蟲草素抗炎作用及機制研究*

李　暉，孫佳瑜，廖康漢，王　喆，單愛云

（1.深圳市南山區醫院，深圳　518067；2.深圳市福田區中醫院，深圳　518033；3.中南大學湘雅醫學院，長沙　410013）

·中藥研究·

蟲草素抗炎作用及機制研究*

李暉1，孫佳瑜2，廖康漢1，王喆3，單愛云2

（1.深圳市南山區醫院，深圳518067；2.深圳市福田區中醫院，深圳518033；3.中南大學湘雅醫學院，長沙410013）

［目的］研究蟲草素抗炎作用及機制。［方法］通過二甲苯致小鼠耳腫脹實驗研究蟲草素不同劑量（50、100、200 mg/kg）對耳腫脹的抑制作用，在細胞水平研究蟲草素（12.5、25、50 μmol/L）對誘導型一氧化氮合酶（iNOS）和環氧酶-2（COX-2）表達和一氧化氮（NO）和前列腺素E2（PGE2）產生的影響。［結果］蟲草素（200 mg/kg）能夠抑制二甲苯致小鼠耳腫脹（P＜0.05）和耳片中一氧化氮（NO）和前列腺素E2（PGE2）的產生（P＜0.05）。在細胞水平蟲草素（25、50 μmol/L）能夠抑制誘導型一氧化氮合酶（iNOS）和環氧酶-2（COX-2）表達（P＜0.05），一氧化氮（NO）和前列腺素E2（PGE2）的產生（P＜0.05）。［結論］蟲草素具有抗炎作用。

蟲草素；抗炎；一氧化氮；前列腺素E2；誘導型一氧化氮合酶；環氧酶-2

蟲草素即3'-脫氧腺苷（3'-deoxyadenosine）為核苷酸的衍生物，屬于嘌呤堿，天然存在于冬蟲夏草和蛹蟲草（北蟲草）中，是主要活性成分，為白色針片狀結晶，其分子量為251.24。由蘇格蘭科學家Cunningham等在1951年首次從蛹蟲草原漿液中分離得到［1］，自從蟲草素發現以來，國內外學者對其進行廣泛研究，發現蟲草素具有廣泛藥理作用和生物活性，研究中發現蟲草素具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌等多種藥理作用［2-7］，對于蟲草素的研究與開發，一直是國內外學者研究的熱點，筆者主要通過建立體內外炎癥模型研究蟲草素抗炎作用和相應機制。

1　實驗藥品、材料與動物

1.1藥品與試劑主要化學藥品和試劑蟲草素（C3394，Sigma公司，美國），脂多糖（055：B5 L4005 sigma公司美國），前列腺素 E2檢測試劑盒（minneapolis，MN，美國），一氧化氮檢測試劑盒（南京建成），COX-2和iNOS一抗（CST，美國），二抗和β-actin（Santa cruz，美國），DMEM細胞培養液（Corning，美國），胎牛血清（Hyclone，美國）

1.2實驗動物與細胞BALB/c小鼠，50只，體質量18～22 g，廣東省醫學實驗動物中心提供。飼養環境為SPF級。隨機分籠飼養。巨噬細胞RAW264.7細胞購買于協和醫科大學細胞庫。

2　實驗方法

2.1實驗分組將50只BALB/c小鼠隨機分為五組，分別為對照組、陽性藥物組、蟲草素高、中、低劑量組，給藥途徑為腹腔注射，對照組給等體積的生理鹽水、陽性藥物為賴氨匹林給藥劑量為100mg/kg，蟲草素高、中、低給藥分別為50、100、200 mg/kg，蟲草素超聲溶解在生理鹽水中，每日給藥1次，連續給藥7 d。

2.2二甲苯致小鼠耳腫脹各組小鼠末次給藥后0.5 h，用二甲苯（200 μL/耳）均勻涂抹于小鼠右耳廓內外兩側致急性炎癥，20 min后用小鼠耳廓打孔器將小鼠左右耳沖下等面積耳片，稱質量后以自身的右左耳質量之差表示腫脹度。

腫脹度=自身右耳片質量-自身左耳片質量

2.3耳片組織中NO和PGE2的含量測定將各組沖下來的耳片組織液氮冷凍后加入適量PBS仔細研磨，低溫離心取上清［8］，分別檢測研磨后組織上清液中NO和PGE2的含量。

2.4蟲草素對NO和PGE2產生的影響將RAW264.7細胞按密度5×106/孔平均鋪于6孔板中，24 h后將不同濃度蟲草素（12.5、25、50 μmol/L）和LPS（2 μg/mL）共孵育12 h，取細胞上清液，測其上清液中NO和PGE2的含量［8］，測定每孔細胞總蛋白量作為對比。

2.5蟲草素對iNOS和COX-2表達的影響將RAW264.7細胞按密度5×106/mL平均鋪于6 cm平皿中，24 h后將不同濃度蟲草素（12.5、25、50 μmol/L）和LPS（2 μg/mL）共孵育12 h后，提取每皿細胞總蛋白用免疫印跡檢測iNOS和COX-2的表達情況［9］。

3　數據處理

4　實驗結果

4.1蟲草素對小鼠耳腫脹的影響二甲苯致小鼠耳腫脹實驗中，陽性藥物賴氨匹林100 mg/kg給藥后小鼠耳腫脹度為（6.21±1.81）mg（P＜0.01）；蟲草素低、中、高3個劑量（50、100、200 mg/kg）后小鼠耳腫脹度分別為（12.34±1.58）mg、（11.67±1.73）mg和（6.92± 1.82）mg（P＜0.05）；蟲草素高劑量組與模型組比較有統計學差異，與陽性藥物賴氨匹林作用大致相當，但中低劑量組對其腫脹沒有抑制作用，見圖1。

圖1　蟲草素對二甲苯致小鼠耳腫脹的抑制作用Fig.1　Inhibitory effects of Cordycepin on xylene-induced ear swelling in mice

4.2蟲草素對小鼠耳片中NO和PGE2含量的影響取耳片組織勻漿后上清液，檢測上清液中的NO和PGE2含量，實驗結果提示，腹腔注射賴氨匹林100 mg/kg后小鼠耳片中NO的含量為（8.14± 1.35）μmol/g（P＜0.05），PGE2的含量為（122.45± 8.72）mg/L（P＜0.01）；蟲草素低、中、高3個劑量（50、100、200 mg/kg）腹腔注射后小鼠耳片中NO分別為（14.25±1.81）μmol/g、（13.13±1.25）μmol/g和（9.15± 1.67）μmol/g（P＜0.05），見圖2，PGE2的含量分別為（238.52±13.54）mg/L、（222.17±10.12）mg/L、（132.15± 12.17）mg/L（P＜0.05）（見圖3），蟲草素低、中劑量組對NO和PGE2的影響與模型組比較沒有統計學差異，高劑量組與陽性藥物大致相當。

4.3蟲草素對細胞NO和PGE2產生的影響LPS刺激RAW264.7細胞后，NO和PGE2的含量分別為（45.26±2.53）μmol/L和（90.96±2.68）mg/L與正常組比較有統計學差異（P＜0.001）。蟲草素3個劑量（12.5、25、50 μmol/L）給藥后NO的含量分別為（40.7±2.35）μmol/g、（29.35±2.18）μmol/g（P＜0.05）和（22.13±2.95）μmol/g（P＜0.01），低劑量組的蟲草素與模型組比較沒有統計學差異（見圖4）；PGE2的含量分別為（88.27±2.93）mg/L、（60.97±2.51）mg/L （P＜0.05）和（50.13±2.62）mg/L（P＜0.05），低劑量組的蟲草素與模型組比較無統計學差異（見圖5）。

圖2　蟲草素對小鼠耳片一氧化氮的抑制作用Fig.2　Inhibitory effects of Cordycepin on NO production in mice ear

圖3　蟲草素對小鼠耳片前列腺素E2的抑制作用Fig.3　Inhibitory effects of Cordycepin on PGE2 production in mice ear

4.4蟲草素對細胞培養iNOS和COX-2表達的影響LPS刺激RAW264.7細胞建立細胞炎癥模型，其iNOS和COX-2表達量與正常組比較有統計學差異（P＜0.001）。不同濃度的蟲草素（12.5、25、50 μmol/L）與LPS共刺激RAW264.7細胞后，中高劑量組與LPS刺激的模型組比較有統計學差異（P＜0.05），結果提示蟲草素能夠抑制與炎癥相關的iNOS和COX-2蛋白的表達。見圖6，圖7。

圖4　蟲草素對RAW264.7細胞一氧化氮產生抑制作用Fig.4　Inhibitory effects of Cordycepin on NO production in RAW264.7 macrophages

圖5　蟲草素對RAW264.7細胞前列腺素E2產生抑制作用Fig.5　Inhibitory effects of Cordycepin on PGE2production in RAW264.7 macrophages

5　討論

圖6　RAW264.7細胞蟲草素對iNOS表達的影響Fig.6　Effects of Cordycepin on iNOS expression in RAW264.7 macrophages

圖7　RAW264.7細胞蟲草素對COX-2表達的影響Fig.7　Effects of Cordycepin on COX-2 expression in RAW264.7 macrophages

蟲草素又稱蛹蟲草菌素，是冬蟲夏草和蛹蟲草里的活性成分，也是第一個從真菌中分離出來的核苷類抗生素，具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌和調節免疫等多種生物活性［10］，自從蟲草素發現以來，其廣泛的藥理作用和生物活性成為國內外研究的熱點，開發前景廣闊。炎癥是機體對于致炎因子的防御性反應，炎癥細胞和炎癥介質參與的一些列的病理生理反應，在炎癥反應中毛細血管通透性增加，炎性細胞趨化游走，炎性介質釋放［11］。在炎癥反應中，NO和PGE2是重要的炎性介質，參與和介導炎性反應，過量的產生NO和PGE2都會加重炎癥反應對機體的損傷。研究認為NO是體內重要的細胞因子，參與包括有血管舒張、血小板聚集、神經傳遞、抗癌抗菌等過程，尤其是在炎癥反應中能夠介導產生炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1等，具有細胞毒作用加劇炎癥反應［12-13］，PGE2是重要的炎癥介質之一，在炎癥早期，PGE2能夠促進血管舒張和增加神經對疼痛的敏感性，會增加炎癥組織水腫和疼痛，同時也會增加其他炎癥介質的作用如緩激肽的作用［14-15］，目前普遍認為NO和PGE2均參與炎癥反應，加重炎癥反應對機體的損傷，與急慢性炎癥有密切的關系［16-17］，因此，抑制NO和PGE2的產生能夠抑制炎癥反應，減少炎癥對機體的損傷，是抗炎的主要途徑之一。iNOS和COX-2是產生NO和PGE2的限速酶［9］，抑制iNOS和COX-2蛋白的表達，能夠抑制了NO和PGE2的產生，發揮抗炎作用。本研究中通過二甲苯誘導小鼠耳腫脹建立急性炎癥模型，給予濃度梯度蟲草素發現能夠抑制小鼠的耳腫脹以及炎性組織中NO和PGE2的產生，提示蟲草素具有抑制炎癥的作用，同時在RAW264.7細胞上，用LPS刺激建立細胞炎癥模型，給予蟲草素，實驗結果提示蟲草素能夠抑制炎性相關蛋白iNOS和COX-2的表達和NO和PGE2的產生，綜上所述，提示蟲草素具有抗炎作用，蟲草素的抗炎作用可能是通過抑制iNOS和COX-2的表達和相應的NO和PGE2的介導的。本實驗研究表明蟲草素具有抗炎的作用，這為蟲草素的進一步的研究與開發提供了科學依據。

［1］余伯成，唐永范，唐亮，等.蟲草素的藥理作用研究進展［J］.現代藥物與臨床，2011，265（5）：349-352

［2］Kodama EN，McCaffrey RP，Yusa K，et al.Antileukemic activity and mechanismofactionofcordycepinagainstterminal deoxynucleotidal transferase-positive（TdT+）leukemic cells［J］. Biochem Pharmacol，2000，59（3）:273-281

［3］李婧，何肇晴，龔皓，等.國產蟲草素對HeLa細胞MMP-9、TIMP-1及TIMP-1 mRNA表達的調節［J］.現代腫瘤醫學，2009，17（9）:1615-1618.

［4］Xu FL，Lee YL，Tsai WY，et al.Effect of cordycepin on Hantaan virus 76-118 infection of primary human embryonic pulmonary fibroblasts-characterization of apoptot ic effects［J］.Acta Virol，2005，49（3）:183-193.

［5］Nakamura K，Yoshikawa N，YamaguchiY，et al.Antitumor effect of cordycepin（3'-deoxyadenosine）on mouse melanoma and lung carcinoma cells involves adenosine A3 receptor stimulation［J］. Anticancer Res，2006，26（IA）:43-48

［6］R.J.蘇哈道尼克，謝其明.核苷類抗菌素［M］.北京:科學出版社，1982:476.

［7］Kim HG，Shrestha B，L im SY，et al.Cordycepin inhibits lipopoIysac charide induced inflammation by the suppression of NF-kappa B through Akt and p38 inhibitionin RAW 264.7 macrophage cells［J］. Eur J Pharmacol，2006，545（2-3）:192.

［8］Huang MT，Liu Y，Ramji D，et al.Inhibitory effects of black tea theaflavin derivatives on12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetateinduced inflammation and arachidonic acid metabolism in mouse ears［J］.Molecular Nutrition and Food Research，2006，50:115-122.

［9］Bo Zhang，Lingdi Yan，Peilan Zhou，et al.CHP1002，a novel andrographolide derivative，inhibits pro-inflammatory inducible nitric oxide synthase andcyclooxygenase-2expressionsin RAW264.7 macrophagesvia up-regulation of heme oxygenase-1 expression［J］.International Immunopharmacology，2013，15:289-295.

［10］黃冕，張松.蟲草素生理功效的研究進展［J］.菌物研究，2010，8（4）:234-238.

［11］Zeng HW，Liu XH，Dou SS，et al.Huang-Lian-JieDu-Tang exerts anti-inflammatory effects in rats through inhibition of nitric oxide productionandeicosanoidbiosynthesisviathelipoxygenase pathway［J］.Journal of Pharmacy and Pharmacology，2009，61:1699-1707.

［12］周武慶，鄭家潤.一氧化氮在炎癥和免疫調節中的作用［J］.國外醫學·皮膚性病學分冊，1999，25（4）：233-235.

［13］Wanda N，Anne GB，Daniele CN，et al.Nitric oxide enhances Th9 cell differentiation and airway inflammation［J］.Nat Commun，2014，5:4575.

［14］Masako N，Daniel WR.Multifaceted roles of PGE2in inflammation and cancer［J］.Semin Immunopathol，2014，35（2）:123-137.

［15］Kalinski P.Regulation of immune responses by prostaglandin E2［J］.J Immunol，2012，188（1）:21.

［16］吳洋，王洋，張瑤，等.苦參堿對脂多糖誘導腸組織炎癥小鼠血清和組織NO及ADMA代謝通路的影響［J］.中國中藥雜志，2014，39（12）：2318-2321.

［17］陳蘭英，王昌琴，劉榮華，等.芍藥甘草湯對角叉菜膠誘導的炎癥相關指標時序性變化研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2014，20 （4）：115-118.

（本文編輯：高杉，張震之）

Anti-inflammatory effect and mechanism study of Cordycepin

LI Hui1，SUN Jia-yu2，LIAO Kang-han1，WANG Zhe3，SHAN Ai-yun2
（1.Shenzhen Nanshan District Hospital，Shengzhen 518067，China；2.Shenzhen Futian District Traditional Chinese Medicine Hospital，Shengzhen 518033，China；3.Central South University Xiangya School of Medicine，Changsha 410013，China）

［Objective］To study the anti-inflammatory effect of Cordycepin.［Methods］By Xylene induce ear swelling test in mice，the inhibition of Cordycepin（50，100，200 mg/kg）was evaluated for ear swelling.At the cellular level，the effect of Cordycepin（12.5，25，50 μmol/L）was evaluated for iNOS and COX-2 expression，NO and PGE2production.［Results］Cordycepin（200 mg/kg）inhibited ear swelling of mice（P＜0.05），NO and PGE2production in mouse ear piece（P＜0.05）.At the cellular model，Cordycepin（25，50 μmol/L）inhibited iNOS and COX-2 expression（P＜0.05），NO and PGE2production（P＜0.05）.［Conclusion］Cordycepin have anti-inflammatory effect.

Cordycepin；anti-inflammation；NO；PGE2；iNOS；COX-2

R285.5

A

1672-1519（2016）05-0303-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.05.12

國家自然科學基金項目（81470016），深圳市科技研發基金項目（NJCYJ20140414145007216）。

李暉（1982-），男，主管藥師，主要從事中藥藥理研究。

單愛云，E-mail:1348903@qq.com

2016-02-23）