槐定堿對人胰腺癌細胞株capan-1增殖及侵襲能力的影響

任麗平，李先佳，金少舉

槐定堿對人胰腺癌細胞株capan-1增殖及侵襲能力的影響

任麗平，李先佳，金少舉

目的 探討槐定堿對人胰腺癌細胞株capan-1增殖和侵襲能力的影響。方法 用MTT法檢測不同濃度的槐定堿對capan-1細胞增殖的影響，Transwll實驗檢測槐定堿對capan-1細胞侵襲能力的影響，ELISA實驗檢測MMP-2和 MMP-9表達水平。結果 不同濃度的槐定堿均能明顯抑制capan-1細胞生長(P<0.05)；與空白對照組比較，槐定堿1.25、2.5、5 g·L-1組capan-1細胞MMP-2和MMP-9表達水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。結論 槐定堿能通過下調MMPs的表達水平，有效地抑制capan-1細胞增殖，降低細胞侵襲能力。

胰腺癌；capan-1；槐定堿

胰腺癌起病隱匿、惡性程度高，具有生存率低、病死率高等特點，發病率呈逐年上升趨勢。該病的治療除傳統的手術治療外，藥物治療一直是研究熱點。槐定堿是從中藥苦豆子中提取的生物堿之一[1]，具有抗心律失常、保護心肌、抗菌、抗病毒及鎮痛等作用，對絨癌、惡性葡萄胎等惡性滋養細胞腫瘤具有較好的抑制作用[2]，對癌細胞具有直接殺傷作用，且毒性較低[3]，但其作用機制目前并不明確。基質金屬蛋白酶類(matrix metalloprotein,MMP)為一種常見的鋅離子依賴性內肽酶，能降解細胞外基質和促進血管的生成，可為癌細胞侵襲轉移提供必要條件[4]。其中MMP-2、MMP-9為MMP中常見的酶，與腫瘤細胞的侵襲及轉移關系密切[5]。本研究通過觀察MMP-2、MMP-9表達的變化，探討槐定堿抑制人胰腺癌細胞株capan-1增殖和侵襲力的可能作用機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器 capan-1細胞株由漯河醫專分子生物學實驗室傳代保種。槐定堿為寧夏鹽池縣醫藥公司提供(批號：060630，純度>99%)，用培養基稀釋成不同濃度，過濾除菌4 ℃保存。胎牛血清(杭州四季青生物技術公司，批號：140130)，56 ℃滅活30 min，-20 ℃保存備用)；0.25%胰酶(美國Gibco公司，批號：22250-018)；二甲亞砜(dimethyl sulphoxide, DMSO)(無錫海碩生物有限公司)，四甲基偶氮唑鹽MTT(美國Sigma公司，批號：M2128)；DMEM培養基(Dulbeco’s modified eagle medium, DMEM)(美國Hyclone公司，批號：NAE1396)；MMP-2(編號：MMP200) 和MMP-9(編號：DMP900)ELISA 試劑盒(美國R&D Systems公司)；Transwell小室購于美國Corning公司。TE2000型倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；ST-360酶標儀(上海科華實驗系統有限公司)。

1.2 細胞培養 capan-1細胞株由漯河醫專分子生物學實驗室傳代保種，用含10%胎牛血清的 DMEM 培養基在37 ℃、5% CO2條件下培養，用 0.25%的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(eathylene diamine tetraacetic acid, EDTA)消化。

1.3 方法

1.3.1 MTT法測定槐定堿對人胰腺癌細胞株capan-1細胞增殖的影響 取對數期capan-1細胞，細胞濃度調整至5×104個·mL-1，取100 μL接種于96孔板，貼壁后24 h去上清，分別加入含10、5、2.5、1.25、0.625、0.308、0.154 g·L-1的槐定堿溶液100 μL，對照組給予等量培養液，空白對照組不含細胞只加等量的培養液；每組3個復孔；37 ℃、5% CO2條件下分別培養24、48以及72 h后，每孔加入MTT(5 g·L-1)20 μL，4 h后吸去培養液，每孔加入DMSO 200 μL，震蕩10 min，在酶標儀上讀取570 nm處的吸光度(A)值，檢測重復4次，計算抑制率及半數抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)。

1.3.2 槐定堿對capan-1細胞侵襲力的影響 取出-20 ℃保存的Matrigel基質膠，4 ℃過夜，置于冰上，用無FBS培養基9∶1稀釋基質膠。24孔Transwell小室每孔加入20 μL基質膠溶液，37 ℃孵育30 min，使Matrigel聚合成膠。將各組細胞調整細胞濃度為2×105·mL-1。在Transwell小室下室內加入500 μL含20% FBS的完全培養基，置入鋪過基質膠的Transwell小室，上室內加入200 μL細胞懸液，常規培養24 h。取出小室，棄培養基，4%甲醛固定5 min，結晶紫染色30 min。流水沖洗小室，酒精棉簽小心擦去基質膠和細胞，快速風干。倒置小室，顯微鏡下隨機選取5個視野，計數穿膜細胞，重復3次。

1.3.3 槐定堿對MMP-2及MMP-9的影響 用稀釋液將標準品等比稀釋繪制標準曲線，先加稀釋液40 μL到包被反應孔中，再加入待檢測樣品10 μL，置37 ℃孵育1 h，然后洗滌。于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體50 μL(空白孔不加)。37 ℃孵育0.5 h，洗滌。加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B，避光顯色20 min。于各反應孔中加入2 M硫酸50 μL。在ELISA檢測儀上，于450 nm處，以空白對照孔調零后測各孔吸光度OD值，然后根據標準曲線計算MMP-2及MMP-9的濃度。

2 結果

2.1 MTT法測定槐定堿對capan-1細胞增殖的抑制作用 不同濃度的槐定堿對胰腺癌細胞株capan-1的增長均具有不同程度的抑制增殖作用，呈時間和劑量效應關系，見圖1。根據生長抑制率采用綜合法計算24、48和72 h半數抑制量值，分別為5.93、3.82、2.834 g·L-1。

圖1 槐定堿對capan-1細胞增殖的抑制作用

2.2 Transwell實驗測定槐定堿對capan-1細胞侵襲力的影響 用不同濃度1.25、2.5、5 g·L-1的槐定堿干預48 h后，在顯微鏡(×200)下每孔隨機選擇5個視野計數細胞，各組細胞的穿膜細胞數分別為(25.27±1.53)、(19.42±1.71)和(15.44±2.28)個，分別與空白對照組穿膜細胞數(37.32±3.05)個比較槐定堿組capan-1細胞透膜細胞數明顯減少，差異均有統計學意義(P<0.05)，呈劑量效應關系，見圖2。

A：空白對照組 B、C、D：分別代表槐定堿1.25、2.5、5 g·L-1組圖2 槐定堿作用capan-1細胞侵襲實驗結果(×200)

2.3 ELISA法測定各組細胞MMP-2及MMP-9表達量 與空白對照組比較，槐定堿1.25、2.5、5 g·L-1組capan-1細胞內MMP-2及MMP-9表達水平較明顯下降(P<0.05)，呈劑量效應關系，見圖3。

A：各組MMP-2表達量;B：各組MMP-2表達量。 ①與空白組比較，P<0.05。圖3 ELISA檢測MMP2及MMP-9含量

3 討論

多項研究表明槐定堿對惡性腫瘤有治療作用。首先，槐定堿有誘導凋亡作用，李明潺等[6]發現槐定堿通過激活caspase-3/8途徑誘導肺癌A549細胞凋亡，韓靚等[7]研究發現槐定堿能顯著抑制人胃癌細胞株SGC7901細胞增殖。其次，槐定堿可以抑制腫瘤細胞遷移和侵襲，趙樹鵬等[8]研究發現槐定堿通過NF-κB信號通路和激活凋亡caspase-3酶聯反應信號通路抑制神經膠質瘤U87細胞的侵襲、MMP-2的分泌及抑制腫瘤細胞的增殖。研究表明基質金屬蛋白酶類(matrix metalloprotnases, MMPs)是重要的蛋白水解酶，與癌細胞侵襲轉移密切相關[9]。

本研究中不同濃度的槐定堿組對capan-1細胞有明顯的生長抑制作用，不同濃度的槐定堿能明顯抑制capan-1細胞的增長，并具有濃度和時間的依賴性，尤其5 g·L-1濃度抑制效果尤其明顯，提示槐定堿能顯著抑制capan-1細胞的生長。MMP-2和MMP-9均為MMPs中常見基質金屬酶，能降解細胞外基質，破壞細胞基底膜的連續性和完整性，與胰腺癌[10]、肝癌[11]等癌細胞的侵襲轉移能力以及浸潤密切相關。本研究顯示不同濃度的槐定堿加入capan-1細胞培養液中48 h后，結果顯示槐定堿能在一定程度下調MMP-2和MMP-9水平，而且槐定堿水平越高，MMP-2和MMP-9水平越低，上述結果與槐定堿對其他腫瘤侵襲的影響研究一致[8]。這也提示槐定堿能有效抑制capan-1細胞的增殖及侵襲能力，其具體作用機制還需要進一步研究。

總之，槐定堿能有效抑制capan-1細胞的增殖和侵襲能力，通過協調MMPs的表達水平拮抗胰腺癌的侵襲，對其進一步研究，可為胰腺癌的靶向治療提供新的方法。

[1] 李雪梅,吳云光,潘達鑫.新型抗腫瘤藥槐定堿[J].中國中藥雜志,2006,8(15):656.

[2]Wang M,Lu X,Dong X,et al.pERK1/2 silencing sensitizes pancreaticcancer BXPC-3 cell to gemcitabine-induced apoptosis via regulating Bax and Bcl-2 expression[J].World J Surg Oncol,2015,13(1):451.

[3] 寇小平,邵瑩,占斌,等.槐定堿聯合順鉑對卵巢癌中FHIT,Survivin及PTEN表達的影響[J].現代生物醫學進展,2016,16(24):4763-4766,+4778.

[4] 楊碩,李洪利,李文通,等.乳腺癌中PKCζ、MMP-2、MMP-9的表達及相關性[J].臨床與實驗病理學雜志,2014,30(9):958-962.

[5] 王曼,朱振紅,朱正秋,等.MACC1調節肝星狀細胞表達MMP-2、MMP-9對胃癌細胞遷移侵襲能力的影響[J].胃腸病學和肝病學雜志,2016,25(7):765-768.

[6] 李明潺,王玉麗,董林易.槐定堿對肺癌A549細胞體外增殖和侵襲抑制作用及機制的研究[J].中國藥學雜志,2015,53(13):1111-1116.

[7]韓靚,鄧皖利,呂書勤,等.槐定堿抑制人胃癌細胞株SGC7901增殖的實驗研究[J].湖北中醫藥大學學報,2012,14(2):8-10.

[8] 趙樹鵬,靳彩玲,高國軍,等.槐定堿對神經膠質瘤U87細胞增殖、侵襲及相關信號通路的影響[J].中國腫瘤生物治療雜志,2016,23(3):360-365.

[9] 林云華,姜永光,王俊生,等.Pttg1和MMP13調控前列腺癌細胞侵襲力的研究[J].臨床泌尿外科雜志,2016,31(9):836-840,+845.

[10]楊晟,劉聲財,陳文華,等.1,25-(OH)2VitD3對人胰腺癌細胞侵襲遷移能力及MMP-2、9、14表達的影響[J].山東醫藥,2016,56(34):17-19.

[11]彭利,左連富,王順祥,等.肝癌組織中COX-2、VEGF、MMP-2、MMP-9的表達及相互關系的免疫組化研究[J].實用腫瘤雜志,2005,20(2):134-136.

Sophoridine Effect on the Proliferation and Invasiveness of Human Pancreatic Cancer Capan-1 Cells Lines

REN Li-ping, LI Xian-jia, JIN Shao-ju

(Luohe Medical College,Luohe 462002,China)

ObjectiveTo explore the effect of Sophoridine on proliferation and invasiveness of human pancreatic cancer capan-1 cells lines.MethodsMTT was used to detect the effcct of Sophoridine with different concentration on the proliferation of capan-1 cells. Transwll assay detected the effect of Sophoridine on the invasiveness of capan-1 cells, and ELISA assay detected expression level of MMP-2 and MMP-9.ResultsCompared with control group, different concentration of Sophoridine could inhibit growth of capan-1 cells significantly (P<0.05).The expression level of MMP-2 and MMP-9 were down-regulated for the group with the dosage of 1.25, 2.5, 5 g·L-1Sophoridine, respectively (P<0.05).ConclusionSophoridine could decrease MMPs expression level, inhibit cell proliferation of capan-1, and reduce the cell invasiveness of capan-1.

pancreatic cancer；capan-1 cells；Sophoridine

1672-688X(2016)04-0244-03

10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.04.002

1.河南省高等學校重點科研資助項目(16B310004) 2.漯河醫學高等專科學校2016年度校級研究資助計劃項目(2016-S-LMC-13)

2016-10-07

漯河醫學高等專科學校，河南漯河 462002

任麗平(1984-)，女，河南舞陽人，講師，從事腫瘤藥理學研究。

金少舉，男，博士，副教授，Email：37050573@qq.com

R285.5;R735.9

A