壯骨止痛方對細胞周期蛋白cyclin D1的作用研究

卓海燕，曹卉，楊雪，趙雪君，蔣艷菲，張叔琦，李靜，張國民

（湖南中醫藥大學，湖南長沙410208）

壯骨止痛方對細胞周期蛋白cyclin D1的作用研究

卓海燕，曹卉，楊雪，趙雪君，蔣艷菲，張叔琦，李靜，張國民

（湖南中醫藥大學，湖南長沙410208）

目的：探討壯骨止痛方抗骨質疏松作用機制。方法：雌性SD大鼠40只隨機分為模型組、壯骨止痛方組、陽性對照組、假手術組，給藥5 d后制備含藥血清。獲取新生SD乳鼠成骨細胞，培養至第3代，分別加入4組血清。培養6 d后，測定堿性磷酸酶（ALP）活性，用免疫組化法檢測各組細胞中cyclin D1蛋白表達；18 d后進行茜素紅染色，觀察各組鈣化結節。結果：壯骨止痛方組ALP活性以及cyclin D1蛋白表達強于陽性對照組，表明成骨細胞增殖旺盛。結論：壯骨止痛方可提高體外培養成骨細胞cyclin D1表達，對骨質疏松癥有治療效果。

骨質疏松癥；壯骨止痛方；細胞周期蛋白D1

壯骨止痛方由補骨脂、淫羊藿、女貞子、川牛膝、枸杞子、狗脊、骨碎補組成，具有補益肝腎、壯骨止痛功效，能有效治療骨質疏松癥［1］，根據原方經過現代技術加工制成的壯骨止痛膠囊也有相同的療效，但作用機制尚未完全闡明。本次實驗通過研究壯骨止痛方對體外成骨細胞的周期蛋白G1期調節蛋白cyclin D1蛋白表達的影響，探討壯骨止痛方的抗骨質疏松作用，并闡明其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物清潔級10～12個月齡雌性SD大鼠40只，體質量（25±5）g，新生SD乳鼠10只，體質量（45±5）g，由湖南斯萊克景達有限公司提供，許可證號SCXK（湘）2011-0003。

1.1.2 實驗藥物壯骨止痛膠囊由湖南中醫學院附屬第一醫院藥劑科制備（批號980305），膠囊去殼，內容物用涼開水溶解。骨松寶沖劑由貴州富華藥業有限責任公司生產（批號97062），10 g/包，3包/d，骨松寶顆粒用冷開水溶解。兩種藥物均稀釋至27%的濃度供大鼠灌胃用。

1.1.3 實驗試劑小牛血清、青霉素、鏈霉素、SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物有限公司）；細胞堿性磷酸酶（CAKP）染色試劑盒（南京建成生物工程研究所）；即用型兔抗大鼠cyclin D1多克隆抗體、山羊抗兔抗體、PBS緩沖液、二型膠原酶、0.25%胰蛋白酶、低糖DMEM培養基、酒精、H2O2、二甲苯、枸櫞酸鈉緩沖溶液、生理鹽水、RIPA裂解緩沖液。

1.1.4 實驗儀器電熱恒溫培養箱（長沙實驗電爐廠）；電熱恒溫干燥箱（上海市實驗儀器總廠）；電泳儀（北京市六一儀器廠）；離心機、倒置相差顯微鏡（MOTIC）、酶標儀等。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組與造模取清潔級SD雌性大鼠40只，將大鼠按隨機數字表法隨機分為模型組、壯骨止痛方組、陽性對照組及假手術組4組，其中對模型組、壯骨止痛方組、陽性對照組的大鼠進行去卵巢造模手術，模擬絕經后骨質疏松癥。在腹部距離陰道口2～3 cm處，沿腹正中線切開，找到子宮后沿子宮找到卵巢，將卵巢系膜、輸卵管系膜連同輸卵管結扎后摘除卵巢，確認無出血后將子宮連同脂肪還納腹腔，進行縫合［2］。假手術組的手術過程與另外3組相同，但不去除卵巢，即在切開腹腔后進行縫合。

1.2.2 制備含藥血清模型組、假手術組大鼠灌胃生理鹽水，壯骨止痛方組、陽性對照組分別灌胃壯骨止痛方稀釋液和骨松寶沖劑稀釋液，每天2次，連續5 d。末次給藥2 h后股動脈取血，每只取6mL，在4℃下放置4 h，3 000 r/min離心，取血清，于56℃水浴滅活30 min，-20℃保存。同組血清混勻，經0.22μm濾膜抽濾除菌，每管5mL保存，-20℃保存備用。

1.2.3 小鼠原代成骨細胞的培養將新生SD乳鼠10只在75%乙醇溶液中浸泡5min后取出頭蓋骨，并在PBS緩沖液中處理至骨片透明，盡量剪碎，使體積小于1mm3為佳。將軟骨碎片小心移入含有0.25%胰酶的15mL BD管中，然后置于水浴鍋中37℃消化30min，每15min振蕩1次，加入2mL培養液終止反應，放入離心機中離心1 000 r/min 10min。離心完畢后，去上清液，加入PBS液2mL離心3min，10 00 r/min。去PBS液，再加入二型膠原酶4mL，37℃水浴消化1 h，每30min振蕩1次，緊接著1 000 r/min離心10min。去上清液，再加PBS液2mL 1 000 r/min離心3 min。去PBS液，加入培養液并移入25 cm3培養瓶于5% CO237℃條件下繼續培養。3～4 d后，觀察培養液的污染情況，酌情換液，以后每天觀察細胞生長情況和培養液的污染狀況，適時換液。一般3～4 d換液1次，細胞生長密集，數量較多，能覆蓋大部分培養瓶，即可進行細胞傳代。用0.25%的胰酶消化培養瓶中的細胞，將消化下來的部分細胞轉移至原瓶培養，將剩下的移至另一培養瓶培養。根據細胞的生長狀況，取細胞進行實驗，一般取第5代細胞進行實驗。

1.2.4 堿性磷酸酶染色和茜素紅染色在細胞生長狀態良好的情況下取部分細胞進行堿性磷酸酶染色和茜素紅染色。在骨細胞培養6 d后測定堿性磷酸酶活性，并進行堿性磷酸酶染色，觀察照相。使用pH值為4.2的茜素紅Tris-HCl染色液進行染色，觀察其鈣化結節。

1.2.5 分組添加含藥血清分別取成骨細胞經0.25%胰酶消化，接種到24孔培養板中（每組6孔），24 h細胞貼壁后換為含15%血清的培養基（分別加入1.2.2中壯骨止痛方組、模型組、陽性對照組、假手術組含藥血清），培養3 d換液1次，運用免疫組化法檢測cyclin D1的表達及分布情況，并拍照記錄。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 堿性磷酸酶活性檢測

與模型組比較，各組ALP活性升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。與陽性對照組比較，壯骨止痛方組ALP活性更高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。根據重氮鹽法堿性磷酸酶染色顯示，胞漿內含有藍紫色顆粒，說明體外培養的成骨細胞具有合成堿性磷酸酶的活性。結果見表1、圖1。

表1 成骨細胞堿性磷酸酶活性測定結果（金氏單位，±s）

表1 成骨細胞堿性磷酸酶活性測定結果（金氏單位，±s）

注：與模型組比較，1）P＜0.05；與陽性對照組比較，2）P＜0.05

組別n ALP模型組10 91.5±7.8陽性對照組10 536.2±26.21）壯骨止痛方組10 589.7±24.21）2）假手術組10 635.4±34.11）

2.2 茜素紅染色

茜素紅染色均有明顯的鈣化結節，其中陽性對照組、壯骨止痛方組和假手術組鈣化結節多于模型組，且壯骨止痛方組多于陽性對照組，說明壯骨止痛方組成骨細胞分泌ALP的細胞活性強于陽性對照組。結果見圖2。

2.3 免疫組化

陽性對照組、假手術組、壯骨止痛方組cyclin D1蛋白表達均強于模型組，壯骨止痛方組cyclin D1蛋白表達強于陽性對照組。結果見表2，圖3。

表2 Cyclin D1蛋白表達檢測結果比較（±s）

表2 Cyclin D1蛋白表達檢測結果比較（±s）

注：與模型組比較，1）P＜0.05

組別含量（%）模型組11.99±1.58陽性對照組17.33±1.501）壯骨止痛方組18.09±1.891）假手術組18.15±1.911）

圖1 各組堿性磷酸酶染色（×100）

圖2 各組茜素紅染色（×400）

圖3 各組SABC法DAB顯色（×400）

3 討論

原發性骨質疏松癥系老年退行性病變，隨著我國人口結構老齡化的進程，其發病率呈逐年上升趨勢，因此對其防治藥物的開發與研究顯得尤為迫切和重要。生理條件下，破骨細胞的骨吸收與成骨細胞的骨形成通過生物耦聯機制維持動態平衡，這是維持人體正常骨量的關鍵。若此平衡被破壞，骨吸收大于骨形成，骨單位大量流失，則會引發骨質疏松［2］。雌激素缺乏時，成骨細胞G1期調節蛋白cyclin D1、CDK4高表達，提示進入增殖周期的成骨細胞增多且增殖加快；而P21高表達，成骨細胞增殖周期G1期進程被阻滯，可能與成骨細胞凋亡增加、數量相對不足有關。成骨細胞G1期調節蛋白通過影響成骨細胞增殖周期在絕經后骨質疏松癥發病過程中發揮一定的作用［3］，因此，在細胞水平上研究保障成骨細胞正常功能的藥物是防治骨質疏松癥的重要方法之一，也是探討防治骨質疏松癥一類藥物作用機制的方法。

本實驗通過對成骨細胞鈣化及增殖分化的相關研究，發現中藥壯骨止痛膠囊含藥血清加入成骨細胞培養體系后，促使成骨細胞興奮增殖，同時刺激成骨細胞鈣化、增強堿性磷酸酶活性，達到加強成骨細胞增殖、促進成骨細胞分化功能等作用。中醫基礎理論認為“腎者主蟄，封藏之本，精之處也，其華在發，其充在骨，為陰中之少陰，腎者主水，主骨生髓”，中藥壯骨止痛膠囊針對骨質疏松癥“腎封藏失職，腎精氣虧損”之病機特點組方，確立益陰潛陽之法，振奮陽氣，充盈精血，強壯筋骨，有陰陽并補之妙。本實驗顯示中藥壯骨止痛方能在成骨細胞處于G1期時通過增強成骨細胞活性，促進其增殖與分化，從而使人體達到骨充髓滿的狀態，促進骨的形成。

［1］莫新民，曾英，彭瓊輝.壯骨止痛膠囊治療去卵巢雌鼠骨質疏松癥療效的實驗研究［J］.中國中醫基礎醫學雜志，2007，13（3）：195-198.

［2］胡倩倩，靳二輝，任曼，等.動物去卵巢骨質疏松病模型的建立［J］.畜牧與獸醫，2015，47（6）：170-171.

［3］.吳銀生.成骨細胞G1期調節蛋白與絕經后骨質疏松癥關系及中藥干預作用的實驗研究［D］.福州：福建中醫學院，2008.

（編輯：梁葆朱）

The effect of Zhuanggu Zhitong fomula on cyclin D1

Zhuo Haiyan，Cao Hui，Yang Xue，Zhao Xuejun，Jiang Yanfei，Zhang Shuqi，Li Jing，Zhang Guomin
（1.Hunan University of Chinese Medicine，Changsha Hunan 410208）

Objective：To study themechanism of anti-osteoporosis effect of Zhuanggu Zhitong fomula.Methods：40 female SD ratswere randomly divided intomodel group，positive control group，sam operation group and Zhuanggu Zhitong fomula group.Containing serum was prepared 5 d after administration.Osteoblastsof SD neonatal ratswere obtained and cultured to the third generation，then containing serum ofabovegroupswere respectively added in.6 d after culture，alkaline phosphatase activity and protein expression of cyclin D1 were detected.18 d after culture，calcified nodules were observed through alizarin red staining.Result：Compared with positive control group，ALP activity and protein expression of cyclin D1 of Zhuanggu Zhitong fomula group were increased（P＜0.05）.Conclusion：Zhuanggu Zhitong fomula can improve osteoblast cyclin D1 expression and has therapeutic effecton osteoporosis.

osteoporosis；Zhuanggu Zhitong fomula；cyclin D1

R285

A

1671-0258（2016）06-0005-03

2014年湖南省教育廳科學研究優秀青年項目（14B130）；2015年度湖南省大學生研究性學習和創新性實驗計劃項目（2015217，2015220）；2016年度湖南省中醫藥科研計劃重點項目（201612）；2015年地方高校國家級大學生創新創業訓練計劃（201510541013）

卓海燕，講師，E-mail：280733293@qq.com

張國民，博士，教授，E-mail：834095773@qq.com