不同程度彌漫性軸索損傷動物模型建立研究*

向　玲，張雨婷，梁　平，韋　紅，彭玲瓏，李祿生

(重慶醫科大學附屬兒童醫院神經外科/國家重點臨床專科，重慶 400014)

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不同程度彌漫性軸索損傷動物模型建立研究*

向玲，張雨婷，梁平，韋紅，彭玲瓏，李祿生△

(重慶醫科大學附屬兒童醫院神經外科/國家重點臨床專科，重慶 400014)

目的自制一種彌漫性軸索損傷(DAI)裝置，建立不同程度的DAI動物模型。方法選取成年雄性清潔級SD大鼠70只，分為正常對照組(10只)與致傷組(60只)，進一步將致傷組分為A、B、C 3組，各20只。運用自制的實驗裝置致傷，使大鼠的頭顱同時產生瞬間超大角加速度和線加速度，在恒定氣壓下通過不同的旋轉往返加速運動次數，造成輕型(A組)、中型(B組)、重型(C組)3種不同程度的大鼠DAI損傷模型，進行行為及病理效應評價。結果隨著損傷程度的加重，損傷急性期致傷組大鼠的神經生理反射恢復的時間間隔與蘇醒時間均增加(P<0.05)，致傷7 d后致傷組大鼠的神經功能評分降低(P<0.05)；致傷后14 d內A、B、C 3組大鼠死亡率分別為5.0%、25.0%、50.0%。隨著損傷程度的加重，DAI病理特征改變更為明顯。結論該裝置能有效建立不同損傷程度的DAI動物模型。

彌漫性軸索損傷；實驗裝置；動物模型；大鼠

彌漫性軸索損傷(diffuse axonal injury,DAI)是一種常見的顱腦損傷，其病情重、治療難、預后差、病死率高[1-5]。目前，DAI的致傷機制尚不完全明確，模型的研究仍是當今國內外致力探討的課題。因此，筆者參照Gennarelli等[6]和馮氏[7]致傷裝置，模擬DAI發生機制，自制了一種簡便、可靠、穩定的損傷裝置，使大鼠的頭顱能同時產生瞬間超大角加速度和線加速度，并建立不同損傷程度的大鼠DAI模型，為深入研究DAI提供有用工具。

1　材料與方法

1.1實驗動物選取成年雄性清潔級SD大鼠70只，體質量300～400 g，按隨機數字表法分為正常對照組(10只)和致傷組(60只)，致傷組按隨機數字表法再分為A、B、C 3組，各20只。

1.2DAI致傷裝置的研制

1.2.1原理及實驗裝置該裝置為一個高氣流率驅動的氣動轉換裝置，通過電動充氣泵充氣使動力氣缸氣壓達到預先設定的預壓氣壓(0.8 kpa)，啟動氣動轉換系統推動齒輪滑塊瞬間向右做線加速度運動，在滑塊的帶動作用下，通過齒輪齒條的嚙合作用，齒輪同時發生圍繞其中心的旋轉和沿導軌的直線運動，同時產生瞬間超大線加速度和角加速度復合運動。頭顱旋轉裝置完成90°順時針旋轉后，借助于彈簧壓縮緩沖裝置而停止，再次啟動氣動轉換裝置觸發按鈕，使齒輪滑塊反向加速運動，帶動頭顱旋轉裝置90°逆時針旋轉，即完成一次90°旋轉往返加速運動。連續觸發氣動轉換系統啟動開關，可實現多次往返旋轉加速運動。實驗裝置見圖1。

1.2.2操作方法操作時，大鼠用4%水合氯醛腹腔麻醉后(0.3 mL/100 g)，將其頭部兩側顳骨及頭頂部墊以棉花，旋轉左、右、上的螺絲棒將頭顱固定于中心位，大鼠連接器處于水平位。啟動電動充氣泵，充氣至0.8 kpa后，多次觸發氣動轉換裝置，可使大鼠頭顱行多次90°旋轉往返運動。整個過程保證氣壓恒定。

1.3方法

1.3.1不同程度DAI模型的建立致傷組大鼠經4%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔麻醉后，固定于實驗裝置上。A、B、C 3組分別行1、2、3次往返加速運動，致傷大鼠頭顱(分別為輕度、中度、重度致傷)；正常對照組大鼠麻醉后固定在致傷裝置上，不致傷，1 min后將大鼠卸下。

1.3.2觀察大鼠神經生理反射觀察損傷急性期(24 h內，每分鐘測定1次直至恢復正常)致傷組大鼠的神經生理反射(角膜反射、后肢爪反射、翻正反射)恢復的時間間隔及大鼠生命體征變化。

1.3.3大鼠腦組織大體形態和病理學形態觀察于損傷后24 h分別在正常對照組及A、B、C組中各抽取3只大鼠，用4%水合氯醛腹腔麻醉后，快速開胸，左心室插管至主動脈，剪開右心耳，灌注0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)，至流出液清亮后停止灌注，換用4%多聚甲醛溶液灌注，至大鼠四肢及尾巴抽搐、雙肺及肝臟顏色變白為止。灌注完成后迅速取腦，完整剝離全腦包括大腦、小腦、腦干，同時肉眼觀察大體標本的病理變化后，遂將標本組織投入4%多聚甲醛溶液于4 ℃固定48 h；腦干和大腦冠狀位切開，大腦沿腦中線矢狀位切開,分別進行脫水、透明、浸蠟、包埋，腦干和大腦分別冠狀位切片5 μm厚，行蘇木素-伊紅(HE)染色。

1.3.4大鼠神經功能評分于損傷后7 d參照文獻[8]的Carcia JH大鼠神經功能評分標準(表1)，分別對A、B、C 3組大鼠進行神經功能評分，并統計14 d內A、B、C 3組的死亡率。

2　結　　果

2.1損傷急性期大鼠生命體征及神經生理反射恢復時間與蘇醒時間比較大鼠致傷后出現不同程度的肢體抽搐、大小便失禁和呼吸暫停，呼吸節律不齊，由淺快到深慢再到淺快，后慢慢趨于平穩。3組大鼠損傷后均出現角膜反射、后肢爪反射及翻正反射消失。角膜反射、后肢爪反射、翻正反射的平均恢復時間在A組與B組、B組與C組間比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。A組與B組、B組與C組蘇醒時間比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。蘇醒后大鼠出現不同程度的活動減少、反應減慢、行走不穩。

①：底座(長36 cm、寬25 cm)；②：動力氣缸；③：大鼠連接器，包括大鼠放置臺(長14 cm、寬13 cm)，左右上3根旋轉螺絲棒(分別長6、6、4 cm)；④：旋轉部分(擺動金屬桿、滑塊、齒輪、齒條)；⑤：電池閥；⑥：通氣管(2條)；⑦：擺動桿。

圖1　　DAI致傷裝置

*：P<0.05，與A組比較；#：P<0.05，與B組比較。

2.2神經功能評分與死亡率致傷后7 d對3組大鼠行神經功能評分，隨往返加速運動次數增加，3組大鼠神經功能評分比較，差異有統計學意義(P<0.05)。致傷后14 d內A、B、C 3組大鼠死亡率分別為5.0%、25.0%、50.0%，其中C組與A組及B組死亡率比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

2.3病理學改變肉眼下，正常對照組和A、B、C 3組大鼠大腦表面、蛛網膜下腔、腦室等區域均未見明顯出血病灶，見圖2。光鏡下正常對照組可見神經束排列整齊且無空泡形成；A組可見大腦胼胝體區、灰白質交界區、腦干等部位神經束疏松、紊亂，血管淤滯，空泡形成，神經元腫脹變性，細胞核顯示不清，突觸結構模糊的典型DAI病理特征。B組與A組比較，C組與B組比較，其神經束排列更疏松、紊亂，空泡形成及神經細胞腫脹變性更明顯，見圖3。

表3　　3組不同程度致傷大鼠神經功能評分及死亡率比較

*：P<0.05，與A組比較；#：P<0.05，與B組比較。

A：正常對照組；B：輕度致傷；C：中度致傷；D：重度致傷。

圖2致傷24 h大鼠腦大體標本情況

A：正常對照組；B：輕度損傷；C：中度損傷；D：重度損傷；E：正常對照組；F：輕度損傷；G：中度損傷；H：重度損傷。

圖3胼胝體神經纖維束及灰白質交界區、腦干等部位神經元損傷情況(HE染色，×400)

3　討　　論

DAI是導致顱腦外傷患者重度傷殘、植物狀態及死亡的常見原因[1-5，9]。各種暴力作用于頭部產生線或角加速度，在腦組織內產生剪切力，導致神經軸索損傷甚至斷裂、毛細血管撕裂，使腦深部白質發生廣泛彌漫損傷即DAI[10]。其發生機制尚不完全明確，是神經外科研究的重要內容，有研究證明頭部直線和旋轉加速運動是導致DAI最重要的機制之一[11]。為模擬該損傷機制，筆者參照國內外相關致傷裝置，自制了一種可以使大鼠的頭顱同時產生瞬間超大角加速度和線加速度的致傷裝置。

DAI動物模型的建立在國內外已經有較多研究，如瞬間旋轉損傷模型[6，12]、液壓沖擊損傷模型[13]、打擊負荷損傷模型[14]、加速或減速損傷模型[15]、牽拉損傷模型[16]等。目前，眾多學者對DAI損傷機制的認識趨于一致，即外力使頭部產生線或角加速度，由于腦各組織的物理質量不同，其運動速度不均，易受剪切力作用，導致神經軸索損傷甚至斷裂。因此，筆者在參照Gennarelli等[6]和馮氏[7]的致傷裝置基礎上，加以改進，模擬直線加速和角加速的發生機制，制作了一種由恒定氣壓推動可同時產生恒定線加速度和角加速度的實驗裝置。借助氣動轉換系統實現90°順時針、逆時針旋轉往返加速運動，并保持恒定的線加速度及角加速度。該裝置結合了直線加速及旋轉加速損傷機制，更符合臨床實際中DAI的發生機制。

臨床上DAI患者的預后差別很大，主要由損傷當時的嚴重程度決定。因此，建立一個穩定的可以反映不同損傷程度的動物模型，用于DAI的治療及預后研究具有重大意義。既往報道中尚缺乏對DAI損傷程度進行分級的研究，因此筆者擬通過調控旋轉往返加速運動次數，來實現不同程度致傷。

本研究在預實驗過程中觀察發現，僅對大鼠做1次順時針90°旋轉加速運動后，病理組織學觀察發現未見明顯彌漫性軸索損傷病理學改變；做1次90°順時針、逆時針旋轉往返加速運動后，病理組織學可見輕度彌漫性軸索損傷病理改變；行4次往返運動致傷后大鼠的死亡率極高，無法完成實驗。因此，筆者分別給予A、B、C 3組1、2、3次旋轉往返加速運動，制造不同程度DAI模型。結果發現3組大鼠致傷后在神經生理反射、神經功能評分及病理組織學改變上均符合DAI表現，且組間有明顯差異。既往很多實驗裝置建模后，大體標本可見明顯出血灶[17-18]，實際上是一種復合型損傷，并非單純的DAI，本實驗在致傷后24 h，A、B、C 3組大鼠肉眼下大腦表面、蛛網膜下腔、腦室等區域均未見明顯出血病灶，而病理組織學改變上符合DAI的表現，因此本裝置所建立的DAI模型屬于單純型DAI，將更有利于相關研究。

綜上所述，本裝置原理與臨床DAI發生機制相似，實驗方法簡單合理，易于操作，可重復性強，能成功構建具有典型DAI病理學及神經功能改變的動物模型，且可通過調節旋轉往返加速運動次數構建不同的損傷程度，是一種較為理想的DAI損傷裝置。

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Study on the establishment of rat model of different degree of diffuse axonal injury*

XiangLing，ZhangYuting，LiangPing，WeiHong，PengLinglong，LiLusheng△

(DepartmentofNeurosurgery/NationalKeyClinicalSpecialist,AffiliatedChildren′sHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400014,China)

ObjectiveTo establish the different degrees of rat diffuse axonal injury (DAI) model by using a self-made DAI device.MethodsA total of 70 healthy adult clean SD rats were selected and randomly divided into the normal control group (n=10) and DAI group (n=60),then the DAI group was randomly subdivided into the group A,B,and C,20 cases in each group.The rat head injury model was prepared by using the self-made experimental device,which made the rat head to simultaneously produce instant oversized linear and angular accelerations,different degrees of rat DAI model,including mild DAI(group A),moderate DAI (group B) and severe DAI(group C),were induced by different rotation back and forth,accelerated movement times under the constant air pressure.The pathological and behavior effect evaluation was performed.ResultsWith the injury degree aggravating,the time interval of nerve physiological reflex recovery and awakening time in the acute DAI groups were increased (P<0.05).The nerve function score after 7 d in the DAI groups was decreased (P<0.05); the death rates within 14 d after injury in the group A,B and C were 5.0%,25.0% and 50.0% respectively.With the injury degree aggravating,the DAI pathological characteristics were more significant.ConclusionThis device could effectively establish different injury degrees of DAI animal model.

diffuse axonal injury；experimental facility；animal model；rat

國家臨床重點專科資助項目(X3257)；重慶市科委科技攻關應用技術研發類項目(cstc2012gg-yyjs10013)。作者簡介：向玲(1988-)，在讀碩士，主要從事小兒腦損傷研究。△

，E-mail:404616073@qq.com。

R651.15

A

1671-8348(2016)21-2881-04

2016-01-08

2016-03-26)

·論著·doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.21.001