醛固酮誘導人腎小管上皮細胞膠原Ⅰ、Ⅲ表達的研究*

黃海燕，魏佳莉

(海南省人民醫院：1.中心實驗室；2.腎內科，海口 570100)

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醛固酮誘導人腎小管上皮細胞膠原Ⅰ、Ⅲ表達的研究*

黃海燕1，魏佳莉2△

(海南省人民醫院：1.中心實驗室；2.腎內科，海口 570100)

目的探討Rho激酶對醛固酮(ALD)誘導的人腎小管上皮細胞膠原Ⅰ、Ⅲ(COL Ⅰ、Ⅲ)表達的影響。方法將人腎小管上皮細胞HK-2培養于含15%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養液中,ALD受體拮抗劑依普利酮(10 μmol/L)和Rho激酶抑制劑Y27632(1 μmol/L)預處理細胞30 min后，100 nmol/L ALD作用HK-2細胞24 h，實時定量PCR法檢測各組細胞中COLⅠ、Ⅲ mRNA的表達，酶聯免疫吸附試驗測定培養上清液中COL Ⅰ、Ⅲ及Rho激酶蛋白表達水平。結果ALD可上調HK-2細胞中COL Ⅰ、Ⅲ mRNA的表達，并增加培養上清液中Rho激酶、COL Ⅰ、Ⅲ蛋白表達水平，Rho激酶抑制劑Y27632及ALD受體拮抗劑依普利酮可拮抗上述效應。結論ALD可活化HK-2細胞Rho激酶信號傳導通路，并通過Rho激酶誘導HK-2細胞COL Ⅰ、Ⅲ的表達而加速腎小管間質纖維化的進展。

醛固酮；膠原Ⅰ；膠原Ⅲ；Rho激酶；人近端腎小管上皮細胞；腎小管間質纖維化

腎小管間質纖維化是衡量慢性腎臟疾病進展的重要指標之一，是各種腎臟疾病慢性進展，最終致慢性腎衰竭的共同機制[1]。腎間質纖維化的本質是細胞外基質(extracellular matrix，ECM)過度合成而致ECM的異常沉積[2]。近期研究表明，醛固酮(aldosterone，ALD)在腎間質纖維化的發病機制中起著重要作用，可促進體外培養的腎小管上皮細胞表達致纖維化的細胞因子及ECM的表達，是膠原合成的強烈刺激劑[3]。但具體機制仍未完全明確。Rho三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate，GTP)酶家族是Ras超家族中的一員，是真核細胞內重要的信號傳遞分子，在真核細胞信號傳導過程中發揮著分子開關作用。目前發現該家族包括RhoA、RhoB、RhoC等在內的15種成員，其中Rho激酶是RhoA的下游效應蛋白，相對分子質量約160×103，是一個絲/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶，在細胞增殖、凋亡及細胞轉型等過程中起關鍵調節作用[4-7]。本實驗旨在觀察ALD對人腎小管上皮細胞Rho激酶活性的影響，探討Rho激酶信號轉導通路與ALD誘導的腎小管上皮細胞膠原Ⅰ(collagen Ⅰ，COL Ⅰ)、膠原Ⅰ(collagen Ⅲ，COL Ⅲ)表達的關系。

1　材料與方法

1.1材料人近端腎小管上皮HK-2細胞購自中南大學湘雅醫學院細胞庫，來源于美國標準培養物保藏中心(ATCC)。ALD(eplerenone,EPL,美國Amersco公司)，依普利酮(eplerenone,EPL,美國Sigma公司)，Rho激酶抑制劑Y27632(以下簡稱Y27632，美國Sigma公司)，Trizol試劑、RNA反轉錄試劑盒、實時定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)，COL Ⅰ、COL Ⅲ、Rho激酶酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海勁馬公司)，胎牛血清(FBS)、RPMI-1640培養基(美國Gibco公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養及藥物干預HK-2細胞培養于含15%FBS的RPMI-1640培養液中，實驗前用無血清培養液同步化24 h。EPL(10 μmol/L)和Y27632(1 μmol/L)預處理細胞30 min后，100 nmol/L ALD作用于HK-2細胞24 h，作為ALD-EPL組與ALD-Y27632組。另外以未處理HK-2細胞作為對照組，100 mmol/L ALD刺激HK-2細胞作為ALD組。

1.2.2實時定量PCR法檢測細胞中COL Ⅰ、Ⅲ mRNA的表達Trizol提取細胞總RNA。取2 μg RNA反轉錄為cDNA。應用Primer Premier 5.0軟件設計引物，COL Ⅰ(142 bp): 正義5′-GTG GTG AGA CTG GTC CTG CTG-3′，反義5′-AAG CCA CGG TGA CCC TTT ATG-3′；COLⅢ(193 bp)：正義5′-GCC TCC CAG AAC ATT ACA TAC C-3′，反義5′-CTG TCT TGC TCC ATT CAC CAG-3′；3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH，145 bp)：正義5′-GGG TGT GAA CCA TGA GAA GTA TG-3′，反義5′-GAT GGC ATG GAC TGT GGT CAT-3′。引物由上海invitrogen公司合成。PCR 反應條件：94 ℃變性5 min；然后94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環；再于72 ℃延伸5 min。計算目的基因與內參GAPDH的比值，即得目的基因mRNA的表達量。

1.2.3ELISA法檢測細胞培養上清液中COL Ⅰ、Ⅲ及Rho激酶的表達收集細胞上清液，ELISA法檢測細胞上清液中COL Ⅰ、Ⅲ及Rho激酶的表達，按試劑盒說明書操作。

2　結　　果

2.1ALD對HK-2細胞Rho激酶蛋白表達的影響對照組HK-2細胞培養上清液中表達一定含量的Rho激酶蛋白[(51.29±2.74)pg/mL]，100 nmol/L的ALD刺激細胞24 h后(ALD組)，培養上清液中Rho激酶蛋白表達[(74.71±2.61)pg/mL]較對照組明顯增加，差異有統計學意義(P<0.001)。與ALD組比較，ALE-EPL組[(39.51±1.99)pg/mL]和ALD-Y27632組[(48.79±0.45)pg/mL]Rho激酶蛋白表達均降低,差異均有統計學意義(P<0.001)，表明EPL和Y27632均可逆轉ALD的上述效應。見圖1。

*：P<0.01，與對照組比較；#：P<0.01，與ALD組比較。

圖1ALD對HK-2細胞Rho激酶蛋白表達的影響

2.2ALD對HK-2細胞COL Ⅰ、Ⅲ mRNA表達的影響實時定量PCR結果顯示，對照組HK-2細胞中有少量COL Ⅰ、Ⅲ mRNA表達，100 nmol/L的ALD作用HK-2細胞24 h后(ALD組)，與對照組相比，COL Ⅰ、Ⅲ mRNA表達水平均明顯增加，差異均有統計學意義(P<0.05)。與ALD組相比，ALD-EPL組COLⅠ、Ⅲ mRNA表達水平均降低，差異有統計學意義(P<0.01，P<0.001)；ALD-Y27632組COLⅠ、Ⅲ mRNA表達水平均降低，差異均有統計學意義(P<0.01，P=0.001)，表明EPL和Y27632均可明顯抑制ALD所誘導的COLⅠ、Ⅲ mRNA表達。見圖2。

2.3ALD對HK-2細胞培養上清液COLⅠ、Ⅲ 蛋白含量的影響對照組HK-2細胞培養上清液中有一定含量的COLⅠ、Ⅲ 蛋白表達[(5.02±0.77)、(3.95±0.20)μg/mL]，100 nmol/L的ALD刺激細胞24 h后(ALD組)，培養上清液中COLⅠ[(8.63±0.83)μg/mL，P<0.01]、COLⅢ蛋白[(6.0±0.32)μg/mL,P=0.001]表達水平較對照組均明顯增加。與ALD組相比，ALD-EPL組COLⅠA1[(3.70±0.46)μg/mL]、COLⅢA1[(3.66±0.20)μg/mL]表達水平均降低，差異均有統計學意義(P<0.01，P<0.001)；ALD-Y27632組COLⅠA1[(2.19±0.46)μg/mL]、COLⅢA1[(1.36±0.18)μg/mL]表達水平均降低,差異均有統計學意義(均P<0.001)，表明EPL和Y27632均可明顯抑制ALD所誘導的COLⅠ、Ⅲ 蛋白的表達。見圖3。

*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.01，△：P<0.001，▲：P=0.001，與ALD組比較。

圖2ALD對HK-2細胞COLⅠ、Ⅲ mRNA表達的影響

*：P<0.01，△：P=0.001，與對照組比較；#：P=0.001，▲：P<0.001，與ALD組比較。

圖3ALD對HK-2細胞培養上清液COLⅠ、Ⅲ蛋白含量的影響

3　討　　論

腎小管間質纖維化是衡量慢性腎臟疾病進展的重要指標之一，是各種腎臟疾病慢性進展，最終致慢性腎衰竭的共同機制[8]。近年來大量臨床和實驗研究表明，在各種腎臟疾病中，腎小管間質的病變程度是反映腎功能減退嚴重程度和判斷預后最重要的指標。因此,對其發生、發展的機制，以及其防治的研究越來越受到國內外研究學者的重視。目前,盡管采用了多種干預治療措施，仍無法有效延緩大多數患者腎小管間質纖維化的進展，并且隨著血管緊張素轉化酶抑制劑(ACEI)和(或)血管緊張素受體阻滯劑(ARB)在各種腎病患者中的廣泛應用及深入研究，越來越多的臨床證據表明，隨治療時間的延長,ALD脫逸現象的發生導致其降壓外的器官保護效應亦逐漸消失。因此，找尋腎小管間質纖維化可能的發病機制及干預措施，具有十分重要的衛生、經濟和社會意義。

ALD是調節人體水鹽代謝的重要激素，除腎上腺皮質外，肺動脈和腸系膜上動脈的血管內皮細胞、血管平滑肌細胞、肝臟、腎臟及腦組織中均發現ALD合成酶，其可催化合成單乙酰基ALD，并通過旁分泌或自分泌的方式在局部發揮作用。過去一直認為，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是腎素-血管緊張素-ALD系統中造成腎損傷的主要物質。近年的研究結果發現，在進展性腎臟疾病中，ALD亦是重要的獨立的致病因子，其可通過血流動力學效應和直接作用促進腎臟疾病的發生、發展，具有完全不依賴AngⅡ的獨立的致器官纖維化作用，是有絲分裂和膠原合成的強烈刺激劑[3]。

動物實驗及臨床資料均表明，腎臟疾病的進展與ALD有密切關系。各種腎衰竭動物模型及臨床慢性腎衰竭患者均存在高ALD血癥，在大鼠腎衰竭模型中，ALD水平與高血壓、蛋白尿和組織損傷的嚴重程度明顯相關[9]。Walker等[10]亦報道了糖尿病腎病患者血漿ALD水平與腎損傷程度明顯相關。隨著ACEI及ARB在腎病患者中的廣泛應用及深入研究，越來越多的臨床證據發現，隨治療時間的延長，ALD脫逸現象的發生導致其降壓外的器官保護效應亦逐漸消失。而該效應在加用ALD受體拮抗劑后又再次出現[11]。以上均提示ALD在殘余腎的進一步損傷中起著重要的作用。ALD引起腎損傷的機制涉及多個方面。在大鼠抗thy1.1系膜增生性腎小球腎炎模型、單側腎切除致高血壓的大鼠模型、殘余腎衰竭模型、慢性環胞霉素A腎毒性、糖尿病腎病的大鼠模型中發現，ALD能增加前炎性因子的表達，上調轉化生長因子-β1(TGF-β1)、刺激腎間質COLⅠ合成和纖維連接蛋白分泌，而ALD受體拮抗劑，則可減低上述炎性因子及TGF-β1的表達，延緩腎間質纖維化的形成，但具體機制尚不明確。與以往的報道相一致，本試驗結果提示ALD可明顯上調HK-2細胞COLⅠ、Ⅲ mRNA和蛋白的表達，證實ALD可直接誘導腎小管上皮細胞COLⅠ、Ⅲ的合成與分泌，同時鹽皮質激素受體(MR)拮抗劑EPL可拮抗上述效應。

本研究證實，ALD可激活HK-2細胞Rho激酶信號傳導通路。Nagatoya等[12]用Rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho associated coiled coil forming protein kinase，Rock)的特異性抑制劑Y-27632干預小鼠單側輸尿管結扎腎間質纖維化模型，發現其早期炎性細胞浸潤明顯減少，小管間質纖維化也明顯減輕，提示Rho激酶可能通過介導早期炎性細胞浸潤和炎性介質分泌參與腎間質纖維化的發生。Sun等[13]報道，Rho激酶通過TGF-β1依賴旁路參與ALD誘導的腎小管間質損傷。但迄今為止，Rho激酶信號轉導通路是否參與ALD誘導的腎小管上皮細胞膠原的合成國內外尚未見報道。本研究證實，ALD可激活HK-2細胞Rho激酶的活化，同時Rho激酶抑制劑可抑制ALD誘導的腎小管上皮細胞COLⅠ、Ⅲ的分泌。

綜上所述，本試驗證實ALD可激活HK-2細胞Rho激酶信號傳導通路，并通過Rho激酶誘導HK-2細胞COLⅠ、Ⅲ的分泌，從而加速腎小管間質纖維化的進展。

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Study on expressions of collagen Ⅰ and Ⅱ in aldosterone-induced human kidney tubular epithelial cells*

HuangHaiyang1，WeiJiali2△

(1.CentralLaboratory；2.DepartmentofNephrology,HainanProvincialGeneralHospital,Haikou,Hainan570100,China)

ObjectiveTo investigate the role of Rho kinase on collagen(COL)Ⅰ and Ⅲ expression of human renal tubular epithelial cells.MethodsHuman kidney tubular epithelial (HK-2) cells were cultured in the RPMI-1640 culture solution containing 15% fetal bovine serum.After 30 min pretreatment by the ALD receptor antagonist eplerenone(10 μmol/L) and Rho kinase inhibitor Y27632(1 μmol/L),100 nmol/L ALD acted the HK-2 cells for 24 h.The expressions of collagenⅠ and Ⅲ mRNA in each group were detected by real time PCR and the expression levels of COL Ⅰ,Ⅲ and Rho kinase protein were detected by ELISA.ResultsALD could up-regulate the expressions of COLⅠ,Ⅲ mRNA in HK-2 cells,and increased the levels of Rho kinase,COLⅠ and Ⅲ protein,while the Rho kinase inhibitor Y27632 and ALD receptor inhibitor eplerenone could antagonize these effects.ConclusionALD could activate Rho kinase signal transduction pathway in HK-2 cells and accelerate the progression of tubular interstitial fibrosis via Rho kinase induced expression of COL Ⅰ and Ⅲ.

aldosterone；collagen-Ⅰ;collagen-Ⅲ；Rho kinase；human proximal tubular epithelial cells；tubular interstitial fibrosis

海南省社會發展科技專項項目(2012SF04、2013SF04和2015SF43)。作者簡介：黃海燕(1980-)，主管技師，本科，主要從事細胞遺傳學研究。△

，E-mail:wjl525@163.com。

R692

A

1671-8348(2016)21-2900-03

2016-01-24

2016-04-11)

論著·基礎研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.21.006