中醫(yī)藥在治療脂肪肝和降血脂方面具有獨(dú)特的療效，近年國(guó)內(nèi)外的相關(guān)研究從不同方面積累了一定的成果。我們根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)結(jié)合中醫(yī)理論，提出“土壅木郁”假說(shuō)，故擬定中藥?kù)钪斗?山楂、決明子、虎杖)治療本病。前期臨床和基礎(chǔ)研究都證明了，祛脂三味方(QZSWF)對(duì)NASH具有肝功能復(fù)常、調(diào)節(jié)血脂的臨床功效[12-14]。故在此基礎(chǔ)上，研究本方對(duì)NAFLD大鼠血脂和氧化應(yīng)激的影響及作用機(jī)理。

資料和方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

清潔級(jí)SD雄性大鼠18只，8周齡，體重160 g±20 g，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)試劑盒，編號(hào)S0053；總SOD活性檢測(cè)試劑盒(WST-8法)，編號(hào)S0101；脂質(zhì)氧化(MDA)檢測(cè)試劑盒，編號(hào)S0131，均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)。游離脂肪酸(NEFA)檢測(cè)試劑盒，貨號(hào)A042，購(gòu)自南京建成生物技術(shù)。大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒，購(gòu)自上海西塘生物科技有限公司。所有指標(biāo)檢測(cè)都按照說(shuō)明書執(zhí)行。

二、試驗(yàn)方法

(一)動(dòng)物造模所有動(dòng)物飼養(yǎng)于清潔級(jí)環(huán)境。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為3組，每組6只，所有動(dòng)物自由進(jìn)食進(jìn)水。正常組給予常規(guī)大鼠飼料；模型組、祛脂三味方治療組均飼以高脂飼料(各營(yíng)養(yǎng)成分供能比例為蛋白質(zhì)18%,脂肪45%，碳水化合物37%)，每周記錄體重變化和飼料重量變化1次。

(二)給藥方法祛脂三味方給藥劑量：生山楂30，決明子30，虎杖20，按亞洲成人體重60 kg計(jì)算，成人每天劑量為1.3333 g生藥/kg體重，則動(dòng)物(大鼠劑量)給藥如下：1.3333 g/kg 6.25=8.3331 g/kg，按照20 mL/kg的給藥容積給藥，藥品配置濃度為0.4167 g 生藥/mL。

可以此為中劑量，等比設(shè)置高中低劑量組。飼養(yǎng)5周后，從第6周起每天固定時(shí)間給予祛脂三味方灌胃1次，連續(xù)給藥4周，給藥前稱量并做記錄。祛脂三味方用0.5%羥甲基纖維素鈉(CMC)溶媒配置濃度0.6 g/mL溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配，以10 mL/kg實(shí)驗(yàn)劑量，正常組和模型組給予相應(yīng)體積的0.5% CMC灌胃。

(三)標(biāo)本檢測(cè)連續(xù)治療4周，末次給藥后，禁食12 h，不禁水，稱重后，氯胺酮麻醉，進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血。采集血液靜置20 min后，5000 rpm，15 min離心，取上清，檢測(cè)肝功能。隨后完整摘取肝臟，生理鹽水沖洗血漬后，肉眼觀察肝臟色澤、質(zhì)地，并拍照記錄大體外觀，隨后進(jìn)行稱重，記錄肝臟重量。隨后剪取肝臟左側(cè)葉置于福爾馬林溶液中固定；剪取肝臟右中葉，切取3～5 mm厚度均勻的肝臟組織，凍存于OCT包埋劑中，液氮凍存；剩余肝臟組織凍存于-80℃待測(cè)，用于MDA、GSH、SOD、FFA、TNF-α等指標(biāo)檢測(cè)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)　　果

一、祛脂三味方對(duì)NAFLD大鼠體重和肝臟重量的影響

各組大鼠體重變化和各組肝臟重量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明中藥袪脂三味方對(duì)大鼠的體重和肝臟重量改變不明顯(見表1)。

表1　大鼠肝臟數(shù)值

二、祛脂三味方對(duì)NAFLD大鼠肝臟脂肪分布的影響

模型組和祛脂三味方組較正常組肝臟脂肪明顯增多，說(shuō)明脂肪肝模型成功。大體標(biāo)本顯示，祛脂三味方組與模型組以局灶型脂肪變?yōu)橹鳎家姀浡灾咀儯M間比較肝臟脂肪含量差異不明顯(以脂肪變面積計(jì)算)。病理標(biāo)本顯示，祛脂三味方組與模型組脂肪總量差異不明顯，脂肪分布情況有差異，模型組脂肪泡分布散亂不規(guī)則，祛脂三味方組脂肪分布較規(guī)則，向匯管區(qū)集中。結(jié)果說(shuō)明，祛脂三味方能夠改變脂肪肝大鼠的肝臟脂肪分布，其機(jī)制有待進(jìn)一步探索(見圖1和圖2)。

三、祛脂三味方能夠降低單純性脂肪肝大鼠血脂，且以降低LDL為主。

各組大鼠血清生化學(xué)指標(biāo)，結(jié)果以平均值代表各組，標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示誤差。分析肝損害指標(biāo)(見表2)，分析糖脂代謝指標(biāo)(見表3)。結(jié)果表明，NAFLD大鼠模型的肝功能損害及血脂升高不明顯，以ALP、TBil升高為主，血脂升高以TC、TG為主；袪脂三味方對(duì)NAFLD大鼠的輕度肝損害作用不顯著，對(duì)血脂影響以降低LDL為主。

注：模型組較正常組肝臟脂肪明顯增多；祛脂三味方組與模型組以局灶性脂肪變?yōu)橹鳎M間肝臟脂肪含量差異不顯著(以脂肪變面積計(jì)算)

注：正常組與模型組差異顯著；祛脂三味方組與模型組脂肪總量差異不明顯，脂肪分布有差異，模型組脂肪分布散亂不規(guī)則，祛脂三味方組脂肪分布較規(guī)則，以反射狀向匯管區(qū)集中

圖2　各組大鼠肝臟病理組織

注：*表示與正常組比較有差異，#表示與模型組比較有差異。ALT，祛脂三味方組對(duì)模型組(P=0.186>0.05),模型組對(duì)正常組(P=0.405>0.05)；AST，祛脂三味方組對(duì)模型組(P=0.609>0.05),模型組對(duì)正常組(P=0.222>0.05)；ALP，祛脂三味方組對(duì)模型組(P=0.096>0.05),模型組對(duì)正常組(*P=0.013<0.05)；TBil，祛脂三味方組對(duì)模型組(P=0.062>0.05),模型組對(duì)正常組(*P=0.04<0.05)；TBA，祛脂三味方組對(duì)模型組(P=0.513>0.05),模型組對(duì)正常組(P=0.845>0.05)。

表3　血糖血脂的影響(±s)

注：*表示與正常組比較有差異，#表示與模型組比較有差異。血糖(GLU)，祛脂三味方組對(duì)模型組(P=0.708>0.05),模型組對(duì)正常組(P=0.376>0.05)；膽固醇(TC)，祛脂三味方組對(duì)模型組(P=0.138>0.05),模型組對(duì)正常組(*P=0.019<0.05)；甘油三酯(TG)，祛脂三味方組對(duì)模型組(P=0.618>0.05)，模型組對(duì)正常組(*P=0.027<0.05)；低密度脂蛋白(LDL)，祛脂三味方組對(duì)模型組(*P=0.036<0.05)；模型組對(duì)正常組(P=0.109>0.05)；高密度脂蛋白(HDL)，祛脂三味方組對(duì)模型組(P=0.113>0.05)，模型組對(duì)正常組(P=0.024<0.05)；游離脂肪酸(FFA)，祛脂三味方組對(duì)模型組(P=0.392>0.05)，模型組對(duì)正常組(P=0.179>0.05)。

四、祛脂三味方對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠MDA、SOD、GSH、GSSG、TNF-α的影響

模型組與正常組比較，祛脂三味方組與模型組比較，各組冰丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、腫瘤壞死因子(TNF-α)結(jié)果見表4，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表4　大鼠肝臟組織氧化指標(biāo)(±s)

注：*表示與正常組比較有差異，#表示與模型組比較有差異。丙二醛(MDA)，祛脂三味方組對(duì)模型組(P=0.734>0.05),模型組對(duì)正常組(*P=0.011<0.05)；超氧化物歧化酶(SOD)，祛脂三味方組對(duì)模型組(P=0.892>0.05),模型組對(duì)正常組(*P=0.001<0.05)；還原型谷胱甘肽(GSH)，祛脂三味方組對(duì)模型組(#P=0.001<0.05),模型組對(duì)正常組(P=0.463>0.05)；氧化型谷胱甘肽(GSSG)，祛脂三味方組對(duì)模型組(#P=0.001<0.05),模型組對(duì)正常組(P=0.579>0.05)；腫瘤壞死因子(TNF-α)，祛脂三味方組對(duì)模型組(P=0.368>0.05),模型組對(duì)正常組(P=0.78>0.05)。

討　　論

基于多年的臨床經(jīng)驗(yàn)，研究者提出脂肪肝“土壅木郁”的病機(jī)假說(shuō)[15]，并且運(yùn)用祛脂三味方來(lái)“消土壅”、“解木郁”。祛脂三味方由山楂、決明子、虎杖組成，山楂酸、甘，微溫，歸脾、胃、肝經(jīng)，有消食化積、活血散瘀之力; 決明子甘、苦，微寒，歸肝、大腸經(jīng)，取清肝明目、潤(rùn)腸通便之用; 虎杖苦、寒，歸肝、膽、肺經(jīng)，收清熱利濕、活血化瘀之功。故山楂配決明子以“消土壅”證；山楂配虎杖以“解木郁”；以“消土壅”和/或“解木郁”即健脾解郁、疏肝利膽。

脂質(zhì)代謝紊亂和氧化應(yīng)激損傷是NASH發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，祛脂三味方能顯著降低LDL,說(shuō)明袪脂三味方的降血脂作用具有重要臨床意義。氧化應(yīng)激是NAFLD進(jìn)展到NASH的中心環(huán)節(jié)[9]。近年觀察表明，氧化應(yīng)激在NAFLD脂肪變?cè)缙诰涂赡艽嬖凇．?dāng)機(jī)體出現(xiàn)IR時(shí)，F(xiàn)FA大量增多，導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性，產(chǎn)生大量活性氧簇(ROS)[16]。GSH是ROS清除酶的還原底物，反應(yīng)生成的GSSG具有高細(xì)胞毒素[17]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)以GSH為主的抗氧化系統(tǒng)未能及時(shí)清除ROS時(shí)，便產(chǎn)生氧化應(yīng)激，形成脂質(zhì)過(guò)氧化物，即MDA，引起蛋白及核酸損傷，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷死亡。SOD可以把有害的超氧自由基轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫。TNF-α源于單核巨噬細(xì)胞，是慢性肝臟損傷重要的細(xì)胞因子，其表達(dá)與機(jī)體脂肪含量平行[18]。結(jié)果顯示，模型組僅有保護(hù)因子SOD降低，說(shuō)明SOD較早出現(xiàn)異常，其余指標(biāo)可能尚處于代償范圍，甚至損傷因子MDA亦降低，原因未知。祛脂三味方組抗氧化因子GSH顯著升高，F(xiàn)FA、SOD、MDA、TNF-α變化不顯著，說(shuō)明祛脂三味方具有抗氧化作用，以升高GSH為主，因此證明祛脂三味方的抗氧化作用具有重要的臨床意義，但是同時(shí)有害因子GSSG升高，其原因和機(jī)理有待進(jìn)一步探索。

綜合試驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明祛脂三味方具有控制大鼠體重增加、改變肝臟脂肪分布，并且具有抗氧化作用和降血脂的作用，尤其是降低LDL、升高GSH，值得進(jìn)一步完善研究其藥效學(xué)方案及探討更有意義的臨床研究?jī)r(jià)值。

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(本文編輯：易玲)

2016-04-05)

上海市中醫(yī)藥三年行動(dòng)計(jì)劃項(xiàng)目(ZY3-CCC-3-3035)；上海市優(yōu)秀適宜技術(shù)項(xiàng)目(2013SY072)

200336上海上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院感染科

張琴，Email：zhangq1030@163.com