超低頻經顱磁刺激對腦缺血大鼠認知功能的影響及機制*

王　莉，張　燕，余巨明，胡厚祥

(川北醫學院附屬醫院：1.神經內科；2.心血管內科，四川南充 637000)

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超低頻經顱磁刺激對腦缺血大鼠認知功能的影響及機制*

王莉1，張燕1，余巨明1，胡厚祥2

(川北醫學院附屬醫院：1.神經內科；2.心血管內科，四川南充 637000)

目的研究超低頻經顱磁刺激(TMS)對腦缺血大鼠認知功能的影響并探討其機制。方法將60只健康大鼠分為4組(各15只)：A組(假手術組)，B組(模型組)，C組(TMS組)和D組(TMS+H89組)。比較各組大鼠的逃避潛伏時間、跨越原平臺次數及血管內皮生長因子(VEGF)、腦源性神經營養因子(BDNF)和巢蛋白(nestin)的表達水平。結果A組大鼠逃避潛伏期為(16.31±2.33)s，跨越原平臺次數為(8.02±1.76)次；B組大鼠逃避潛伏期為(57.14±2.89)s，跨越原平臺次數為(3.15±0.88)次；C組大鼠逃避潛伏期為(29.18±1.95)s，跨越原平臺次數為(5.44±0.75)次；D組大鼠逃避潛伏期為(45.87±2.06)s，跨越原平臺次數為(4.16±1.02)次。與A組比較，B、C、D組大鼠的逃避潛伏期明顯延長，且B組長于D組及C組，差異均有統計學意義(P<0.05)；大鼠的跨越原平臺次數明顯減少，且B組少于D組及C組，差異均有統計學意義(P<0.05)。各組大鼠VECF、BDNF和nestin表達水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。結論低頻TMS可以明顯改善腦缺血大鼠的認知功能，其作用與環磷腺苷效應元件結合蛋白及其下游基因(VEGF、BDNF)的表達有關。

經顱磁刺激；腦缺血；認知功能

經顱磁刺激(tanscranial magnetic stimulation，TMS)是一種利用脈沖磁場作用于中樞神經系統，從容改變皮層神經細胞的膜電位并引起一系列生理生化反應，影響腦內代謝和神經電活動，改變腦可塑性的技術[1]。研究發現，低頻TMS可以降低皮層的興奮性，促進精神、神經疾病(如腦梗死)的恢復[2]，但其機制尚未研究明確。蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)可將其磷酸化成為活化形式，即磷酸化cAMP反應元件結合蛋白(phosphorylated cAMP response element binding protein，pCREB)，而H89則可阻滯這種磷酸化作用。pCREB與靶基因啟動區DNA序列CRE(cAMP re-sponse element)結合，調節下游基因的轉錄。PKA-CREB信號通路與突觸的可塑性和學習記憶功能關系密切[3]。本研究旨在分析超低頻TMS對腦缺血大鼠認知功能的影響并探討其機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物選用60只健康的雄性Wistar大鼠作為實驗動物，體質量為200～220 g，平均(210.4±6.2)g，由川北醫學院實驗動物中心提供，合格證號15-0212。將60只大鼠分為4組：A組(假手術組)15只，B組(模型組)15只，C組(TMS組)15只，D組(TMS+H89組)15只。

1.2儀器與試劑PKA抑制劑-H89 2HCl(美國Selleck公司)，大鼠單抗血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF，北京中杉金橋公司)，羊抗兔腦源性神經營養因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF，北京中杉金橋公司)，羊抗兔巢蛋白(nestin，美國SAB公司)，二抗(北京中杉金橋公司)。Morris水迷宮(長沙長錦科技有限公司)，圖像分析系統(北京益林苑科技有限公司)，Yrdccy-Ⅰ型磁刺激儀(武漢依瑞德公司)。

1.3方法

1.3.1腦缺血模型的制備及給藥參照文獻[4]大鼠右側大腦中動脈閉塞的造血模型建造方法構建大鼠腦缺血模型(B、C、D組)；A組僅游離右側頸動脈但不給予封閉和結扎，手術過程嚴格遵循無菌原則，所有大鼠術后均采用無菌培養。D組大鼠在頭頂局部常規備皮、消毒，頭頂正中矢狀切開約1 cm，消毒后于前囟后0.8 mm、前囟所在矢狀線右側1.5 mm處鉆一小孔，緩慢進針至硬膜下4.5 mm，按照11.2 mg/kg劑量緩慢注射H89 2HCl，全部劑量分3次完成，注射過程持續5 min；C組大鼠給予等量生理鹽水。術后局部涂抹青霉素粉末，縫合消毒皮膚預防感染。

1.3.2磁刺激采用自制的固定裝置將C組和D組大鼠頭部固定于Yrdccy-Ⅰ型磁刺激儀(頻率：11 mHz；強度：500 Gs)的磁場區接受磁刺激，其余部位固定于非磁場區。每次15 min，每日1次，持續4周。A組和B組大鼠假刺激組同樣放置，但不接受磁刺激。

1.4觀察指標

1.4.1大鼠Morris水迷宮實驗大鼠于手術4周后進行Morris水迷宮實驗，包括定向航行實驗和空間搜索實驗。定向航行實驗：共進行5 d，9個時間段游泳訓練，記錄其尋找到平臺的時間記為逃避潛伏期，最長限制時間為120 s，若120 s內未找到平臺，則逃避潛伏期記為120 s。空間探索實驗：在第5天下午記錄逃避潛伏后撤去平臺大鼠120 s內跨越原平臺次數。

1.4.2大鼠海馬組織蛋白檢測于手術后1、2和4周分別取5只大鼠，采用蛋白質印跡法(Western blotting)對大鼠海馬組織中的VEGF、BDNF、nestin和5-溴脫氧尿苷(BrdU)蛋白水平進行檢測：大鼠全部麻醉處死，斷頭取梗死側海馬，裂解、勻漿后取上清液，蛋白定量后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳、電轉移和膜封閉，封閉結束后分別滴加1∶400大鼠單抗VEGF 、1∶300兔抗 BDNF、 1∶200兔抗Nestin和1∶200的兔抗Brdu，4 ℃孵育過夜。加入二抗室溫下于搖床孵育1 h，二抗孵育后顯色、曝光、顯影。測量并分析上述蛋白吸光度值，并以3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內參計算相對吸光度值(relative absorbances，RA)。

2　結　　果

2.1各組大鼠的認知功能比較各組大鼠的逃避潛伏期及跨越原平臺次數比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1　　各組大鼠的認知功能比較±s)

*：P<0.05，與A組比較；#：P<0.05，與B組比較。

3.2各組大鼠腦組織VEGF及BDNF表達水平比較各組大鼠不同時刻腦組織VEGF及BDNF表達水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2　　不同時刻各組大鼠組織VEGF及BDNF表達水平比較±s)

*：P<0.05，與A組比較；#：P<0.05，與B組比較。

3.3各組大鼠腦組織nestin表達水平比較各組大鼠不同時刻腦組織nestin表達水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3　　不同時刻各組大鼠nestin表達水平比較±s)

*：P<0.05，與A組比較；#：P<0.05，與B組比較。

3　討　　論

研究發現，低頻TMS是一種通過刺激大腦皮層電位改變從而引起一系列生物活動的神經電生理技術，具有穿透力強、非侵入性和無痛感等優點[5]。本研究筆者旨在分析超低頻TMS對腦缺血大鼠認知功能的影響，并探討其機制。研究結果顯示，與A組(假手術組)大鼠相比，B、C、D組大鼠的逃避潛伏期延長，跨越原平臺次數減少，大鼠的認知功能下降。C組大鼠認知功能優于B組(模型組)，說明超低頻TMS可以改善大鼠的認知功能；盡管與B組相比D組大鼠認知功能改善，但D組大鼠的認知功能明顯低于C組，說明PKA抑制劑-H89 2HCl可以在一定程度上阻斷TMS對腦缺血大鼠認知功能的改善作用。

對TMS改善大鼠認知功能的機制進行探討：VEGF是由內皮細胞產生的有絲分裂原，可以促進內皮細胞的增殖并調控新生血管的形成。研究發現，VEGF可以促進成年大鼠海馬區局部神經的新生并改善大鼠的認知功能，抑制VEGF表達可以阻斷局部環境誘導的神經新生[6-7]。BDNF是中樞神經系統內廣泛存在的神經營養因子，在神經元的分化、發育、維持神經元功能及修復等多發面發揮重要的作用，可以促進海馬神經的再生和學習記憶功能的恢復[8]。

nestin主要在未分化和具有分裂能力的細胞中表達，在神經系統中主要表達于神經干細胞(neural stem cells，NSCs)，隨著NSCs的分化，nestin表達水平逐漸降低并于細胞成熟后停止。因此，nestin表達水平可以反應細胞的增殖水平[9-10]。在手術后1周，B、C、D組大鼠nestin水平較A組(假手術組)大鼠明顯升高，說明大鼠存在神經干細胞的增殖，隨著細胞的分化和成熟，大鼠nestin表達水平下降。

既往研究發現，VEGF和BDNF均可以促進NSCs的增殖，VEGF的主要作用為早期促進中樞神經系統的神經干細胞增殖[11]，而BDNF可以同時促進神經干細胞的增殖和分化[12]。因此，VEGF和BDNF在腦缺血大鼠認知功能的恢復中發揮重要作用，均受PKA-CREB途徑的調控[13]。GREB作為一種核轉錄因子，其活化受PKA的調控。GREB磷酸化形式pGREB與靶基因啟動區DNA序列結合，從而調節下游基因的轉錄。PKA抑制劑-H89 2HCl可以通過抑制GREB的活化而抑制VEGF和BDNF的表達[14-15]。本次研究中，與C組大鼠相比，D組大鼠的VEGF、BDNF和認知功能均明顯下降，說明TMS可能通過調控PKA-GREB-BDNF/VEGF途徑改善大鼠的認知功能。但研究中，盡管D組大鼠的認知功能和nestin表達水平明顯低于C組，但仍高于B組，說明H89 2HCl不能完全阻斷TMS引起大鼠NSCs的增殖和分化，TMS還可以通過其他機制促進腦缺血大鼠的認知功能恢復。具體機制有待于進一步研究。

綜上所述，低頻TMS可以明顯改善腦缺血大鼠的認知功能，其作用與環磷腺苷效應元件結合蛋白及其下游基因(VEGF、BDNF)的表達有關。

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Influence of ultralow-frequency transcranial magnetic stimulus on cognitive ability of rats with cerebral ischemia and its mechanism*

WangLi1，ZhangYan1，YuJuming1，HuHouxiang2

(1.DepartmentofNeurology; 2.DepartmentofCardiology,AffiliatedHospitalofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong,Sichuan637000,China)

ObjectiveTo study the influence of ultralow-frequency transcranial magnetic stimulus(TMS) on the cognitive ability of rats with cerebral ischemia and its mechanism.Methods60 healthy rats were divided into 4 groups(15 cases each): A(sham-operation),B(model),C(TMS) and D(TMS+H89).The escape latency time,times of passing through platform,expression level of VEGF,BDNF and nestin protein were compared among 4 groups.ResultsIn the group A,the escape latency time was (16.31±2.33)s,times passing through platform were (8.02±1.76) times; in group B,which were (57.14±2.89)s and (3.15±0.88) times; in group C,which were (29.18±1.95)s and (5.44±0.75) times; in group D,which were (45.87±2.06)s and (4.16±1.02) times.Compared with the group A,the escape latency time in the group B,C and D was significantly extended,moreover that in the group B was longer than that in the group D and C,the differences were statistically significant(P<0.05); the times of passing through platform decreased,which in the group B was less than that in the group D and C,the differences had statistical significance(P<0.05).The expression levels of VEGF,BDNF and nestin had statistical differences among various groups(P<0.05).ConclusionLow-frequency TMS can significantly improve the cognitive ability of rats with cerebral ischemia,its effect is related to the expression of cAMP-response element binding protein and its following genes(VEGF and BDNF).

transcranial magnetic stimulus；cerebral ischemia；cognitive ability

國家自然科學基金資助項目(81070101)。作者簡介：王莉(1977-)，副教授，碩士，主要從事神經內科疾病研究。

R743.3

A

1671-8348(2016)21-2897-03

2016-01-25

2016-04-12)

論著·基礎研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.21.005