高遷移率族蛋白B1及其糖基化終產物受體在系統性紅斑狼瘡患者中的變化及其臨床意義*

潘舒月，朱　勇#，劉　怡，青玉鳳，張夢云，蒲夢君，周京國△

(1.成都市第五人民醫院風濕免疫科　611130；2.川北醫學院附屬醫院風濕免疫科，四川南充 637000)

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高遷移率族蛋白B1及其糖基化終產物受體在系統性紅斑狼瘡患者中的變化及其臨床意義*

潘舒月1，朱勇1#，劉怡1，青玉鳳2，張夢云2，蒲夢君2，周京國2△

(1.成都市第五人民醫院風濕免疫科611130；2.川北醫學院附屬醫院風濕免疫科，四川南充 637000)

目的探討高遷移率族蛋白B1(HMGB1)及其糖基化終產物受體(RAGE)在系統性紅斑狼瘡(SLE)發病中可能的作用。方法采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測52例SLE女性患者(SLE組)及40例體檢健康女性(HC組)血漿HMGB1水平；同時采用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測外周血單核細胞(PBMCs)HMGB1及RAGE mRNA表達水平；并分析SLE患者血漿HMGB1及PBMCs HMGB1、RAGE mRNA水平與臨床指標的相關性。結果SLE組患者血漿HMGB1及PBMCs HMGB1 mRNA水平高于HC組，差異均有統計學意義(P<0.01)；而PBMCs RAGE mRNA水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；Spearman相關性分析顯示，SLE患者血漿HMGB1水平與抗核抗體滴度、SLE活動性指數(SLEDAI)評分均呈正相關(P<0.05)，與其他臨床和實驗室指標無明顯相關性(P>0.05)；HMGB1 mRNA表達水平與RAGE mRNA表達水平、SLEDAI評分均呈正相關(P<0.01，P<0.05)，與其他臨床和實驗室指標無明顯相關性(P>0.05)。結論血漿HMGB1及PBMCs HMGB1 mRNA在SLE患者的異常表達提示其可能在SLE的發生、發展中發揮作用，可能參與了SLE的免疫炎癥調節。

系統性紅斑狼瘡；高遷移率族蛋白B1；糖基化終產物受體；炎癥

系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種可累及全身多系統多器官的自身免疫性結締組織病，好發于中青年女性，以免疫性炎癥為突出表現，常與遺傳、性激素、免疫功能紊亂及外界環境等因素有關，發病機制復雜[1-2]。近年來研究發現，高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein，HMGB1)是一種重要的炎性介質，在一定條件下可釋放至胞外參與機體炎性反應[3]。研究發現其在類風濕性關節炎、干燥綜合征、腫瘤等疾病中發揮著重要作用[4-6]。HMGB1在SLE中的作用機制研究，目前國內外尚無統一認識，HMGB1是如何參與SLE的炎癥發生過程，HMGB1介導的信號通路是否在其中發揮了重要作用，尚需要更進一步的研究。因此，本課題組對HMGB1及其重要受體糖基化終產物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)在SLE患者中的變化進行研究，現報道如下。

表1　　兩組一般資料比較±s)

-：無數據。

1　資料與方法

1.1一般資料收集川北醫學院附屬醫院風濕免疫科2012年1～12月門診或住院的活動期SLE女性患者52例納入SLE組，年齡18～69歲，平均(37±12)歲；病程1個月至10年，平均(5±3)年。均采用美國SLE活動性指數(SLEDAI)[7]進行評分，分級標準：0～4分，基本無活動；5～9分，輕度活動；10～14分，中度活動；≥15分，重度活動；輕、中、重度活動均納入。同時收集川北醫學院附屬醫院40例女性體檢健康者作為健康對照(healthy control，HC)組，年齡22～62歲，平均(38±15)歲，均無實驗室指標異常，均排除其他自身免疫性疾病、感染性疾病及腫瘤疾病。研究程序符合川北醫學院附屬醫院制訂的倫理學標準并得到該倫理委員會的批準，且所有受試者均知情同意。

1.2方法

1.2.1常規實驗室指標測定實驗室常規指標測定均在川北醫學院附屬醫院檢驗科完成，血細胞分析采用美國Beckman公司生產的LH750血細胞分析儀，血生化儀分析采用美國Beckman公司生產的DxC800全自動生化儀；包括血細胞計數、紅細胞沉降率(ESR)、C反應蛋白、肝功能、腎功能、抗核抗體譜等。

1.2.2血漿HMGB1水平測定采集所有研究對象清晨空腹(8 h以上)外周靜脈血5 mL(肝素鈉抗凝)，3 000 r/min離心10 min分離血漿，-20 ℃保存標本。人HMGB1酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自USCN生命科學公司。操作步驟按照說明書：在已包被HMGB1抗體的酶標板上，每孔加入已稀釋樣品血漿100 μL或100 μL標準品，37 ℃孵育2 h，棄去液體，甩干后加入檢測溶液A 100 μL，37 ℃孵育1 h，洗滌液洗板3次，加檢測溶液B 100 μL，37 ℃孵育30 min，洗滌液洗板5次，加3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺(TMB)底物90 μL，37 ℃避光孵育15～25 min，加終止液50 μL，立即在酶標儀上以450 nm為測量波長測定其吸光度(A)值。每個標本均做復孔，取其平均值。根據標準品A值及濃度做標準曲線，得到待測血漿的HMGB1水平。

1.2.3外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)總RNA的提取及cDNA的合成人淋巴細胞分離液(天津灝洋生物公司)分離52例SLE患者及年齡與之匹配的40例HC的PBMCs，采用Trizol試劑(美國Invitrogen公司)一步提取PBMCs總RNA，紫外分光光度儀測定A260/A280(1.8～2.0者采用)。取6 μL總RNA，3 μL隨機引物，3 μL反錄酶ReverTra Ace，5×RT-增強添加劑(RT-Enhancer)1.5 μL，5×RT緩沖液12 μL，三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)混合物6 μL，Super-R1 1.5 μL，去RNA酶水(RNase-free H2O)24 μL至總反應體積60 μL，于42 ℃反應60 min，反轉錄為cDNA，凍存于-80 ℃備用。

1.2.4HMGB1、RAGE及內對照β-肌動蛋白(β-actin)mRNA表達檢測采用實時熒光定量PCR(real time quantitative PCR，RT-qPCR)進行檢測，用于擴增的引物均由上海生工生物工程公司合成，HMGB1序列：上游引物5′-TTA CAG AGC GGA GAG AGT GAG G-3′，下游引物5′-TGA CAT TTT GCC TCT CGG CT -3′；RAGE序列：上游引物5′-GGC TGG TGT TCC CAA TAA-3′；下游引物5′-CAC AGA TAC TCC CTT CTC ATT-3′；β-actin：上游引物5′-GAG CTA CGA GCT GCC TGA CG-3′；下游引物5′-GTA GTT TCG TGG ATG CCA CAG-3′。HMGB1 PCR產物長度為193 bp，RAGE PCR產物長度為118 bp，β-actin PCR產物長度為120 bp。試劑盒為RT-qPCR試劑盒(成都博瑞克公司)，熒光染料試劑盒(Power SYBR Green PCR Master Mix，美國ABI公司)，嚴格遵循說明書，采用20 μL反應體系：包括10 μL Power SYBR Green PCR Master Mix，各0.5 μL 10 pmol/L上下游引物，2 μL cDNA，7 μL雙蒸水。反應條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，進行40個循環。每份標本均作復孔，復孔間的Ct值差異控制在0.5以內。所有擴增均在7900 Real-Time PCR儀(美國ABI公司)上進行。以目的基因的Ct值減去內參的Ct值為△Ct，2-△Ct值表示目的基因mRNA表達水平的高低。

2　結　　果

2.1兩組一般資料比較兩組紅細胞(RBC)計數、尿酸(UA)、三酰甘油(TG)水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；而年齡、白細胞(WBC)計數及肌酐(Crea)水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2兩組血漿HMGB1及PBMCs HMGB1、RAGE mRNA水平比較SLE組患者血漿HMGB1水平與PBMCs HMGB1 mRNA表達水平均高于HC組，差異均有統計學意義(P<0.01)； 而兩組PBMCs RAGE mRNA表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。SLE組52例患者中，36例有腎臟損傷，16例無腎臟損傷，有、無腎臟損傷的SLE患者血漿HMGB1及PBMCs HMGB1、RAGE mRNA表達水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表3。

2.3SLE患者血漿HMGB1及PBMCs HMGB1、RAGE mRNA水平與臨床指標的相關性SLE患者血漿HMGB1濃度與抗核抗體滴度、SLEDAI評分呈正相關(P均<0.05)，與其他臨床和實驗指標之間無明顯相關性(均P>0.05)，見表4。

表2　　兩組血漿HMGB1及PBMCs HMGB1、RAGE mRNA水平比較

表3　　有、無腎臟損傷的SLE患者血漿HMGB1及PBMCsHMGB1、RAGE mRNA水平比較

表4　　SLE患者血漿HMGB1、PBMCs HMGB1及RAGEmRNA水平與臨床指標的相關性(n=52)

LY：淋巴細胞，TC：總膽固醇；Alb：清蛋白；GLOB：球蛋白；GLU：葡萄糖；ANA：抗核抗體；C3：補體3；C4：補體4；-：無數據。

3　討　　論

SLE是多種自身抗體介導的自身免疫炎性疾病，多種炎性因子及其信號通路參與了SLE疾病的發生、發展過程。HMGB1還是一種核內非組蛋白，參與DNA的組成，其在進化過程中高度保守[8]。近年來發現，HMGB1還是一種新型的強大致炎細胞因子，可通過體內壞死細胞的被動分泌或者受一定刺激的單核細胞等細胞的主動分泌使其在細胞外參與機體的免疫炎性反應[9]；HMGB1可以促進多種炎性因子的釋放，包括腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，白細胞介素(IL)-1、IL-6、IL-8等的釋放[10]。HMGB1與RAGE、Toll樣受體(TRL)2、TRL4、TRL9等受體結合后，形成炎癥信號通路的上游部分，活化核因子-κB(NF-κB)等下游信號分子，參與機體的免疫炎性反應過程[11-12]；其中RAGE是HMGB1眾多受體中較為重要的受體，與HMGB1有很高的親和力，二者結合后形成炎癥信號通路參與機體炎性反應，在多種疾病的發病機制中發揮作用。

本課題組研究發現，SLE組患者血漿HMGB1水平明顯高于HC組(P<0.01),且相關性分析發現血漿HMGB1與抗核抗體呈正相關，提示HMGB1可能參與了SLE的免疫炎性反應過程，其有望成為判斷SLE炎性反應的一項新指標。通過RT-qPCR本課題發現，SLE組患者PBMCs HMGB1 mRNA表達水平明顯高于HC組(P<0.01)。而SLE組患者PBMCs RAGE mRNA表達水平高于HC組，但差異無統計學意義(P>0.05)，造成該結果原因可能是：(1)樣本量不足，加大樣本量有可能得到不同的結果；(2)HMGB1參與SLE的炎性反應過程可能不是重點通過HMGB1-RAGE結合后形成的信號通路發揮作用，而是借助于其他炎癥信號通路參與SLE的發病機制。Lutterloh等[12]研究發現，HMGB1誘導巨噬細胞和中性粒細胞NF-κB的活化可通過TLR2和TLR4受體與HMGB1結合后形成的炎癥信號通路；Tian等[10]與Urbonaviciute等[13]發現，在SLE發病機制中，HMGB1-DNA免疫復合物起著重要作用，而該復合物的產生主要依賴TRL如TRL2、TRL4、TRL9等。此外，文獻[14-17]研究發現，HMGB1通過與TRL、RAGE受體結合后參與系統性紅斑狼瘡腎炎的發病。本次研究發現系統性紅斑狼瘡腎炎患者血漿HMGB1及PBMCs HMGB1、RAGE mRNA水平與無腎臟損傷患者比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，可能是由于樣本量不足導致，加大樣本量可能會得到不同結果，但筆者更傾向于在系統性紅斑狼瘡腎炎的發病過程中，HMGB1參與其發病過程更多是通過與TRL等HMGB1相關受體結合后，參與系統性紅斑狼瘡腎炎的免疫炎性反應過程。通過以上研究筆者推斷在SLE的發病過程中，HMGB1可能更多的是與TRL結合形成炎癥信號通路，活化下游信號通路分子，參與機體的免疫炎性反應過程，RAGE在HMGB1參與SLE發病過程中可能起次要作用或者不起作用，該推論有待做進一步證實。

綜上所述，活動期SLE患者血漿HMGB1及PBMCs HMGB1 mRNA的異常高表達提示，HMGB1可能參與了SLE的炎性免疫反應過程。然而HMGB1如何介導SLE的發病，是單獨參與或是HMGB1與其受體結合后形成免疫炎癥信號通路參與SLE的發生與發展，還有待后期從蛋白質水平及HMGB1其他相關受體方面做進一步的深入研究，以明確SLE的發病機制，為SLE的治療提供新方向。

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Change and clinical significance of high mobility group protein B1 and its advanced glycation end product receptor in patients with systemic lupus erythematosus*

PanShuyue1，ZhuYong1#，LiuYi1，QingYufeng2，ZhangMengyun2，PuMengjun2，ZhouJingguo2△

(1.DepartmentofRheumatology,ChengduMunicipalFifthPeople′sHospital,Chengdu,Sichuan611130,China；2.DepartmentofRheumatology,AffiliatedHospitaltoNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong,Sichuan637000,China)

ObjectiveTo investigate the possible role of high mobility group box 1 protein (HMGB1) and its advanced glycation end products receptor (RAGE) in the pathogenesis of systemic lupus erythematosus (SLE).MethodsThe enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to determine the level of plasma HMGB1 in 52 cases of SLE (SLE group) and 40 healthy females undergoing physical examination (HC group),at the same time real time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) was employed to detect the expression of HMGB1 and RAGE mRNA in peripheral blood mononuclear cells(PBMCs).The correlation between plasma HMGB1,PBMCs HMGB1 and RAGE mRNA levels with clinical indicators was analyzed.ResultsThe levels of plasma HMGB1,PBMCs HMGB1 mRNA in the SLE group were significantly higher than those in the HC group,the differences were statistically significant(P<0.05),while the level of PBMCs RAGE mRNA had no statistical difference(P>0.05);the Spearman correlation analysis showed that the level of plasma HMGB1 was positively correlated with antinuclear antibodies titers and SLEDAI score in the SLE patients(P<0.01),while had no obvious correlation with the other clinical and laboratory indicators(P>0.05); the HMGB1 mRNA expression level was positively correlated with the RAGE mRNA expression level and SLEDAI scores(P<0.01,P<0.05),and had no obvious correlation with other clinical and laboratory indicators(P>0.05).ConclusionThe abnormal expression of plasma HMGB1 and PBMCs HMGB1 mRNA in SLE patients prompts that which might be involved in the occurrence and development of SLE,might participate in the immune and inflammatory regulation of SLE.

systemic lupus erythematosus；high mobility group box 1 protein；receptor for advanced glycation end products；inflammation

四川省省屬高校科研創新團隊資助項目(14TD0021)。#共同第一作者。作者簡介：潘舒月(1988-)，住院醫師，碩士，主要從事風濕免疫學研究；朱勇(1968-)，副主任醫師，本科，主要從事風濕免疫學研究。△

，E-mail:jgzhou@nsmc.edu.cn。。

R392.32

A

1671-8348(2016)21-2922-04

2016-01-11

2016-03-29)

論著·臨床研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.21.013