高產地衣芽孢桿菌LB8培養基的優化研究

張曉晴 閔鐘熳

摘要：以自主分離的益生性地衣芽孢桿菌LB8為研究對象，通過單因素和正交試驗對其發酵條件進行優化，得到該菌株培養的最適條件為：培養時間20 h，葡萄糖2%，豆粕粉1.5%，硫酸鎂0.025﹪，NaCl為0.6%。

關鍵詞：地衣芽孢桿菌；發酵條件；優化；正交試驗

中圖分類號：TS201.3 文獻標識碼：A 文章編號：1674-1161（2016）05-0045-04

微生物發酵受很多環境條件影響，除受pH、溫度、接種量影響外，還受培養基碳氮源、微量元素等影響。良好的外界環境不但有利于菌體生長，而且可提高微生物對底物的利用能力。培養基和培養條件優化就是選擇一組培養條件使菌株的生長潛力得到最大程度發揮。這樣不但可以降低成本、提高產率，而且可以促進動物微生態制劑商品化生產。針對培養基和培養條件對地衣芽孢桿菌LB8的發酵培養進行優化，確定適合芽孢桿菌的培養基成分和培養條件，提高益生菌產量，為工業化生產提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 地衣芽孢桿菌LB8（Bacillus licheniformis LB8）：自主分離自動物腸道。

1.1.2 試劑與藥品 95%乙醇、鹽酸、蔗糖、MgSO4、NaCl、可溶性淀粉、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、乳糖、胰蛋白胨、（NH4）2SO4、豆粕粉

1.1.3 培養基 種子培養基：牛肉膏蛋白胨培養基；液體基礎培養基：蔗糖1.5 g，蛋白胨1.0 g，NaCl 0.5g，蒸餾水100 mL，pH 7.5。

1.1.4 主要儀器及設備 DK-S26型恒溫水浴鍋：上海精宏醫療器械廠；DL-CJ-1F超凈工作臺：東聯哈爾濱儀器制造有限公司；LDZX-40SAI型高壓滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；SL1-700電熱恒溫培養箱：湖北黃石醫療儀器制造廠；BSA124S-CW電子分析天平：上海賽多利斯儀器系統有限公司；SHA-C恒溫振蕩搖床：常州國華電器有限公司；KA-1000低速臺式離心機：上海安亭科學儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 單因素試驗 采用單因素試驗對地衣芽孢桿菌LB8發酵所需要的各項條件進行單項優化。

種齡的確定：用接種環從培養好的斜面培養基中挑取1環，接種于盛有30 mL種子培養基的三角瓶中，置于32 ℃、180 r/min條件下振蕩培養12 h。然后，按5%接種量將其轉接到300 mL液體基礎培養基中，在同樣條件下搖床振蕩培養，連續測定48 h。每4 h取樣一次，平板菌落計數并記錄。

碳源的確定：將液體基礎培養基中的蔗糖分別用等量的乳糖、可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖（對照）代替，5﹪接種菌種后測定活菌量，于32 ℃、180 r/min條件下培養20 h，確定最佳碳源。

氮源的確定：將基礎培養基中的蛋白胨分別用等量的編號為①、②、③、④的胰蛋白胨（1.0 g）+酵母粉（0.5g）、豆粕粉、（NH4）2SO4、蛋白胨（對照）代替，以5%接種后，于32℃、180 r/min條件下培養20 h，測定活菌量，確定最佳氮源。

MgSO4對液體發酵的影響：在基礎培養基中分別添加濃度為0，0.02%，0.04%，0.06%，0.08%的MgSO4，接種菌株培養后測定菌體生物量，研究MgSO4對LB8菌體活菌量的影響。

NaCl對液體發酵的影響：在基礎培養基中分別添加0，0.1%，0.3%，0.5%，0.7%，0.9%的NaCl進行試驗，培養后測定菌數，研究NaCl對LB8的活菌量的影響。

1.2.2 培養基成分正交試驗設計 在上述試驗結果的基礎上，選用正交表優化培養基。將LB8菌懸液接入不同培養基中，在相同條件下培養后測定菌體生物量，并對數據進行分析，確定適合LB8生長的最佳培養基。L9（34）因素水平見表1。

2 結果與分析

2.1 液體培養條件優化

2.1.1 種齡的確定 采用活菌計數法測定LB8不同時間的活菌數，以活菌數作為縱坐標，時間為橫坐標，繪作菌體的生長曲線圖，見圖1。

由圖1可知：0～4 h為菌株延遲期，在這段時間，菌體很快得到復蘇；菌體在4～5 h后進入對數生長期，數量明顯增加，當培養時間達20 h時，菌體進入穩定期。因此該菌株最佳培養時間應為20 h。

2.2.2 最佳碳源的確定 如圖2所示，LB8以葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉為碳源時，菌體生物量較低，而以葡萄糖為碳源時菌量較大，菌數為4.5×109 CFU/mL。因此，葡萄糖可作為最適碳源。

2.2.2 最佳氮源的確定 由圖3可看出，LB8在不同氮源中的生長情況呈現較大差異，以豆粕粉為氮源時菌種生物量最大，菌量可達3.8×109 CFU/mL。所以宜選用豆粕粉為氮源。

2.2.3 MgSO4對液體發酵的影響 鎂離子作為多種酶的激活劑，對生物新陳代謝有很顯著的影響，對菌體的生長也不例外，結果如圖4所示。

由圖4可知：Mg2+濃度在0.02%時菌量達到最大，隨著Mg2+濃度的進一步增高，菌體數量呈下降趨勢。 2.2.4 NaCl濃度對液體發酵的培養 將菌種接種到不同濃度的NaCl培養基中，結果如圖5所示。

由圖5可知：NaCl濃度在0.5%時，菌量最大，為5×109 CFU/ml；隨著濃度的增加，菌量下降，說明過高的NaCl濃度不利于菌體生長，適量的NaCl濃度對菌體生長繁殖有促進作用。

2.2.5 培養基成分正交試驗分析 培養基成分正交試驗結果見表2。

從表2可知：各試驗因素水平對LB8的生長有不同影響，四因素對LB8培養影響的顯著性次序為A>B>D>C，即碳源濃度對菌數的影響最顯著，氮源濃度次之，硫酸鎂影響最小。在所選因素水平下，4種因素的最佳組合應為A3B3C2D3，即葡萄糖2%，豆粕粉為1.5%，MgSO4為0.025%，NaCl為0.6%。

3 結論與討論

地衣芽孢桿菌LB8是芽孢桿菌中較具應用潛力的菌株之一。體外試驗證明，地衣芽孢桿菌對致病菌有很強的拮抗作用，能夠替代抗菌素起防病抗病作用。它能在腸道中產生大量的消化酶（如淀粉酶、蛋白酶、植酸酶等）和維生素（B族維生素，維生素K等），具有很強的抗消化道生境及較好的益生性。它還能增強機體特異性和非特異性免疫反應，促進巨噬細胞的吞噬活性，從而大大提高動物的抗感染能力。目前，微生態制劑調控技術已經成為解決養殖水域污染病害問題的有效手段之一。地衣芽孢桿菌LB8具有較好飼料蛋白質和淀粉降解能力，在動物養殖上具有潛在應用價值。

目前，地衣芽孢桿菌的生產工藝較為成熟，但在飼料生產和環境污染治理等方面僅處在起步階段。在人們越來越關注食品安全、迫切希望減少抗生素使用的今天，地衣芽孢桿菌作為新一代飼料添加劑必將得到進一步研究與應用。因此，開展地衣芽孢桿菌制劑的研究和開發有廣闊的市場前景。

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Abstract： In this research the separate prebiotics Bacillus licheniformis LB8 taken as the research object， single factor and orthogonal test used to optimize the fermentation conditions， the optimum condition for the bacterial strain culture was obtained： the culture time 20 h， glucose 2%， soya been meal 1.5%， magnesium sulfate 0.025%， and NaCl 0.6%.

Key words： Bacillus licheniformi； fermentation conditions； optimize； orthogonal test