滋腎活血丸對DN大鼠腎臟保護作用的研究*

顏國富　杜亮亮

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滋腎活血丸對DN大鼠腎臟保護作用的研究*

顏國富杜亮亮

湖南省岳陽市中醫院內分泌科(岳陽 414000)

摘要：目的觀察滋腎活血丸對DN大鼠腎臟的保護作用及足細胞損傷的影響。方法40只大鼠隨機分為對照組、模型組、滋腎活血丸組、苯那普利組，每組各10只，測定生化指標；光鏡檢查腎組織病理變化，電鏡及免疫熒光法檢測腎組織及尿液中足細胞變化等并進行觀察。結果實驗12周后，模型組大鼠血糖、24 小時尿蛋白定量、BUN、Scr較正常對照組明顯增高(P<0.05)；滋腎活血丸組和苯那普利組與模型組比較大鼠24 h尿蛋白定量、BUN、Scr均有不同程度降低(P<0.05)，但滋腎活血丸組遠期療效更為顯著。結論滋腎活血丸可減輕糖尿病腎病大鼠足細胞損傷，具有一定的腎保護作用。

關鍵詞：滋腎活血丸；糖尿病腎病；腎功能；足細胞

糖尿病腎病( diabetic nephropathy，DN)，是引起成人后天性終末期腎病的主要原因。研究表明，DN所引起的一系列癥狀均與蛋白尿相關，導致蛋白尿的關鍵因素是足細胞損傷[1～2]。筆者的前期研究表明滋腎活血丸對糖尿病腎病有明顯保護作用，本實驗進一步研究了滋腎活血丸在糖尿病大鼠模型中的作用機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物選用清潔級健康雄性Wistar大鼠40只，體質量(160±20) g，10周齡，由中南大學醫學實驗動物中心提供，合格證號：2012A066。

1.2試驗藥物及儀器設備鏈脲佐菌素(STZ)為Sigma公司產品；苯那普利片由北京諾華制藥有限公司提供(國藥準字H20000292)；滋腎活血丸由我院中藥房提供(批號:008213)；兔抗大鼠Podocalyxin多抗及FITC-山羊抗兔IgG,購自SANTA CRUZ公司。血糖儀為美國強生公司產品；全自動多功能生化分析儀為日本HITACH公司產品；光學顯微鏡為日本OLYMPUS公司產品。

1.3模型制作三聯法制備2型糖尿病腎病模型：(1)切除大鼠右腎, 繼而高糖高脂飲食誘導。(2)小劑量鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射，破壞大鼠的部分胰島B細胞，使大鼠出現糖尿病腎病的早期病變如：腎小球濾過率增加、微量白蛋白尿等。高糖高脂飲食：常規飼料加 20%蔗糖，10%豬油、2.5%膽固醇。手術方法：大鼠腹腔注射氯氨酮(70mg/kg)麻醉后將右腎切除。STZ為sigma公司產品，按30mg/kg腹腔注射，造模時間共 6周。

1.4動物分組與給藥方法40只大鼠隨機分為對照組、糖尿病腎病模型組(模型組)、滋腎活血丸組、苯那普利組，每組各10只。滋腎活血丸組每日每只灌胃滋腎活血丸(3 g/kg/d)，苯那普利組每日每只灌胃苯那普利(2.5 g/kg/d)，對照組大鼠腹腔注射相應的檸檬酸鹽溶液，每日給予等量的飲用水，模型組每日給予等量的飲用水。實驗周期為12周。

1.5標本提取及指標檢測

1.5.1生化指標分別在實驗的2、4、6、8、12周末測定大鼠血糖及24小時尿蛋白定量。12周后測定腎臟指數(RI) =左腎質量(LRW)/大鼠體質量(BW)×100。肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、Scr、BUN；均采用全自動多功能生化分析儀進行測定。

1.5.2光鏡觀察12周末采血后取部分腎組織放入10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，常規切片并行HE染色，采用光鏡觀察結果。

1.5.3電鏡觀察觀察亞細胞結構的病理改變及腎微血管超微結構的改變。每只大鼠腎組織在42000X放大倍數下觀察，取30個視野，每只大鼠最少觀察100個足細胞，使用計算機圖像分析軟件采集足細胞數量，裂孔隔膜數量及范圍，觀察腎小球基底膜的厚度。

1.5.4免疫熒光染色檢測(1)各組均收集大鼠24小時尿液40ml，PBS重懸尿沉渣兩次后細胞涂片；(2)4%多聚甲醛固定20 分鐘后PBS洗1次，再滴加0.2%Triton-X100，5分鐘后PBS洗3次；然后3%BSA封閉40分鐘后滴加抗兔抗大鼠podocalyxin多抗(1:200)，4℃孵育；(3)第二天采用PBS漂洗后加山羊抗兔IgG-FITC(1:1000)，避光孵育1小時后再次漂洗，Hoechst(1:2 000)細胞核染10分鐘后漂洗，擦干封片。(4)采用全自動多功能熒光顯微鏡觀察，發綠色熒光者為陽性。

2　結果

2.1對大鼠血糖的影響見表1。

組別2周4周6周8周12周對照組4.79±0.924.50±1.004.75±0.985.29±0.264.74±1.04模型組17.80±1.5417.51±2.0318.55±1.9719.63±2.1120.76±1.771)苯那普利組17.11±1.7717.00±1.0618.53±2.2320.62±2.4120.33±1.651)2)滋腎活血丸組18.02±2.2517.28±1.5017.42±1.0818.20±1.0118.23±2.061)2)3)

注：與對照組比較1)P<0.05，與模型組比較2)P>0.05，與苯那普利組比較3)P>0.05。

2.2對大鼠尿蛋白的影響見表2。

表2　各組大鼠尿蛋白變化　±s)

注：與對照組比較1)P<0.05，與模型組比較2)P<0.05，與苯那普利組比較3)P<0.05。

2.3對大鼠腎臟的影響見表3。

表3　各組對大鼠腎臟的影響　±s)

注：與對照組比較1)P<0.05，與模型組比較2)P<0.05，與苯那普利組比較3)P<0.05，與苯那普利組比較4)P>0.05。

2.4腎組織病理學觀察

2.4.1光鏡檢查對照組：腎小球、腎小管及腎間質無明顯病理改變。模型組：腎小球體積增大，毛細血管腔受壓變窄，基底膜增厚，系膜物質增多，腎小管上皮細胞空泡樣變。苯那普利組：毛細血管叢內血管腔尚清晰，系膜區增寬，部分基底膜增厚。滋腎活血丸組：毛細血管叢內血管腔清晰，系膜區稍增寬，腎小囊與正常組比較無差異，部分基底膜稍增厚。

2.4.2電鏡檢查對照組：足細胞密度正常，足突排列整齊，未見融，系膜區ECM量正常。模型組：足細胞數量明顯減少，系膜增寬，基底膜可見彌漫性增厚，變性，足突融合。滋腎活血丸組：足突融合減輕，部分區域可見完整足突排列。苯那普利組：可見與滋腎活血丸組類似改變。

3　討論

DN的主要病理實質為與血糖代謝異常有關的腎小球硬化癥，病理特征為腎小球細胞外基質(extracellular matrix，ECM) 過度積聚，基底膜增厚，系膜增寬，間質纖維化及腎小球硬化。糖尿病腎病相關研究發現，高血糖可直接引起及腎小球硬化，腎小球濾過率增加，最終導致蛋白尿。研究還表明DN患者足細胞數量減少與腎小球的硬化程度呈正相關[3]。足細胞數量減少最主要的原因為足細胞從腎小球基底膜的脫落及凋亡，而使足細胞從尿液丟失增多。足細胞可通過分泌ECM及相關降解酶類來調節腎小球基膜(GBM)代謝[4]，能維持GBM代謝平衡，增加足細胞與GBM之間的粘附，有效保障腎臟正常的濾過功能。長期持續的高血糖可以下調Podocalyxin的表達，引發足細胞的分泌功能，最終導致蛋白尿的發生[5]。關于修復DN所致的濾過膜的損傷，廣大醫務工作者一直認為具有不可逆性，最終難免進入透析期，目前已有研究表明多種中藥對DN有重要的治療作用[6～8]，可以作為研究治療DN的新途徑。滋腎活血丸為我院內分泌專科經驗方滋腎活血湯經反復臨床試驗，改良劑型，自行研發的院內制劑之一，臨床應用多年，具有明顯降低患者24小時尿蛋白含量及顯著改善患者腎功能的作用。組方中以經方六味地黃丸滋補腎陰，輔以黃芪補氣固表、利尿托毒，丹參、水蛭、益母草、鬼箭羽活血祛瘀、 利水消腫，佐少量蒼術、雞內金、大黃即可健脾燥濕、又可逐瘀通經。課題組前期臨床研究表明滋腎活血丸對于患者血脂、血糖代謝的影響與兩組患者基礎治療相關，長期服用對于患者糖化血紅蛋白含量的下降趨勢呈正相關[7～8]，可有效降低高血糖對足細胞的毒性作用，有效保護患者腎功能。

本研究結果顯示，與正常大鼠比較，模型組大鼠造模成功后在高血糖不斷作用下逐漸出現尿蛋白增多、腎臟病理損傷等DN特征性表現，后期出現腎功能受損。統計分析表明，滋腎活血丸組與苯那普利組與模型組比較，二者均能不同程度改善DN大鼠腎功能，降低血清肌酐及尿素氮水平，用藥后腎組織病理損傷也明顯減輕。通過對大鼠蛋白尿影響的研究表明，兩治療組均能不同程度的減少DN大鼠蛋白尿，統計學分析P<0.05，且滋腎活血丸組在遠期(8周至12周)療效優于苯那普利組(經比較P<0.05)，說明滋腎活血丸與苯那普利都具有腎保護作用，在消除蛋白尿方面滋腎活血丸的遠期療效優于苯那普利組。兩組大鼠血糖與模型組比較有所下降，但差異無統計學意義。本研究提示，滋腎活血丸能夠通過對足細胞的修復，改善DN患者蛋白尿，對早期DN的腎臟起到保護性作用，有望為臨床藥物開發和中西醫、藥結合治療腎臟疾病探索出一條新的途徑。

參考文獻

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[8]顏國富, 杜亮亮,李淑君,等. 自擬滋腎活血丸聯合常規療法治療早期糖尿病腎病30例臨床觀察 [J].中醫藥導報,2013,10(19):39-40.

*基金項目：湖南省中醫藥管理局資助課題(No.2013120)

doi:10.3969/j.issn.1003-8914.2016.01.025

文章編號：1003-8914(2016)-01-0054-03

收稿日期：(本文校對：李淑君2015-04-10)

The Study on the protective effect of Zishen Huoxue Pills on Kidney of DN rats

YAN GuofuDU Liangliang

(Department of Endocrinology, Yueyang Hospital of Traditional Chinese Medicine, Hunan, Yueyang 414000, China)

Abstract：ObjectiveTo observe the protective effect of Zishen Huoxue pills on the kidney of DN rats as well as the impact on podocyte injury. Method40 rats were randomly divided into control group, the model group, the Zishen Huoxue pills group and the benazepril group, and each group had 10 rats. Their biochemical indicators were determined. The renal biopsy pathology was checked through light microscopy. The podocyte changes in renal tissue and urine were observed by electron microscopy and immuno fluorescence method. ResultsAfter experiments for 12 weeks, the blood glucose, the urine protein in 24 hours, BUN and Scr in rats of the model group were significantly higher than those of the control group (P<0.05). The urine protein in 24 hours, BUN and Scr in rats of the Zishen Huoxue pills group and the benazepril group declined in different degrees compared with the model group (P<0.05). The Zishen Huoxue pills group had remarkable long-term curative effects. Conclusion: The Zishen Huoxue pills can relieve the podocyte injury of the rats with diabetic nephropathy, and had certain renal protective effect.

Key words：Zishen Huoxue pills; Diabetic nephropathy; Renal function; Podocyte