豬偽狂犬病毒感染病例的熒光定量PCR檢測

賀志昊，馬惠琴，龍冬梅，王蕓華，楊廷軍，張　平（貴州省畢節(jié)市動物疫病預(yù)防控制中心，貴州　畢節(jié)　551700）

豬偽狂犬病毒感染病例的熒光定量PCR檢測

賀志昊，馬惠琴，龍冬梅，王蕓華，楊廷軍，張平
（貴州省畢節(jié)市動物疫病預(yù)防控制中心，貴州畢節(jié)551700）

畢節(jié)某豬場出現(xiàn)妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎及部分仔豬發(fā)病的情況，為確診病原，對流產(chǎn)胎兒的組織進(jìn)行了實驗室檢測。流產(chǎn)胎兒的組織經(jīng)豬偽狂犬病毒野毒株實時熒光PCR檢測，結(jié)果顯示，胎兒組織為豬偽狂犬病毒（PRV）陽性；根據(jù)臨床癥狀及偽狂犬病毒野毒株實時熒光PCR檢測確診該豬場存在豬偽狂犬病毒野毒感染。

豬偽狂犬病毒；臨床癥狀；實時熒光RT-PCR

豬偽狂犬病屬于皰疹病毒科（Herpesviridae）、豬皰疹病毒屬，是由皰疹病毒I型引起的一種急性傳染病。可導(dǎo)致懷孕母豬發(fā)生流產(chǎn)、死亡、產(chǎn)木乃伊胎及弱仔；新生仔豬發(fā)生大批急性死亡，伴有嘔吐、腹瀉及發(fā)抖，震顫和運(yùn)動失調(diào)等神經(jīng)癥狀［1，2］；免疫抑制豬只對其它疫病易感性增加，影響仔豬生長發(fā)育。豬發(fā)生經(jīng)典偽狂犬病后，其臨診癥狀因日齡而異。成年豬一般呈隱性感染；對懷孕母豬可導(dǎo)致出現(xiàn)流產(chǎn)，產(chǎn)死胎、木乃伊胎和種豬不育等綜合癥候群；15日齡以內(nèi)仔豬的發(fā)病死亡率可達(dá)100%；目前豬群偽狂犬野毒感染率仍呈不斷上升趨勢，臨床發(fā)病癥狀有所緩和，亞臨床感染較多，防控形勢依然十分嚴(yán)峻［3-5］。對畢節(jié)某規(guī)模豬場出現(xiàn)的妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎及部分仔豬發(fā)病的情況，為確診病原，本文利用實驗室實時熒光RT-PCR診斷技術(shù)，最終確診為豬偽狂犬病毒感染引起。

一、材料與方法

（一）材料

1.病料。采集流產(chǎn)胎兒組織放在50%甘油生理鹽水溶液中，低溫冷藏保存運(yùn)至畢節(jié)市動物疫病預(yù)防控制中心獸醫(yī)實驗室。

2.主要試劑。世紀(jì)元亨豬偽狂犬病毒提取試劑盒，豬偽狂犬病毒通用型熒光定量PCR試劑盒

（二）方法

1.樣品的處理：取流產(chǎn)胎兒組織，用手術(shù)剪剪碎混勻后取0.5g于組織勻漿機(jī)中研磨，加入2mL去離子水，研磨均勻后離心取500μL上清液于滅菌離心管中。

2.DNA提?。喊凑肇i偽狂犬病毒提取試劑盒說明書進(jìn)行。

3.實時熒光RP-PCR檢測

反應(yīng)采用25μL體系，反應(yīng)體系為：無菌無核酸水2.7μL，RT-PCR反應(yīng)液10μL，酶混合液0.4μL，熒光探針1.9μL，DNA模板10μL。反應(yīng)條件為：45℃15min，95℃1min；95℃5s，60℃35s，在每個循環(huán)第二步收集FAM熒光信號，共40循環(huán)（報告基因“FAM”，淬滅基團(tuán)“NONE”）

二、試驗結(jié)果

（一）臨床癥狀

仔豬：仔豬高熱41℃以上、食欲廢絕、呼吸困難、流涎、腹瀉等癥狀，繼而表現(xiàn)神經(jīng)癥狀，被毛震顫，繼肌肉痙攣、間歇性抽搐、共濟(jì)失調(diào)、四肢呈劃水狀（見圖1），后期麻痹、臥地不起以至昏迷死亡。懷孕母豬：出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎和不育綜合癥候群，其中以產(chǎn)死胎為主。有輕微的咳嗽，渴欲增加，體溫略有升高。

圖1　病豬呈現(xiàn)抽搐，四肢呈現(xiàn)劃水狀

（二）實時熒光RT-PCR試驗結(jié)果

對流產(chǎn)胎兒組織總DNA進(jìn)行實時熒光RT-PCR檢測，結(jié)果顯示，組織樣品為陽性（見圖2）。

圖2　PRV實時熒光RT-PCR檢測結(jié)果A1：陽性對照；B1：陰性對照；C1/D1/H1：待檢樣品

由圖2可知流產(chǎn)胎兒組織樣品DNA均呈出現(xiàn)特異性擴(kuò)及增曲線?，F(xiàn)

三、討論

目前疫苗免疫接種是預(yù)防和控制豬偽狂犬病的根本措施。該病目前尚無特效的治療方法，主要通過血清免疫進(jìn)行治療。據(jù)報道對1月齡以內(nèi)的仔豬，在感染后12 h腹腔注射抗病血清有治療效果。對體重約20 kg的豬用30 m L含500個中和單位的抗血清治療效果較好，可降低死亡率［6-8］。在病豬未出現(xiàn)神經(jīng)癥狀之前，注射抗偽狂犬病高免血清或病愈豬的全血有一定療效，如已出現(xiàn)神經(jīng)癥狀則效果不明顯?？茖W(xué)的疫苗免疫方案配合抗體檢測驗證免疫效果，采取嚴(yán)格的生物安全措施，消滅豬場的鼠類，堅持自繁自養(yǎng)，無害化處理對預(yù)防本病有重要意義。同時，還要嚴(yán)格控制犬、貓、鳥類和其他禽類進(jìn)入豬場，嚴(yán)格控制人員來往，并做好消毒及定期監(jiān)測等工作，如發(fā)現(xiàn)野毒感染血清學(xué)陽性豬應(yīng)及時隔離或淘汰處理，以保持豬群無野毒感染和安全健康。

豬偽狂犬病一直是發(fā)病率、死亡率都很高的傳染病，一旦發(fā)生會給養(yǎng)豬業(yè)帶來很大損失，因此豬偽狂犬病的預(yù)防、診斷檢測問題一直備受世界各國關(guān)注［9］。豬偽狂犬臨床上多表為母豬的流產(chǎn)和仔豬的腹瀉、神經(jīng)癥狀，僅從臨床表現(xiàn)和剖檢很難將其與有相似癥狀的豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征等區(qū)分開來，需要進(jìn)行實驗室檢測才能確診。本文采用分子生物學(xué)技術(shù)對流產(chǎn)胎兒組織進(jìn)行實時熒光RT-PCR方法的檢測，確診了該次疫病由豬偽狂犬病毒引起。為今后實驗室確診豬偽狂犬病提供基礎(chǔ)科學(xué)依據(jù)。

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（編輯：劉國華）

S8-0

A

1673-9019（2016）12-0030-02

2016-03-30

賀志昊（1986-），男（滿族），河北人，碩士，主要從事實驗室檢測診斷工作。