自噬相關基因微管相關蛋白1輕鏈3和叉頭框蛋白O1在胃癌組織中的表達及其意義

陸會飛，牛小平*，沈浩，張偉（.皖南醫學院弋磯山醫院消化內科，安徽　蕪湖400；.病理科）

自噬相關基因微管相關蛋白1輕鏈3和叉頭框蛋白O1在胃癌組織中的表達及其意義

陸會飛1，牛小平1*，沈浩1，張偉2
（1.皖南醫學院弋磯山醫院消化內科，安徽蕪湖241001；2.病理科）

目的：探討自噬相關基因微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light 3，LC3）和叉頭框蛋白O1（forkhead box protein O1，FoxO1）在胃癌組織中的表達及其意義。方法：應用免疫組織化學SP法檢測29例胃癌組織和癌旁正常組織中自噬相關基因LC3和FoxO1的表達情況，分析自噬相關基因表達水平與臨床病理特征之間的相關性。結果：免疫組化結果提示LC3蛋白、FoxO1蛋白在胃癌組織中的陽性表達率均高于癌旁正常組織（P＜0.01）。LC3蛋白表達水平與胃癌的分化程度、淋巴結轉移、臨床分期、侵及胃壁深度明顯相關，與患者的性別、年齡、胃癌發生部位及大小無明顯相關性；FoxO1蛋白表達水平與胃癌的分化程度明顯相關，與患者的性別、年齡、胃癌發生部位、大小、淋巴結轉移、臨床分期、侵及胃壁深度無明顯相關性。結論：自噬相關基因LC3和FoxO1在胃癌組織中表達水平增高，均與胃癌的分化程度相關，且FoxO1高表達是胃癌早期頻發事件，提示自噬活動水平的上調對胃癌的發生、發展具有重要促進作用。

胃癌；自噬；微管相關蛋白1輕鏈3；叉頭框蛋白O1

doi：10.16753/j.cnki.1008-2344.2016.04.005

［Abstract］Objective：To investigate the expression of autophagy related genes microtubule-associated protein 1 light 3（LC3）and forkhead box protein 1 light 3（FoxO1）in gastric cancer tissues and its significance.Methods：The expression of LC3 and FoxO1 protein were examined by immunohistochemical SP method in 29 gastric cancer tissues and adjacent cancer tissues，their relationship with some tumor pathological parameters was analyzed.Results：The positive rates of expression of LC3 and FoxO1 protein in gastric cancer tissues were significantly higher than those in adjacent cancer tissues（P＜0.01）.The expression level of LC3 in gastric cancer tissues was significantly correlated with tumor differentiation，lymph node metastasis，clinical stage and depth of tumor invasion，while it had no correlation with gender，age，tumor location and size of gastric cancer.The expression level of FoxO1 in gastric cancer was significantly correlated with tumor differentiation，while it had no correlation with gender，age，tumor location，size of gastric cancer，lymph node metastasis，clinical stage and depth of tumor invasion.Conclusion：Expression level of autophagy related genes LC3 and FoxO1 increased in gastric cancer tissues，and both of them are correlated with tumor differentiation，moreover，a high expression of FoxO1 is an frequent event in early gastric cancer，which suggested that increased level of autophagy activity plays an important role in promoting the occurrence and development of gastric cancer.

［Key words］gastric cancer；autophagy；LC3；FoxO1

自噬是一種復雜的降解代謝過程，多種自噬相關基因如微管相關蛋白1輕鏈3（microtubuleassociates protein 1 light 3，LC3）、叉頭框蛋白O1 （forkheas box protein O1，FoxO1）和Beclin1等通過復雜而有序的調控來介導細胞自噬的發生［1］。無論正常的生理過程還是異常的病理過程，均有不同程度的自噬活動參與，腫瘤的發病過程亦不例外［2］。本研究通過檢測胃癌及癌旁組織中自噬相關基因LC3和FoxO1的表達水平，以探討自噬水平與胃癌發病過程的關系，為胃癌的治療提供一定的理論依據。

1　資料與方法

1.1一般資料選取皖南醫學院弋磯山醫院2011 年1月至2012年12月行手術切除的29例胃癌組織標本，并選取相應的癌旁正常組織標本29例作為對照組，所有標本的臨床和病理資料均完整，均未接受過放化療等治療。

1.2主要試劑兔抗人LC3多克隆抗體和兔抗人FoxO1單克隆抗體分別由日本MBL公司和美國CST公司生產。

1.3方法采用免疫組化SP法染色，對所有標本組織進行固定、水洗、脫水、浸蠟、包埋、切片，后經脫蠟、水化、熱抗原修復；修復后經冷卻、磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，滴加一抗（其中FoxO1以1∶150稀釋，LC3以1∶200稀釋）孵育切片過夜，用PBS代替一抗作對照；二抗孵育切片，滴加SP試劑，DAB染色、蘇木素復染、樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.4結果判定免疫組化結果采用盲法由2位經驗豐富的病理科醫師獨立閱片，部分不一致的結果經共同商討后最終達成共識。

LC3依據Choi等［3］的判斷標準，對切片中陽性細胞染色強度和陽性細胞占同一視野下總細胞數的比率分別進行評估。陽性細胞比率評分標準：0分，無陽性細胞；1分，陽性細胞數＜30％；2分，陽性細胞數≥30％。染色深度評分：0分，無染色；1分，淡黃色；3分，黃色至棕黃色；1分和3分之間的染色強度為2分。將染色強度評分與陽性細胞比率評分相加的和即為總分值，總分值≥2分為陽性，＜2分為陰性。FoxO1依據Kim等［4］的判定標準，FoxO1在癌細胞的表達超過全片的10％即判定為陽性。

1.5統計學方法采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，采用χ2檢驗和Fisher確切概率法，采用Spearman相關分析法進行相關性分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1胃癌組織和癌旁正常組織中LC3和FoxO1蛋白的表達水平免疫組化SP法染色的組織切片在電子顯微鏡下觀察后，發現LC3蛋白在細胞質中不同程度表達，而FoxO1蛋白在細胞核中不同程度表達，見圖1。LC3蛋白在胃癌組織中的陽性表達率［62.1％（18/29）］高于癌旁正常組織［27.6％ （8/29）］（χ2=5.267，P＜0.01）；FoxO1蛋白在胃癌組織中的陽性表達率［55.2％（16/29）］高于癌旁正常組織［17.2％（5/29）］（χ2=9.032，P＜0.01）。

2.2LC3和FoxO1蛋白表達與胃癌患者臨床病理特征的關系LC3蛋白表達水平與胃癌的分化程度、淋巴結轉移、臨床分期、侵及胃壁深度明顯相關（P＜0.05），與患者的性別、年齡、胃癌發生部位及大小無關（P＞0.05）。FoxO1蛋白表達水平與胃癌的分化程度相關（P＜0.01），與胃癌的發生部位、淋巴結轉移、臨床分期、侵及胃壁深度、大小及患者的性別、年齡無相關性（P＞0.05）。見表1。

圖1　LC3和FoxO1蛋白在胃癌組織和癌旁正常組織中的表達（免疫組化SP染色，×200）

表1　LC3和FoxO1蛋白表達與胃癌臨床病理特征的關系

2.3胃癌組織中LC3和FoxO1蛋白表達的相關性經Spearman相關分析，LC3和FoxO1蛋白在胃癌組織中的表達水平無明顯相關性（r=-0.133，P＞0.05），見表2。

表2　胃癌組織中LC3和FoxO1蛋白表達的相關性

3　討論

胃癌是全球第5位高發惡性腫瘤，并且位居惡性腫瘤死因順位第3位，約有50％的全球新發病例出現在東亞，尤其在中國［5］。盡管治療腫瘤的各種方法在不斷發展，但在大部分國家胃癌的5年生存率仍不超過30％［6］。因此，積極探索胃癌發生發展機制并尋找影響胃癌細胞死亡的關鍵因素是改善胃癌治療效果的重要途徑，而自噬靶向治療胃癌成為近年來胃癌治療方法的研究熱點。自噬是一種高度保守的多步驟的代謝過程，通過降解發生病變的細胞器和已受損的蛋白質來維持細胞內環境的穩定及基因組的完整性［7］，其在眾多腫瘤的發病過程中發揮關鍵作用。在腫瘤形成早期可通過降解損傷細胞器和啟動程序性細胞死亡等途徑而抑制腫瘤的形成［8］，相反，自噬的發生可使腫瘤細胞在中晚期時對抗因血供不足造成的營養缺乏和缺氧致腫瘤細胞不斷繁殖增長，可以看出自噬在腫瘤發病過程中飾演著雙重角色，學者們現在普遍接受的假說是自噬促進了腫瘤的建立與發展，但抑制了腫瘤的啟動。此外，饑餓、營養不良、接觸放射線以及缺氧等生理和病理狀態均能誘導自噬的發生，且細胞自噬的發生過程在分子水平上受多種自噬相關基因如LC3、FoxO1及Beclin1等的調控。

LC3是自噬體的重要組成部分，分為Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅱ型LC3即LC3?Ⅱ基因始終位于胞內自噬體膜上，是自噬體的標志性基因，其含量代表了自噬體的數目。本研究所測LC3基因均為LC3?Ⅱ基因。目前，自噬相關基因在胃癌中研究較少，Liao等［9］研究表明，胃癌組織中LC3基因表達水平是明顯升高的，提示LC3基因相關的自噬水平在胃癌組織中是上調的。本研究結果發現，LC3?Ⅱ蛋白在胃癌組織中表達水平較癌旁正常組織明顯增高；相比高、中分化胃癌，TNMⅠ、Ⅱ期，無淋巴結轉移及未侵及漿膜者，LC3?Ⅱ蛋白在低分化，TNMⅢ、Ⅳ期，有淋巴結轉移及侵及漿膜的胃癌組織中的自噬水平進一步上調，推測惡性程度越高和進展期胃癌自噬活動水平明顯上調，并且腫瘤細胞可通過上調自身自噬水平來促進其增殖生長［9］，提示LC3相關的自噬水平上調對胃癌的發展具有重要促進作用。

FoxO轉錄因子是一類重要的自噬調控相關因子，以FoxO3和FoxO1的作用最為廣泛。FoxO在血管、腦組織、肝臟、胃腸道等組織器官中參與調節細胞凋亡、增殖、代謝等過程。研究表明，FoxO1基因與食管癌［10］、前列腺癌、肺癌等腫瘤的發病過程關系密切，同時，Visal等［11］研究發現FoxO1的高表達可持續上調自噬活性水平進而在腫瘤的發病中發揮重要作用。Kim等［4］進行了FoxO1在胃癌方面的相關研究，發現FoxO1表達是胃癌形成的早期頻發事件；周英姿等［12］報道FoxO1在正常胃黏膜中和低分化腺癌不表達或低表達，而在高、中分化腺癌中表達較高。本研究結果也發現，胃癌組織中FoxO1蛋白表達水平明顯高于癌旁正常胃組織（P＜0.05），且在高、中分化胃癌組織中陽性表達率高于低分化胃癌（P＜0.01）。結合以上研究結果，推測FoxO1高表達是胃癌發生的早期頻發事件，且其相關的自噬活動水平上調對胃癌的發生起著重要的促進作用。

總之，本研究發現胃癌組織中自噬相關基因LC3和FoxO1蛋白的表達水平增高，均與胃癌的分化程度相關，且FoxO1高表達是胃癌早期頻發事件，提示自噬活動水平的上調對胃癌的發生、發展具有重要促進作用，但是其在胃癌發病過程中的具體機制尚未明確闡述。深入研究自噬在胃癌發病中的詳細機制對開辟靶向藥物治療胃癌的新途徑有著重要意義。

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［12］周英姿，張友元，桂律，等.FOXO1A及FLASH在胃癌組織中的表達及其意義［J］.腫瘤防治研究，2010，37（6）：675-678.

（文敏編輯）

Expression of Autophagy Related Genes LC3 and FoxO1 in Gastric Cancer and Its Significance

LU Huifei1，NIU Xiaoping1*，SHEN Hao1，ZHANG Wei2
（1.Department of Gastroenterology，Yijishan Hospital of Wannan Medical College，Wuhu 241001，China；2.Department of Pathology）

R735.2

A

1008-2344（2016）04-0242-03

牛小平（1975—），女（漢），醫學博士，副主任醫師，碩士研究生導師，研究方向：消化系統腫瘤的診治.E-mail：47440311@qq.com

2016-03-08