健脾益肺化痰方通過抑制TNF-α信號通路改善COPD大鼠氣道黏液高分泌的實驗研究*

楊曉敏，趙娜妹，劉　娟，鄧秀蘭，王青青，張曉晶，潘　霏，李　配，鐘相根

（北京中醫藥大學基礎醫學院，北京100029）

·實驗研究·

健脾益肺化痰方通過抑制TNF-α信號通路改善COPD大鼠氣道黏液高分泌的實驗研究*

楊曉敏，趙娜妹，劉娟，鄧秀蘭，王青青，張曉晶，潘霏，李配，鐘相根

（北京中醫藥大學基礎醫學院，北京100029）

［目的］探討健脾益肺化痰方對慢性阻塞性肺疾病（COPD）氣道黏液高分泌的改善機制。［方法］采用煙熏法建立COPD大鼠模型，隨機分為正常組、模型組、健脾益肺方組、化痰方組、健脾益肺化痰方組及羧甲司坦組。正常組、模型組灌胃生理鹽水，各給藥組灌胃相應藥物，連續28 d。酶聯免疫吸附（ELISA）法檢測肺泡灌洗液腫瘤壞死因子-α （TNF-α）含量，蛋白質印跡（Western Blot）法檢測肺組織表皮生長因子受體（EGFR）、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）和絲氨酸蘇氨酸激酶（AKT）磷酸化水平。［結果］與正常組比較，模型組大鼠TNF-α含量升高，EGFR、PI3K和AKT磷酸化增強（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組TNF-α含量顯著下降（P＜0.01或P＜0.05），EGFR、PI3K和AKT磷酸化顯著下降（P＜0.01）或有下降趨勢。［結論］健脾益肺化痰方改善COPD大鼠氣道黏液高分泌，與抑制TNF-α等信號分子有關，且“標本兼治”的作用優于單一“治本”、“治標”。

慢性阻塞性肺疾病；黏液高分泌；健脾益肺化痰方；腫瘤壞死因子-α；表皮生長因子受體

慢性阻塞性肺疾病（COPD）以氣道不完全可逆性氣流受限為特征，可伴有氣道高反應性，疾病呈進行性發展，與肺部對有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應有關。氣道黏液高分泌是COPD的重要病理特征，已被確立為影響COPD病死率和病情進展的獨立危險因素，而黏液高分泌的結構基礎是氣管、支氣管樹杯狀細胞化生［1-3］。目前認為，杯狀細胞化生主要依賴兩個互補途徑的持續激活：表皮生長因子受體（EGFR）-磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）-絲氨酸蘇氨酸激酶（AKT）信號防止纖毛細胞的凋亡和白細胞介素-13（IL-13）信號促使細胞轉分化，且TNF-α信號通路異常激活在杯狀細胞化生、氣道黏液高分泌過程中發揮關鍵作用［4-6］。而所謂的氣道黏液高分泌，就是中醫學的“痰”。“痰”既是COPD重要的病理產物，又是其重要的致病因素。

本課題組以“黏液高分泌”或“痰”為切入點，采用單純香煙煙熏法復制慢性阻塞性肺疾病大鼠模型，以臨床常用的健脾益肺化痰系列方藥進行干預治療，在觀察了健脾益肺方、化痰方及健脾益肺化痰方可顯著改善COPD大鼠肺功能、血氣及肺組織病理的基礎上［7］，進一步觀察健脾益肺化痰系列方對氣道黏液高分泌關鍵信號分子的影響，探討健脾益肺化痰系列方抑制COPD杯狀細胞化生、降低氣道黏液高分泌的效應機制及“痰”標本論治的差異性。

1　材料與方法

1.1藥物采用臨床治療COPD常用的健脾益肺化痰系列方藥，根據藥物功效與歸經分為3組。健脾益肺方：四君子湯合玉屏風散，組方：黨參15 g，茯苓15 g，炙甘草5 g，白術10 g，黃芪15 g，防風6 g。化痰方：二陳湯加桔梗化裁方，組方：法半夏10 g，陳皮10 g，桔梗10 g，茯苓10 g，炙甘草5 g。健脾益肺化痰方：由四君子湯、玉屏風散、二陳湯加桔梗化裁方組成，組方：黨參15 g，茯苓15 g，炙甘草5 g，白術10 g，黃芪15 g，防風6 g，法半夏10 g，陳皮10 g，桔梗10 g。實驗中采用的陽性參照藥物（西藥）為羧甲司坦。

中藥全部購自北京同仁堂醫藥藥材有限公司，經北京中醫藥大學藥用植物教研室鑒定均為正品。大鼠單位體質量生藥量，在人體單位體質量生藥量的基礎上擴大10倍求得。各組藥物分別以純凈水煎煮30 min，提取2次，再合并煎液，并將所得藥液用雙層紗布過濾，水浴加熱蒸發濃縮，貯于冰箱中備用。羧甲司坦500 mg/kg灌胃，劑量參考文獻［8］。

1.2動物與分組清潔級健康Wistar雄性大鼠，60只，鼠齡10～12周，體質量（180±20）g，購于北京維通利華實驗動物公司，合格證號SCXK（京）2012-0001。動物適應性飼養7 d后，采用隨機數字表法分組，分為正常組、模型組、健脾益肺方組、化痰方組、健脾益肺化痰方組、羧甲司坦組，每組10只。

各給藥組動物，從吸煙第13周起，每日上午吸煙前0.5 h灌胃給予相應藥液，連續用藥28 d。正常組和模型組給予等量純凈水灌胃。各組于末次給藥后，禁食12 h檢測相關指標。

1.3COPD大鼠模型的制作參考文獻［8］，采用單純香煙煙熏法制備慢性被動吸煙誘導慢性阻塞性肺疾病大鼠模型。模型組及各給藥組大鼠放入自制被動吸煙玻璃熏箱，箱頂留有通氣孔，燃燒大前門牌香煙，由三通管導入煙霧。一次熏煙燃燒大前門香煙12支，每支香煙約產生煙霧1 L，煙霧濃度約5%，持續0.5 h，每日吸煙2次，上下午各1次，每周5 d，連續16周。

1.4試劑與儀器大前門牌香煙，上海煙草公司，烤煙型，焦油量12 mg，煙氣煙堿量0.9 mg，煙氣一氧化碳含量14 mg；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測試劑盒，CUSABIO公司；磷酸化PI3K抗體購自Abcam公司；磷酸化EGFR抗體和磷酸化AKT抗體購自CST公司。動物熏煙箱（60 cm×50 cm×40 cm），自制。

1.5ELISA法檢測肺泡灌洗液TNF-α的含量肺泡灌洗液的收集：動物處死后，頸部正中切開皮膚，剪開肌肉后暴露氣管，眼科剪尖端向心與頸部平面呈30°剪一小口，直徑1.5 mm塑料軟管行氣管插管進入2 cm，雙重棉線結扎固定。沿胸骨打開胸腔，暴露心肺，夾閉右主支氣管，注射器吸取生理鹽水與氣管插管相連。用4℃冷藏的生理鹽水灌洗左肺2次，30～60 s內緩注4 mL，在左肺停留30 s，4 mL兩次，每次反復推抽2次，收集肺泡灌洗液（BALF），輕揉胸廓促進灌洗液流出，注意動作輕柔，回收率可達90%。4℃1000r/min離心10min，上清液-80℃保存待測。

ELISA法檢測：按照試劑盒說明書進行操作，簡述如下。分別設置標準品孔、待測樣本孔，每孔加標準品或待測樣本100 μL后，37℃溫育2 h。棄液，加生物素標記抗體100 μL，37℃溫育1 h。棄液，加辣根過氧化物酶標記親和素100 μL，37℃溫育1 h。顯色，利用酶標儀在450 nm波長處測量各孔吸光度，從而求得濃度。

1.6蛋白質印跡（Western Blot）法檢測肺組織EGFR、PI3K和AKT磷酸化水平總蛋白提取：取大鼠右肺組織約100 mg，加入蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑及蛋白磷酸酶抑制劑的混合液，超聲破碎，離心收集的上清即為組織總蛋白。BCA法測定蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液，95℃變性后，-20℃凍存。

蛋白免疫印跡：取總蛋白100 μg，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉至PVDF膜，1%奶粉封閉后，加入一抗4℃過夜。一抗為兔抗大鼠磷酸化EGFR、PI3K和AKT（pEGFR、pPI3K和pAKT），內參選用β-actin。二抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔的抗體，化學增強發光顯影，X線膠片感光。計算機掃描膠片，用圖像分析系統（Gel pro4.0版凝膠光密度分析軟件）對蛋白條帶進行半定量分析，灰度值代表蛋白含量。

1.7統計學處理采用SPSS 18.0統計軟件進行分析，定量數據以均數±標準差（±ss）表示。組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett's T3法，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組大鼠肺泡TNF-α的檢測結果表1顯示，與正常組相比，模型組大鼠肺泡灌洗液TNF-α含量顯著增加（P＜0.01）；與模型組相比，各給藥組大鼠肺泡灌洗液TNF-α含量均顯著降低（P＜0.01或P<0.05），提示健脾益肺化痰系列方能抑制COPD大鼠肺組織炎性介質的分泌，降低杯狀細胞化生及黏蛋白分泌的內源性刺激因子。各健脾益肺化痰系列方組間比較，TNF-α含量均未見顯著性差異（P＞0.05）。

表1　各組大鼠肺泡灌洗液TNF-α含量比較（±s）Tab.1　Comparison of TNF-α in bronchoalveolar lavage fluid of each group（±ss）

表1　各組大鼠肺泡灌洗液TNF-α含量比較（±s）Tab.1　Comparison of TNF-α in bronchoalveolar lavage fluid of each group（±ss）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05。

分組正常組模型組健脾益肺方組化痰方組健脾益肺化痰方組羧甲司坦組動物數8 8 8 8 8 8 TNF-α含量（ng/L）161.82±18.70 221.23±9.36** 198.00±8.29##204.89±16.64#202.00±16.81#202.95±18.85#

2.2各組大鼠肺組織EGFR、PI3K和AKT磷酸化水平表2顯示，與正常組相比，模型組大鼠肺組織pEGFR、pPI3K和pAKT含量顯著增加（P＜0.01）；與模型組相比，健脾益肺化痰方組大鼠肺組織pEGFR、pPI3K和pAKT含量均顯著降低（P＜0.01），而健脾益肺組僅pEGFR、pPI3K含量顯著降低（P＜0.01），化痰方組僅pPI3K、pAKT含量顯著降低（P＜0.01），提示健脾益肺化痰系列方藥能抑制COPD大鼠肺組織EGFR、PI3K和AKT的磷酸化，下調氣道黏液高分泌、杯狀細胞化生關鍵信號分子的活性，作用以健脾益肺化痰方最佳。

表2　各組大鼠肺組織pEGFR、pPI3K和pAKT相對含量（±ss）Tab.2　Expression of pEGFR，pPI3K and pAKT in lung of each group（±ss）

表2　各組大鼠肺組織pEGFR、pPI3K和pAKT相對含量（±ss）Tab.2　Expression of pEGFR，pPI3K and pAKT in lung of each group（±ss）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01。

分組正常組模型組健脾益肺方組化痰方組健脾益肺化痰方組羧甲司坦組動物數pPI3K/β-actin光密度比值pEGFR/β-actin光密度比值6 6 6 6 6 6 pAKT/β-actin光密度比值1 1 1 2.879±0.270**2.420±0.402**3.308±0.888** 1.612±0.300##　1.754±0.242##　2.817±0.947 2.589±0.611　1.593±0.294##　1.782±0.610##2.188±0.048##　1.996±0.112##　2.051±0.478##1.749±0.247##　1.741±0.046##　1.852±0.533##

3　討論

氣道黏液高分泌是COPD的重要病理生理學特征之一。黏液的過度分泌滯留于氣道，一方面進一步加重氣道阻塞，引起通氣功能障礙，加速肺功能下降進程；另一方面也引起纖毛清除功能障礙，影響COPD患者對吸入細菌和有毒顆粒的清除，病菌定植，誘發反復感染，進一步刺激黏液高分泌的加重。這種感染和黏液高分泌相互促進的惡性循環機制，使COPD病人肺功能慢性不可逆性持續降低。臨床研究表明，改善慢性阻塞性肺疾病患者氣道黏液高分泌，是治療COPD的有效途徑［9-11］。

TNF-α是氣道黏液高分泌、杯狀細胞化生的關鍵信號分子之一，也是COPD病情分級和療效的生物學指征。COPD患者血清中TNF-α含量隨患者疾病的嚴重程度增高，急性發作前高于緩解期，且用藥治療后顯著下降［12-14］。研究顯示，煙霧等因素刺激下，TNF-α轉化酶表達增加，可引起TNF-α分泌增加、轉化生長因子-α含量升高，從而使表皮生長因子受體（EGFR）磷酸化增強，將刺激信號傳向細胞內部［15-18］。EGFR信號通路在COPD黏液細胞增生中主要發揮抗凋亡作用，其通過下游的PI3K/AKT磷酸化激活，特異性的保護小氣道纖毛上皮細胞，使其免于凋亡，當使用特異性EGFR和PI3K抑制劑時，可觀察到纖毛細胞的顯著凋亡，這說明EGFR/ PI3K是炎性因子刺激下，纖毛細胞成功存活并化生為杯狀細胞、分泌黏液的分子基礎［19-20］。

本課題組前期研究證實，健脾益肺化痰方可顯著減少COPD大鼠杯狀細胞數量，降低黏液高分泌狀態，但健脾益肺化痰方通過何種途徑抑制杯狀細胞化生、降低氣道黏液高分泌，其內在機制還有待深入研究。因此，本實驗選用健脾益肺方（治本）、化痰方（治標）及健脾益肺化痰方（標本兼治），觀察系列方對COPD大鼠氣道黏液高分泌關鍵信號分子的影響，并對比分析三方對信號分子影響的差異。

本研究結果顯示，與正常組相比，COPD組大鼠肺泡內TNF-α增加，肺組織EGFR、PI3K和AKT磷酸化增強，提示氣道炎性因子分泌增加，且通過EGFR/PI3K信號通路，增強纖毛上皮細胞的抗凋亡能力，使其具備向杯狀細胞轉化的分子基礎。與模型組比較，健脾益肺化痰系列方藥組大鼠均表現出肺泡TNF-α降低，肺組織EGFR、PI3K和AKT的磷酸化水平顯著降低或有下降趨勢，提示健脾益肺化痰系列方藥抑制杯狀細胞化生、改善COPD大鼠氣道黏液高分泌，與其抑制EGFR/PI3K信號通路有關。其中，健脾益肺化痰方組EGFR、PI3K和AKT的磷酸化水平均顯著降低，而健脾益肺組和化痰方組EGFR、PI3K和AKT的磷酸化水平僅部分下降，提示健脾益肺化痰方（標本兼治）的抗黏液高分泌效果優于健脾益肺方（治本）、化痰方（治標）。因此，健脾益肺化痰系列方藥均可通過TNF-α/EGFR/ PI3K信號通路，抑制COPD大鼠氣道杯狀細胞化生及黏液高分泌，且“標本兼治”的作用優于單一“治本”、“治標”。

綜上所述，健脾益肺化痰系列方通過TNF-α/ EGFR/PI3K信號通路，抑制COPD氣道上皮杯狀細胞化生及黏液高分泌信號轉導，進而抑制黏液高分泌，改善氣道阻塞及減少病原菌定植，這可能是健脾益肺化痰系列方改善COPD的效應機制之一。本研究為健脾益肺化痰系列方治療COPD的作用機制研究提供了有益的科學探索。

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（本文編輯：馬英，張震之）

Experimental study on Jianpi Yifei Huatan decoction improvement airway mucus hypersecretion in COPD rats through inhibition of TNF-α signaling pathway

YANG Xiao-min，ZHAO Na-mei，LIU Juan，DENG Xiu-lan，WANG Qing-qing，ZHANG Xiao-jing，PAN Fei，LI Pei，ZHONG Xiang-gen
（School of Preclinical Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

［Objective］To explore the mechanism of improvement of mucus hypersecretion in COPD rats by Jianpi Yifei Huatan decoction.［Methods］The rat model of COPD was established by tobacco smoke inhalation，and then the rats were randomly divided into the normal group，model group，Jianpi Yifei Huatan decoction group，Huatan decoction group，Jianpi Yifei Huatan decoction group and carbocisteine group.The normal group and model group were given normal saline solution intragastrically and other groups were given relevant medicines for 28 days，respectively.TNF-α in bronchoalveolar lavage fluid was detected by ELISA，and phospho-EGFR，phospho-PI3K and phospho-AKT in lung were detected by Western Blot.［Results］Compared with the normal group，the expressions of TNF-α，phospho-EGFR，phospho-PI3K and phospho-AKT in model group rats were significantly higher（P＜0.01）.Compared with model group，the expressions of TNF-α，phospho-EGFR，phospho-PI3K and phospho-AKT in all treating group rats were significantly lower（P＜0.01 or P＜0.05）or with a downward tendency.［Conclusion］Jianpi Yifei Huatan decoction improves airway mucus hypersecretion in COPD rats through inhibition of TNF-α signaling pathway，and the role of“treating both symptoms and root causes”is better than single “treating symptoms”or“root causes”.

chronic obstructive pulmonary disease；mucus hypersecretion；Jianpi Yifei Huatan decoction；TNF-α；EGFR

R563

A

1672-1519（2016）05-0295-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.05.10

國家自然科學基金資助項目（81173314，81473666）；國家中醫藥管理局中醫藥重點學科基本科研課題項目（2013-ZDXKKF-03）。

楊曉敏（1980-），女，博士，講師，研究方向為中西醫結合治療肺病。

鐘相根，E-mail：zhongxg@bucm.edu.cn。

2015-12-22）