當歸飲子對銀屑病模型豚鼠神經酰胺含量、AQP-3基因及蛋白表達的干預研究

文謙 李芳梅 楊志波

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當歸飲子對銀屑病模型豚鼠神經酰胺含量、AQP-3基因及蛋白表達的干預研究

文謙 李芳梅 楊志波

目的 探討當歸飲子對尋常型銀屑病模型豚鼠皮膚神經酰胺（ceramide，Cer）含量、水通道蛋白3（aquaporin 3，AQP-3）基因及蛋白表達的干預影響。方法 建立尋常型銀屑病動物模型，分為當歸飲子組、甲氨蝶呤組、生理鹽水組、模型對照組、空白對照組，每組8只，酶聯免疫吸附實驗（ELISA）法檢測造模皮損部位Cer含量，逆轉錄PCR（RT-PCR）和免疫印跡試驗（Western blot）法檢測造模皮損部位AQP-3基因及蛋白表達，分析尋常型銀屑病動物模型皮損與皮膚屏障功能密切相關的基因及蛋白表達的變化。結果 豚鼠耳部皮膚銀屑病模型造模成功。模型對照組皮損中ELISA法檢測Cer含量，以及RT-PCR和Western blot法檢測AQP-3基因的蛋白表達均較低；當歸飲子組與甲氨蝶呤組和各組中Cer含量、AQP-3基因蛋白表達增強（P＜0.01），且當歸飲子組較甲氨蝶呤組增強明顯（P＜0.01）。結論 當歸飲子能增強銀屑病模型豚鼠皮膚Cer含量及AQP-3基因和蛋白表達，對改善銀屑病動物模型的皮膚屏障功能作用確切，效果優于甲氨蝶呤組。

當歸飲子； 尋常型銀屑病； 動物模型； 皮膚屏障功能

水通道蛋白3（aquaporin 3，AQP-3）是一種細胞膜上跨膜運輸水、甘油和尿素等小分子物質的轉運蛋白，是人類皮膚中表達最多的一種水通道蛋白亞型。AQP-3不僅參與皮膚水合、皮膚屏障功能以及創傷愈合，維持皮膚的正常形態和功能，還與角質形成細胞的增殖和遷移甚至早期分化有關。AQP-3與特應性皮炎、白癜風、皮膚腫瘤、銀屑病等多種皮膚病的發病機制相關。神經酰胺（ceramide，Cer）是人體皮膚角質層細胞間混合脂類物質的主要成分，有防止水分散發和防護外界刺激的作用，具有保濕、滋潤皮膚、抗衰老、抗過敏的功能。銀屑病皮損中神經酰胺組成的改變可能與其表皮水分丟失增加有關，特別是Cer1的減少［1］。皮膚角質層神經酰胺分類較多，細胞內不同類型的神經酰胺可發揮不同甚至相反的作用［2-3］，同時測定生物樣品中各種神經酰胺的含量對研究神經酰胺的生物學效應機制具有重要意義。文獻報道中，基本分析神經酰胺的總體水平或某一種神經酰胺，很少涉及同時分類檢測組織或細胞內幾種神經酰胺的含量［4-5］。本研究僅測Cer總體水平。

研究通過觀察當歸飲子（選自《重訂嚴氏濟生方》）對尋常型銀屑病動物模型的干預，用逆轉錄PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）和免疫印跡試驗（Western Blot）法檢測造模皮損部位AQP-3基因及蛋白表達，用酶聯免疫吸附實驗法（ELISA）檢測造模皮損部位神經酰胺含量，分析尋常型銀屑病動物模型皮損處與皮膚屏障功能密切相關的蛋白含量及其基因表達的變化，闡述當歸飲子對銀屑病模型豚鼠皮膚AQP-3和Cer基因及蛋白表達的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

中藥制劑：當歸20 g、白芍20 g、生地黃20 g、川芎15 g、防風20 g、荊芥20 g、何首烏20 g、白蒺藜20 g、黃芪25 g、甘草10 g，每劑藥煎3次，混合3次藥液濃縮至300 mL。

豚鼠，雄性20只、雌性20只，共40只，體質量210～250 g，由中國人民解放軍第四軍醫大學實驗動物中心提供。實驗動物質量合格證：SCXK（軍）2012-0006，合格證編號：0022614，實驗動物使用許可證：SYXK（蘇）2012-0047。

1.2 建模與藥物處理

新鮮配制的10%Na2S溶液脫去豚鼠耳背毛發，次日開始實驗。5%心得安乳劑均勻涂于豚鼠耳背皮膚，厚度1.0 mm，每天3次，連續2周，使其符合銀屑病樣病理改變［6］。40只豚鼠，空白對照組8只，余下32只造模后隨機分為模型對照組、生理鹽水組、當歸飲子組和甲氨蝶呤組4組，每組8只。空白對照組實驗期間正常飼養。生理鹽水組用生理鹽水灌胃，3次/d，每次每只按體重0.01 mL/g，連續2周。當歸飲子組用稀釋的中藥灌胃，每次每只0.01 mL/g，3次/d，連續2周。甲氨蝶呤組：按成人常規用量的5倍口服給藥，給藥劑量為0.5 mg/kg，每天1次，連續2周。

1.3 標本取材及病理切片

2周后，模型對照組4只豚鼠處理耳部皮膚用10%福爾馬林固定，常規標本脫水，透明，石蠟包埋，連續性切片，厚約4 μm，行HE染色。光學顯微鏡下觀察皮膚有無變性壞死、潰瘍、痂皮形成，上皮層次有無增厚，表面角化不全，真皮或皮下組織內有無充血、水腫、炎細胞浸潤等病變。處死模型對照組另外4只與其余組豚鼠，分離耳部皮膚，絞碎組織，-80℃液氮凍存。

1.4 Western Blot法檢測AQP-3蛋白的含量

手動勻漿組織，加入蛋白裂解液，離心，獲得全蛋白提取物，進行蛋白定量測定，取適量（50 μg）蛋白上樣進行SDS-PAGE凝膠電泳，半干轉至硝酸纖維膜上，加入一抗（用一抗稀釋液稀釋），4℃冰箱過夜孵育后洗滌加入二抗，室溫孵育2小時，TBST洗滌緩沖液洗滌后，增強化學發光法（electrochemiluminescence，ECL）顯色，使用 G：BOX chemiXR5成像。

1.5 RT-PCR法檢測AQP-3基因表達

按RT-PCR反轉錄試劑盒說明書操作。采用軟件Primer 5設計引物，由南京金斯瑞科技有限公司合成。

GAPDH內參上游引物：5'-AAGGTCGGAGTGAACGGATTT-3'；下游引物：5'-AGATGATGACCCTTTTGGCAC-3'，產物大小352 bp。

AQP-3上游引物：5'-CCCTCAGGACACTTGGACAT-3'；下游引物：5'-CGTTCTCCTGCTCGGTAGAG-3'，產物大小391 bp。

所有基因PCR反應條件為：95℃5分鐘，95℃變性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸45秒，32個循環，72℃終末延伸10分鐘。

1.6 PCR產物鑒定

PCR擴增產物在2%瓊脂糖凝膠上成電泳、免疫印跡，ECL顯色，并使用G：BOX chemiXR5成像，所有擴增產物的光密度峰值均以GAPDH為基準校正。使用Gel-Pro 32軟件對結果進行灰度分析。

1.7 ELISA法檢測Cer含量

在酶標包被板上空白孔、標準品及待測樣品孔中準確加入標準品原液、標準品稀釋液，后加入被稀釋到200倍的樣品，37℃溫育90分鐘，洗滌，加生物素化抗體按1∶30用抗體稀釋液稀釋，置37℃溫育60分鐘。再洗滌，標準品及待測樣品孔中加入酶標試劑，37℃溫育30分鐘。再洗滌，加入顯色液，37℃避光顯色15分鐘，終止反應。以空白孔調零，450 nm波長按順序測量每個孔的吸光度（OD）值。

1.8 統計學處理

采用SPSS 17.0系統軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD法），P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 造模結果

豚鼠一般情況良好，沒有死亡。4塊豚鼠耳皮膚組織雙面被覆復層鱗狀上皮，上皮下可見真皮和皮膚附件，中間為軟骨，4塊組織病變相似，光學顯微鏡下示豚鼠耳部皮膚銀屑病模型造模成功。

2.2 Western blot檢測AQP-3蛋白電泳結果

模型對照組和生理鹽水組AQP-3蛋白少量表達，當歸飲子組和甲氨蝶呤組表達明顯增加，見圖1。

圖1 AQP-3蛋白電泳圖

2.3 RT-PCR檢測AQP-3電泳結果

PCR產物經過2%瓊脂糖凝膠電泳后，在352、391 bp處分別見GAPDH內參、AQP-3 mRNA的表達，見圖2。AQP-3 mRNA在不同模型組表達不一，模型對照組和生理鹽水組表達最弱，而藥物（當歸飲子、甲氨蝶呤）組較前者表達明顯增加，空白對照組表達最強。

圖2 各組AQP-3 mRNA的PCR電泳圖

2.4 各組豚鼠皮膚組織細胞中AQP-3基因蛋白表達及Cer含量檢測

模型對照組與生理鹽水組AQP-3表達較空白對照組明顯下降（P＜0.01），當歸飲子組和甲氨蝶呤組AQP-3表達較模型對照組明顯上升（P＜0.01），且當歸飲子組較甲氨蝶呤組上升明顯（P＜0.01），與空白對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。生理鹽水組與模型對照組造模組AQP-3蛋白基因表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

空白孔調零，450 nm波長按順序測量每個孔的吸光度（OD）值。造模組藥物干預前后Cer含量比正常組明顯下降（P＜0.01）；造模組藥物（甲氨蝶呤、當歸飲子）干預后Cer蛋白含量比干預前上升（P＜0.01），當歸飲子組比甲氨蝶呤組上升明顯（P＜0.01），見表1。

表1 AQP-3基因蛋白表達及與Cer含量檢測

3 討論

神經酰胺是人體皮膚角質層細胞間混合脂類物質的主要成分，有防止水分散發和外界刺激作用，具有保濕、滋潤皮膚、抗衰老、抗過敏的功能。在皮膚中神經酰胺的含量隨著機體的老化不斷減少，神經酰胺的減少可引起皮膚功能的異常，瘙癢類皮膚病患者的干燥性皮損中神經酰胺的含量明顯低于正常皮膚的含量［7］。在角質層中，神經酰胺具有保水作用，從而進一步提高了皮膚屏障功能。皮膚疾病如銀屑病、異位性皮炎等的發生與角質層中神經酰胺水平的改變，都與經皮水分丟失密切相關［8］。神經酰胺參與細胞的增殖、分化、生長抑制、衰老、凋亡及細胞分泌等多種生理病理過程，其含量的減少可使角化細胞間黏著力下降，細胞排列紊亂、錯位，水分丟失，導致皮膚干燥、脫屑，呈鱗片狀［9］。AQP-3的主要作用是跨膜轉運水分、甘油、尿素等物質以調節皮膚的水平衡，起保濕作用。AQP-3不僅參與皮膚水合作用、構成和調節皮膚屏障功能，保持正常皮膚的功能和形態，AQP-3還參與角質形成細胞的分化，所以能夠幫助皮膚外傷的愈合和恢復，在維持皮膚形態、皮膚屏障功能、保濕、創傷愈合中發揮重要作用，并與特應性皮炎、白癜風、瘤、銀屑病等多種皮膚病的發病密切相關［10］。學者發現AQP-3在銀屑病皮損中表達下降，且分布的部位發生異常，散在地分布于細胞質中［11］。

本實驗結果顯示，模型豚鼠耳部皮膚神經酰胺含量表達降低（P＜0.01），模型豚鼠皮膚組織細胞中AQP-3基因及蛋白表達降低（P＜0.01），表明Cer與AQP-3參與了銀屑病的病理演變，直接或間接影響了皮膚的屏障功能。藥物干預后，當歸飲子組和甲氨蝶呤組Cer蛋白含量表達增強，表明藥物干預對銀屑病模型病理變化有改善作用，且當歸飲子組優于甲氨蝶呤組（P＜0.01）。生理鹽水組與模型對照組AQP-3、Cer蛋白表達水平差異無統計學意義（P＞0.05），提示生理鹽水對模型病理變化沒有影響。

本研究中中藥方劑當歸飲子具有養血潤燥，祛風止癢，益氣固表，涼血，活血化瘀等功效。尋常型銀屑病動物模型皮損的AQP-3基因及蛋白表達明顯下降，Cer含量也明顯下降；當歸飲子組和甲氨蝶呤組干預后AQP-3、Cer上升，證明當歸飲子、甲氨蝶呤改善銀屑病動物模型的皮膚屏障功能作用確定，且當歸飲子組優于甲氨蝶呤組。由于銀屑病的發病機制不明，有復雜的生物學效應參與銀屑病發病過程，推測當歸飲子對尋常型銀屑病模型皮膚屏障功能的調節作用可能是通過增加皮脂含量，調節皮膚屏障功能相關的保濕因子基因和蛋白的表達而使皮膚的屏障功能恢復正常。

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（本文編輯：董歷華）

The intervention study of Danggui Yinzi decoction on the expression of gene and protein of AQP-3 and the content of ceramide in the posriasis vulgaris model of guinea pig

WEN Qian，LI Fang-mei， YANG Zhi-bo.Department of Dermatological，Affiliated Hospital of Chinese Medicine，Xinjiang Medical University，Urumqi 830000，China

YANG Zhi-bo，E-mail：dr.yang888@126.com

Objective To investigate the effect of Danggui Yinzi on the expression of AQP-3 gene and Cer protein of psoriasis model.Methods To establish an animal model of psoriasis vulgaris.The animals were divided into Danggui Yinzi group，methotrexate group，saline group，model control group and blank control group.Aquaporin 3（AQP-3）of skin lesions part was detected with RT-PCR and Western blot methods and ELISA methods was used to detect the ceramide content of skin lesions part.Compared the results of the five groups，and the relationship of the expression changes of gene and protein in skin lesions and skin barrier function was analysed.Results The animal models of psoriasis vulgaris was successful In model control group，the content of ceramide and the expression of gene and protein of AQP-3 were all decreased significantly（P＜0.01）.The expression index was increased in Danggui Yinzi group and methotrexate group and Danggui Yinzi group was increased obviously（P＜0.01）.Conclusion

Danggui Yinzi can enhance the expression of gene and protein of AQP-3 and the protein content of ceramide in skin lesions of psoriasis vulgaris model.It has a definite effect for skin barrier function of psoriasis vulgaris in animal model.The results indicate that the therapeutic effect is more effective than methotrexate

Danggui Yinzi； Posriasis vulgaris； Animal model； Skin barrier function

R285.5

A doi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.08.003

湖南省科技計劃（2011FJ3026）

830000 烏魯木齊，新疆醫科大學附屬中醫醫院皮膚科（文謙）；湖南中醫藥大學研究生院（李芳梅）；湖南中醫藥大學第二附屬醫院中醫外科皮膚科（楊志波）

文謙（1968-），碩士，主治醫師。研究方向：中醫藥防治皮膚病和性病的理論與臨床研究。E-mail：wenq828@163.com

楊志波（1956-），碩士，主任醫師，教授，博士生導師。研究方向：中西醫結合防治皮膚病研究。E-mail：dr.yang888@126.commedicine.

（2015-12-27）