蘋果園鱗翅目夜蛾科DNA條形碼鑒定

武宇鵬，武春生，陸俊嬌，楊　靜，朱朝東*

(1.太原科技大學，太原030024;2. 中國科學院動物研究所動物進化與系統學院重點實驗室，北京100101;3. 山西省農業科學院植物保護研究所，太原 030031)

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蘋果園鱗翅目夜蛾科DNA條形碼鑒定

武宇鵬1, 2，武春生2，陸俊嬌3，楊靜3，朱朝東2*

(1.太原科技大學，太原030024;2. 中國科學院動物研究所動物進化與系統學院重點實驗室，北京100101;3. 山西省農業科學院植物保護研究所，太原 030031)

為了檢驗DNA條形碼在鱗翅目夜蛾科蛾類鑒定中的可行性，本文對采自北京昌平蘋果園內的夜蛾科14種71頭蛾類標本分別提取了DNA，并擴增了線粒體cox1及核基因28S，利用系統發育樹、遺傳距離、閾值等方法進行了鑒定和比較分析。同時，檢驗了目前BOLD系統的鑒定成功率。實驗表明，基于cox1基因和BOLD系統的鑒定成功率達到了100%，而基于28S則很低，為64.8%。用不同方法構建的系統發育樹，鑒定結果均相同。93%的種內遺傳距離小于1%，94%的種間遺傳距離為大于3%，種內種間的遺傳距離形成明顯的3%閾值現象。

果園;夜蛾科;DNA;條形碼

鱗翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae種類絕大多數是農、林業害蟲，世界范圍分布約3.5萬多種 (Poole, 1989)。與大多數鱗翅目其他種類一樣，夜蛾科主要在幼蟲時期危害寄主，雖然一些典型的害蟲在幼蟲時期也能夠鑒定，但大部分主要依靠成蟲的形態特征。而蛾類幼蟲的形態特征不易把握，鑒定很困難，如果在幼蟲時期不能及時準確鑒定，往往會貽誤防治適期，造成害蟲爆發。近年來，昆蟲分類學家隊伍不斷縮減，田間病蟲害的識別大多靠基層工作人員的經驗判斷，結果似是而非，準確性大大降低。

2003年，加拿大生物學家Hebert提出利用cox1基因(線粒體細胞色素氧化酶亞基I基因)對物種進行分類學鑒定，如同超市里的條形碼一樣，稱之為DNA條形碼(DNA Barcoding)(Herbertetal., 2003; 2004a; 2004b)。DNA條形碼技術可在物種生長發育的任一階段，對物種進行鑒定，目前已在靈長類、獸類、爬行類、魚類、鳥類、昆蟲、植物等多個種類和領域中得到了廣泛研究和應用 (Hebertetal., 2004b; Lorenzetal., 2005;Wardetal., 2005; Vencesetal., 2005; Hajibabaeietal., 2006; Kressetal., 2007; Kumaretal., 2007; Burnsetal., 2008; Smithetal.，2008)。隨著DNA條形碼研究的不斷深入開展，2007年加拿大圭爾夫大學正式籌建生命條形碼數據庫系統 (Barcode of Life Data Systems, BOLD)。該數據庫不僅包括DNA序列信息,也包括完整的物種描述、地理分布、標本圖片等信息。利用BOLD系統可實現對物種的快速鑒定。但目前，尚缺乏對BOLD系統鑒定成功率的研究。利用DNA條形碼技術對蛾類幼蟲進行快速鑒定，對農業生產意義重大。但目前通用的DNA條形碼cox1基因是否通用于一切物種尚存在爭議，是否有必要再增加一個基因片段來保證鑒定的準確性尚無定論。

本文用不同的計算方法，基于線粒體cox1基因及核基因28S對采自果園內的夜蛾科15種71頭蛾類標本進行了鑒定和比較分析，基于cox1基因計算并討論了種內種間遺傳距離。同時，檢驗了BOLD系統對本文所采集的71頭標本序列的鑒定成功率。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1標本來源

71頭夜蛾科標本采自北京市昌平區王家園果園(40°10.769′N， 116°2.628′，海拔164 m)。

1.1.2試驗試劑和試驗耗材

DNA提取試劑盒為北京全式金生物技術有限公司。PCR試劑使用TIANGEN天根生化科技有限公司生產的PCR MasterMix。

1.2方法

1.2.1標本采集和處理

利用高壓汞燈誘集夜蛾成蟲，然后采用低溫冷凍致死，取一側后足，用無水乙醇浸泡，置于-20℃冰箱保存。冷凍致死的標本用標本夾展翅，以便進行形態鑒定。

1.2.2DNA 提取

將浸泡于無水乙醇中的后足取出，晾干，分成2-3段，放在1.5 μL的離心管中。按照DNA提取試劑盒使用手冊的說明進行總DNA提取。抽提的DNA溶于200-300 μL的AE緩沖液，并置于-20℃冰箱保存備用。

1.2.3PCR擴增和測序

線粒體cox1擴增引物為通用引物 LCO1490(5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′)和 HCO2198(5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATC A-3′)(Folmeretal., 1994)。核基因28S擴增引物為通用引物 28SU1(5′-GACTACCCCCTGAATTT AAGCAT-3′) 和 28SD1 (5′-GACTCCTTGGTCCGTG TTTCAAG-3′) (Kimetal., 2000)。反應體系均為25 μL，其中上下游引物各0.5 μL，PCR MasterMix 12.5 μL，DNA模板3 μL，ddH2O 8.5 μL。取 3 μL PCR擴增產物使用1%的瓊脂糖膠電泳檢驗。Cox1擴增反應條件為：預變性94℃ 2 min，變性94℃ 1 min，退火53℃ 45 s，延伸72℃ 1 min,行35個循環。28S擴增反應條件為：預變性94℃ 2 min，變性94℃ 1 min，退火58℃ 45 s，延伸72℃ 1 min, 行35個循環。PCR產物測序由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

1.2.4序列比對及數據分析

所得的71條cox1樣本序列進行校對后，在BOLD系統(http://www.barcodinglife.com)中進行鑒定, 并記錄結果。在GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載夜蛾科cox1基因序列545條，與71條樣本序列進行整合，使用ClustalW 進行比對，剔除錯誤序列，得到長度為877 bp 的序列616條。用MEGA 6.0 (Tamuraetal., 2013) 計算屬內、種內種間遺傳距離。篩選出135條同源序列 (包括71條樣本序列) 構建系統發育樹。

所得的71條28S樣本序列進行校對后，在GenBank 中下載夜蛾科28S同源序列4條，與樣本序列進行整合，使用ClustalW 進行比對，得到長度為925 bp 的序列75條，構建系統發育樹。

對于基于cox1和28S整合形成的數據集，分別用MEGA 6.0 構建 Maximum Parsimony (MP) 樹，選擇 Kimura-2-Parameter(K2P)模型(Kimura, 1980)構建 Neighbor-joining(NJ) 樹，選擇Jukes-Cantor 模型 (Jukes and Cantor, 1969) 構建 Maximum Likelihood (ML) 樹。

2　結果與分析

2.1取樣

本文采集標本71頭，均成功獲取線粒體cox1及核基因28S。根據形態特征，71頭標本均成功鑒定到種，歸為14屬14種，標本詳細情況見表1。

2.2BOLD系統鑒定結果

將71頭標本的cox1序列逐一在BOLD系統進行鑒定，BOLD系統鑒定相似度在98.41%-100%，相似度達到100%有35個，全部與形態鑒定結果相同，成功率為100% (表1)。

表1　樣本信息

2.3系統發育樹鑒定結果

在基于cox1序列所構建的系統發育樹中，本文采集的14個種類，除了Eariasclorana沒有同種的同源序列以外，其他13個種均有相同種類的同源序列。MP樹、NJ樹、ML樹的結果顯示，拓撲結構雖有差異，鑒定結果沒有差別。同一種名序列全部聚在一起，而且都為單系，鑒定成功率為100%。與形態鑒定結果完全相符 (圖 1 A-C)。

在基于28S序列所構建的系統發育樹中，只有兩個種有同種的同源序列 GU350477_Helicoverpaarmigera和 HQ178553_Agrotisipsilon。為了提高鑒定的準確性，我們篩選了兩個與Agrotisipsilon和Eariasclorana同屬的同源序列GQ229492_Eariasvitella, AF178904_Agrotissegetum。MP樹、NJ樹、ML樹的結果表明，拓撲結構雖有差異，鑒定結果沒有差別，但鑒定成功率僅為 64.8%。有些同種序列并沒有聚在一起，而有些不同種名的序列反而形成單系。20150133_Lacanobiaaliena與其他10個不同種 20150106-20150115 _Anartatrifolii形成單系， HQ178553_Agrotisipsilon沒有與同種的其他5個種 20150101-2015105_Agrotisipsilon形成單系，而與同屬的 AF178904_Agrotissegetum形成單系。20150137_Maliatthasinifera與兩個不同種 20150129-20150130_Emmeliatrabealis形成單系。20150125-20150127_Eariasclorana與另一個種 GQ229492_Eariasvitella形成單系，20150128_Emmeliatrabealis作為系統發育樹的樹根，沒有與三個同名種聚在一起，顯出較大的差異。 (圖 2A-C)。

2.4種內與種間遺傳距離

篩選的616條cox1序列，共17屬59種，包含本研究的14種。16個屬的屬內平均遺傳距離為0-9.2%，59個種的種間遺傳距離為1.5%-69.9%，平均遺傳距離為18.1%。種內遺傳距離在0-1.8%，平均種內遺傳距離為0.29%，有4個種Abagrotisnefascia,Agrotissp.,Helicoverpapunctigera,Niphonyxsegregata的種內遺傳距離在1.0%-1.8%，其余55個種均小于1%。種間遺傳距離在1.5%-3.0% 的種類全部集中在Abagrotis屬的Abagrotisnefascia，Abagrotisnanalis，Abagrotismirabilis，Abagrotisvittifrons，Abagrotisplacida。

2.5錯誤序列的鑒定

在種內遺傳距離的計算過程中，發現有8個種的種內平均差異很大，最低為3.9%，最高達38.5%。8個種分別為Emmeliatrabealis，Helicoverpaarmigera，Helicoverpaassulta，Helicoverpapunctigera，Helicoverpazea，Macdunnoughiaconfusa，Pyrrhiaumbra，Parabagrotisexsertistigma。8個種的序列中，均有1條以上的序列與其他序列的差異很大，為核實序列的可靠性，本文將所有序列在BOLD系統中進行鑒定，結果發現序列的鑒定結果與標本名稱不符。這種錯誤序列的出現，有可能是測序問題，或是實驗污染所致，這種錯誤會導致鑒定中出現的陽性偏差和陰性偏差，Wiemers等(2007)在對鱗翅目蝶類灰蝶科Lycaenidae的研究中，也發現這一現象。本文在研究過程中，去掉了這些錯誤序列，以免對研究結果產生影響。

圖 1　基于線粒體cox1構建的MP樹(A)、NJ樹(B)、ML樹(C)Fig. 1　MP tree (A), NJ tree (B), ML tree (C) based cox1 gene注：標星序列為本文的樣本序列 (下圖同)。Note：The star-marked sequences are from this paper(the same below).

圖 2　基于核基因28S構建的MP樹(A)、NJ樹(B)和ML樹(C)Fig. 2　MP tree (A), NJ tree (B) and ML tree (C) based 28S gene

3　討論與結論

3.1BOLD系統

BOLD系統所推薦的物種鑒定標準為大于98%，可視為鑒定成功 (Ratnasingham and Hebert, 2007)。從BOLD系統鑒定結果來看，鑒定成功的序列相似度均在98.41%以上，符合BOLD系統推薦的標準。由于BOLD系統執行較為嚴格的數據保存方法，包括DNA序列的原始測序數據和實物標本的證據照片，保證了BOLD系統數據的真實性和準確性，錯誤率遠低于GenBank數據庫，對于其他數據庫有很大的借鑒意義。

3.2系統發育樹

基于cox1基因構建的系統發育樹，鑒定成率為100%，表明cox1作為夜蛾科種類DNA條形碼的通用基因是可行的。MP樹、NL樹和ML樹僅拓撲結構有較小差異，對鑒定結果沒有影響。說明在序列可靠的情況下，聚類分析方法的選擇并不起決定因素。近年來，有研究人員針對其他類群還提出貝葉斯 (Nielsen and Matz, 2006)、Unweighted pair group method with arithmetic mean(UPGMA) (Lahayeetal., 2008)、特征法(宋韶彬等，2014)等計算方法，相對而言，NJ法、ML法更為常用。基于28S構建的系統發育樹，鑒定成功率都比較低，表明28S不適宜于夜蛾科種級分類鑒定，但在一些類群的較高階元系統發育分析中有所應用 (陳誠等2010；梅洪等，2007)

3.3種間差異閾值

本文的研究發現，種內遺傳距離除了4個種在1.0%-1.8%，其他93%的種內遺傳距離都低于1.0% (圖 3)。種內遺傳距離大于1.0%的種類大多分布在不同地區。Abagrotisnefascia采自加拿大英屬哥倫比亞省的不同地區，Helicoverpapunctigera采自澳大利亞和加拿大，Niphonyxsegregate采自加拿大與中國北京，而分布范圍廣泛的物種，如棉鈴蟲，本文了收集了39條cox1序列，種內差異為0。種內遺傳距離較大的現象與物種生殖隔離有關，有助于研究人員對同一物種在不同地域分布演變進行進一步研究。種與種兩兩之間計算出的種間遺傳距離只有10對在1.5%-3.0%，剩余1601對都大于3% (圖 4)。說明Abagrotis屬的這幾個種同源性較高。

圖3　基于Kimura-2-Parameter模型的種內遺傳距離散點圖Fig.3　Intraspecific genetic distances scatter plot based Kimura-2-Parameter model

本文研究發現，種內遺傳距離和種間遺傳距離雖然有稍許重疊，但3%閾值現象仍比較明顯。Hebert等根據鱗翅目研究結果發現種內遺傳距離一般都低于1%，種間遺傳距離至少為3%，同屬種間遺傳距離為6.8%(Hebertetal., 2003)，本文研究結果與Hebert相似。也有學者對閾值提出了反對意見，認為閾值的出現是由于人為取樣的原因所造成(Wiemers and Fiedler, 2007)，3%的種間差異有可能過大，會導致鑒定錯誤 (Rudolfetal., 2008)。本文的取樣僅限于夜蛾科，其他種類有待進一步研究。

DNA條形碼技術一直存在爭議，尤其是cox1基因作為通用序列，并不適用于所有種類，有研究人員嘗試將ITS2、cox2 等多基因片段用于雙翅目、半翅目等類群的DNA條形碼鑒定，已取得較好效果 (Bourkeetal., 2012; Chenetal., 2013)。BOLD系統自籌建以來，歷經多年的豐富和完善，DNA條形碼序列現已超過490多萬條，涵蓋了動物、植物和真菌等多個門類。為物種鑒定、系統發育學及種群遺傳學等相關研究工作提供了有力的支撐。同時也要認識到，DNA條形碼雖然有一定的應用前景，但不能取代傳統分類方法，有時仍然需要綜合形態學、生態學等多種特性來確保物種鑒定的準確性。

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DNA barcoding of moths (Lepidoptera: Noctuidae) in an apple orchard

WU Yu-Peng1, 2，WU Chun-Sheng2，LU Jun-Jiao3，YANG Jing3，ZHU Chao-Dong2*

(1. Taiyuan University of Science and Technology, Taiyuan 030024, China;2. Key Laboratory of Zoological Systematics and Evolution, Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China;3. Institute of Plant Protection, Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030031, China)

In order to test the feasibility of DNA barcoding in identification of noctuid moths of Lepidoptera, 71 samples (14 species in total) were collected from an apple orchard of Changping District, Beijing. And the mitochondrial gene ofcox1 and the nuclear gene of 28S were amplified and sequenced. The comprehensive analysis was performed with the methods of phylogenetic trees, genetic distance, and threshold value. Meanwhile, the success rate of BOLD system for identifying species was examined. The results were as follows: With thecox1 gene and the BOLD system, the success rate of identification achieved 100%. However, the fragment of 28S only possessed the success rate of 64.8%. Using different methods of phylogenetic analysis, the topology structures of different phylogeny trees were consistent, as was the case in species identification. The intraspecific distances that below 1% accounted for 93%, and the interspecific distances that more than 3% occupied 94%. The interspecific genetic distances were greater than the intraspecific distances, with the threshold value of 3%.

Orchard; noctuidae; DNA barcoding

山西省自然基金項目(2015011077)；太原科技大學博士科研啟動基金(20142031)

武宇鵬，男，1978年生，講師，研究方向為環境生物學，E-mail: wuyupeng007@163.com

Authors for correspondence，E-mail: zhucd@ioz.ac.cn

2016-04-05；接受日期Accepted：2016-06-30

Q963；S433.4

A

1674-0858(2016)04-0813-08