糖尿病及他汀類藥物治療對穩定型心絞痛患者循環微小RNA-92a表達的影響研究

王 虹，林英忠，龔國平，馬春蘭，伍崇信

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·論著·

糖尿病及他汀類藥物治療對穩定型心絞痛患者循環微小RNA-92a表達的影響研究

王 虹，林英忠，龔國平，馬春蘭，伍崇信

目的探討穩定型心絞痛(SAP)患者循環微小RNA(miR)-92a表達水平與糖尿病及他汀類藥物治療的關系。方法選取2010年3月—2011年3月在廣西壯族自治區人民醫院心內科住院的SAP患者116例，其中合并糖尿病者30例，接受他汀類藥物治療者46例。采用RT-qPCR檢測患者循環miR-92a表達水平。比較是否合并糖尿病及他汀類藥物治療對SAP患者循環miR-92a表達水平的影響；以及是否接受他汀類藥物治療對老年SAP患者循環miR-92a表達水平的影響。結果SAP患者循環miR-92a表達水平為(0.53±0.44)，Pearson相關分析結果顯示，SAP患者年齡與循環miR-92a表達水平呈正相關(r=0.217，P=0.019)。以循環miR-92a為因變量，年齡為協變量，協方差分析結果顯示，糖尿病與年齡對循環miR-92a表達水平的影響存在交互作用(F=19.631，P<0.05)；他汀類藥物治療與年齡對循環miR-92a表達水平的影響存在交互作用(F=2.346，P<0.05)。多因素方差分析結果顯示，老年合并糖尿病接受他汀類藥物治療的SAP患者循環miR-92a表達水平低于未接受他汀類藥物治療的SAP患者(F=22.080，P=0.001)；老年未合并糖尿病的SAP患者，是否接受他汀類藥物治療者循環miR-92a表達水平比較，差異無統計學意義(F<0.001，P=0.992)。結論糖尿病及他汀類藥物治療對SAP患者循環miR-92a表達水平存在影響，且他汀類藥物治療使老年合并糖尿病SAP患者循環miR-92a表達水平降低，提示他汀類藥物可能通過調控循環miR-92a表達水平進而起到改善內皮功能的作用。

心絞痛，穩定型；老年人；糖尿病；他汀；微RNAs

王虹，林英忠，龔國平，等.糖尿病及他汀類藥物治療對穩定型心絞痛患者循環微小RNA-92a表達的影響研究[J].中國全科醫學，2016，19(24)：2876-2879.[www.chinagp.net]

WANG H，LIN Y Z，GONG G P，et al.Influence of diabetes and statin therapy on expression of circulating microRNA-92a in patients with stable angina pectoris[J].Chinese General Practice，2016，19(24)：2876-2879.

隨著老齡化社會的發展，老年人心血管系統結構發生退行性改變，功能下降，年齡相關性疾病增多。而所有年齡相關性疾病有一個共性，即炎性反應[1]。微小RNA(microRNAs，miRNAs)是近年發現的小的內生性單股無編碼的由18～24個核苷酸組成的RNA，miRNAs是基因表達的重要調節器。越來越多的證據證明，miRNAs不僅在正常組織的發生、發展及生理特點中起到關鍵作用，而且對糖尿病、癌癥、心臟病、炎癥的發生發展有重要影響[2-5]。研究發現miRNAs與內皮完整性[6]、致動脈粥樣硬化脂質所導致的巨噬細胞炎性反應[7]、血管平滑肌細胞增殖[8]及脂蛋白的合成[9]有關。本研究旨在探討穩定型心絞痛(stable angina pectoris，SAP)患者循環微小RNA-92a(microRNA-92a，miR-92a)表達與糖尿病及他汀類藥物治療的關系。

1　對象與方法

1.1研究對象選取2010年3月—2011年3月在廣西壯族自治區人民醫院心內科住院的SAP患者116例，其中男88例，女28例；年齡33～84歲，平均年齡(62.9±10.8)歲，≥60歲66例，<60歲50例；96例合并高脂血癥，70例合并高血壓，30例合并糖尿病。排除1型糖尿病、惡性腫瘤、外周血管病變、增生性視網膜病變、炎癥、急性出血或輸血史及促紅細胞生成素使用史、未絕經婦女。本研究經本院倫理委員會審議后同意實施，患者均簽署知情同意書。

1.2診斷標準SAP診斷符合慢性穩定型心絞痛診斷與治療指南[10]。高脂血癥以低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)>1.8 mmol/L判定[11]。2型糖尿病診斷依據[12]：糖化血紅蛋白(HbA1c)≥6.5%或空腹血糖(FPG)≥7.0 mmol/L(空腹是指禁食碳水化合物至少8 h)或口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)餐后2 h血糖(2 hPG)≥11.1 mmol/L或有典型高血糖或高血糖危象癥狀的患者隨機血糖(RPG)≥11.1 mmol/L。

1.3他汀類藥物治療患者在入院前從未服用他汀類藥物或者此次發病前停服他汀類藥物歸為非他汀類藥物治療，共70例(60.3%)；患者在入院前一直未間斷服用他汀類藥物歸為他汀類藥物治療，共46例(39.7%)，其中服用阿托伐他汀33例(71.7%)，瑞舒伐他汀6例(13.0%)，辛伐他汀5例(10.9%)，普伐他汀1例(2.2%)，氟伐他汀1例(2.2%)；入院前連續服用他汀類藥物的時間為1個月～1年。

1.4循環miR-92a測定

1.4.1外周血單個核細胞分離患者均在入院后次日清晨抽取外周靜脈血10 ml，與等量含肝素的磷酸鹽緩沖液(PBS)混勻后，加入密度為1.077 g/ml的Ficoll-Paque分離液(Sigma公司)，以2 000 r/min離心30 min，離心半徑19 cm，吸取中間界面的白色絮狀單核細胞層，加入PBS，以上述相同的條件進行離心，去除殘留的Ficoll-Paque分離液。

1.4.2總RNA抽提將外周血單核細胞加入Trizol(美國Invitrogen公司)裂解，按產品說明書一步法抽提總RNA。

1.4.3RT-qPCR檢測循環miR-92a表達水平使用All-in-One miRNATMqPCR檢測試劑盒(Gene Copoeia公司)，其中包括2.5 U/μl Poly A Polymerase，RTase Mix、5×Reaction緩沖液、ddH2O(RNase/DNase free)、2×All-in-OneTMqPCR Mix、50×ROX Reference Dye、100 μmol/L Universal Adaptor PCR Primer，按照說明書進行：(1)通過Poly A Polymerase 對miRNA 3′加“Poly A”處理；(2)采用M-MLV RTase及獨特的Oligo dT Adaptor引物對Poly A化的RNA進行反轉錄；(3)采用含有SYBR Green的All-in-OneTMqPCR Mix于羅氏Lightcycler qPCR儀對目的基因miR-92a的表達進行特異性檢測。反應條件為：第一步95 ℃ 10 min后，第二步95 ℃ 10 s，之后每20 s降低2 ℃，直至72 ℃ 10 s，共進行40個循環，在循環結束后立即進行溶解曲線分析。每例樣本均經雙孔重復。hsa-miR-92a基因引物序列為5′-UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU-3′。U6序列為5′-CAAGGATGACACGCAAATTCG-3′，產物經溶解曲線單峰驗證，于T階段采集信號獲得Ct值，以上由經驗豐富的PCR實驗技師專人操作，采用雙盲法，計算測試基因與內參基因snRNA U6比值，作相對量分析，用2-ΔΔCt法計算miR-92a的表達水平，經Johnson轉換[13]后數值表示循環miR-92a表達水平。

2　結果

2.1SAP患者循環miR-92a表達水平SAP患者循環miR-92a表達水平為(0.53±0.44)，中位數為0.32〔95%CI(-0.79，0.70)〕。Pearson相關分析結果顯示，SAP患者年齡與循環miR-92a表達水平呈正相關(r=0.217，P=0.019)。

2.2糖尿病及他汀類藥物治療對SAP患者循環miR-92a表達水平的影響合并糖尿病患者循環miR-92a表達水平為(0.72±1.07)，未合并糖尿病患者循環miR-92a表達水平為(-0.27±0.97)。以循環miR-92a為因變量，以年齡為協變量，協方差分析糖尿病對循環miR-92a表達水平的影響，結果顯示，糖尿病與年齡對循環miR-92a表達水平的影響存在交互作用(P<0.05)，糖尿病對循環miR-92a表達水平主效應不顯著(P>0.05)，年齡對循環miR-92a表達水平主效應不顯著(P>0.05，見表1)。接受他汀類藥物治療患者循環miR-92a表達水平為(0.42±0.03)，未接受他汀類藥物治療患者循環miR-92a表達水平為(0.88±0.20)。以循環miR-92a為因變量，以年齡為協變量，協方差分析他汀類藥物治療對循環miR-92a表達水平的影響，結果顯示，他汀類藥物治療與年齡對循環miR-92a表達水平的影響存在交互作用(P<0.05)，他汀類藥物治療對循環miR-92a表達水平主效應不顯著(P>0.05)，年齡對循環miR-92a表達水平主效應顯著(P<0.05，見表2)。

2.3他汀類藥物治療對老年合并糖尿病的SAP患者循環miR-92a表達水平的影響以循環miR-92a為因變量，方差分析老年、糖尿病、他汀類藥物治療三因素二水平對循環miR-92a表達水平的影響。結果顯示，糖尿病偏差平方和為26.857，P<0.001；老年、糖尿病、他汀類藥物治療交互作用偏差平方和為15.557，P<0.001。多因素方差分析結果顯示，老年合并糖尿病接受他汀類藥物治療的SAP患者循環miR-92a表達水平低于未接受他汀類藥物治療的SAP患者，差異有統計學意義(P<0.05)；老年未合并糖尿病的SAP患者，是否接受他汀類藥物治療者循環miR-92a表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05，見表3)。

表1糖尿病與年齡對SAP患者循環miR-92a表達水平的影響

Table 1Effect of diabetes and age on the expression of circulating miR-92a in SAP patients

因素Ⅲ型平方和自由度均方F值P值糖尿病0.77510.7750.8390.362年齡1.40811.4081.5240.220糖尿病×年齡15.011115.01119.6310.001

表2他汀類藥物治療與年齡對SAP患者循環miR-92a表達水平的影響

Table 2Effect of statin therapy and age on the expression of circulating miR-92a in SAP patients

因素Ⅲ型平方和自由度均方F值P值他汀類藥物治療4.46114.461<0.0010.998年齡4.24914.2493.9860.048他汀類藥物治療×年齡0.00110.0012.3460.036

Table 3Effect of statin therapy on the expression of circulating miR-92a in elderly SAP patients

接受他汀類藥物治療例數循環miR-92aF值P值合并糖尿病22.0800.001 是120.20±0.66 否101.44±0.55未合并糖尿病<0.0010.992 是17-0.16±0.73 否27-0.16±1.21

注：miR-92a=微小RNA-92a

3　討論

冠狀動脈粥樣硬化是SAP的主要發病基礎，研究發現循環miR-92a過表達可減少抗動脈粥樣硬化血流調控性轉錄因子KLF2的表達，其在氧化應激條件下，經固醇調節元件結合蛋白2(SREBP2)激活調控下由內皮細胞釋放入血，誘發巨噬細胞介導的炎性反應，繼而誘發或加速動脈粥樣硬化[14]。目前有研究認為循環miR-92a可能是內皮細胞損傷的啟動或高度相關性因素[14]。老年人冠心病發病率高，且常并存高血壓、高脂血癥、糖尿病等疾病。本研究結果顯示，年齡與循環miR-92a表達水平呈正相關。既往文獻表明，高脂血癥、高血壓對SAP患者循環miR-92a表達水平無影響[15]，因此本研究重點分析糖尿病及他汀類藥物治療對SAP患者循環miR-92a表達水平的影響。

2型糖尿病時機體處于高血糖、胰島素抵抗、血脂代謝紊亂等異常代謝狀態，血管內皮功能受損，血管內皮分泌的內皮素、一氧化氮等血管活性物質失調。血管內皮損傷是糖尿病早期發生器官功能障礙的重要原因。研究表明在高糖環境下，內皮細胞可發生不同程度的代謝及結構改變，導致血管功能紊亂[16]，加速動脈粥樣硬化的發生與發展，增加心肌梗死和腦卒中的發生率[17]。內皮功能紊亂是冠心病、糖尿病血管并發癥發生的關鍵和始動環節。動脈粥樣硬化是多種因素共同作用，如脂質在動脈壁蓄積致慢性炎性反應而成。而早期粥樣斑塊形成及進展的最主要因素是內皮完整性的消失。內皮功能異常導致內皮下富含脂質的脂蛋白的蓄積，血管舒張功能受限，繼而促炎性反應及血栓形成[17]。本研究結果表明，糖尿病與年齡對循環miR-92a表達水平存在交互作用，提示循環miR-92a表達水平可能與血管炎性反應、血管內皮功能紊亂相關。對合并糖尿病的冠心病患者更應強化改善內皮功能的治療。

雖然目前尚未完全清楚循環miRNAs的確切功能，但其與多種病理過程密切相關是被廣泛接受的。最近研究發現，miRNAs與炎性反應過程及內皮功能有密切關系[18-19]。WU等[20]發現在人臍靜脈內皮細胞體外實驗中，循環miR-92a過表達可減少抗動脈粥樣硬化血流調控性轉錄因子KLF2的表達。KLF2在mRNA及蛋白質水平上調控內皮型一氧化氮合酶及血栓調節蛋白[21]，進而引發炎性反應，促進炎性細胞與內皮細胞的黏附和血栓形成。研究發現內皮祖細胞通過轉換成新生的健康的內皮細胞以替換凋亡或者受損的內皮細胞進而維持內皮完整性[22]。有研究表明他汀類藥物可通過下調miRNAs的表達，進而改善內皮祖細胞的功能及數量[23]。本研究結果表明，老年合并糖尿病接受他汀類藥物治療的SAP患者循環miR-92a表達水平低于未接受他汀類藥物治療的SAP患者，提示他汀類藥物通過調控循環miR-92a治療血管內皮損傷可能具有臨床應用價值。

作者貢獻：王虹進行試驗設計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；龔國平、馬春蘭、伍崇信進行試驗實施、評估、資料收集；林英忠進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：賈萌萌)

Influence of Diabetes and Statin Therapy on Expression of Circulating MicroRNA-92a in Patients With Stable Angina Pectoris

WANGHong，LINYing-zhong，GONGGuo-ping，MAChun-lan，WUChong-xin.

DepartmentofCardiology，thePeople′sHospitalofGuangxiZhuangAutonomousRegion，Nanning530021，China

LINYing-zhong，DepartmentofCardiology，thePeople′sHospitalofGuangxiZhuangAutonomousRegion，Nanning530021，China；E-mail：yingzhonglin@126.com

ObjectiveTo investigate the relationship among expression level of circulating microRNA-92a(miR-92a)，diabetes and statin therapy in patients with stable angina pectoris(SAP).Methods116 SAP patients，who were in the People′s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region from March 2010 to March 2011，were selected，including 30 patients with diabetes and 46 patients with statin therapy.The circulating miR-92a was detected by RT-qPCR.The difference of the circulating miR-92a expression level in SAP patients with or without combination of diabetic and statin therapy；and the difference of the circulating miR-92a expression level in elderly SAP patients with or without statin therapy were compared.ResultsThe expression level of miR-92a in SAP patients was(0.53±0.44).The results of Pearson correlation analysis showed that the age of SAP patients was positively correlated with the expression level of miR-92a(r=0.217，P=0.019).With the circulating miR-92 as the dependent variables and age as covariate，covariance analysis showed that diabetes and age had interaction effects on the circulating miR-92a(F=19.631，P<0.05)；statin therapy and age had interaction effects on the circulating miR-92a(F=2.346，P<0.05).The results of multi-factor analysis of variance showed that the expression level of circulating miR-92a in elderly SAP combined with diabetes patients who received statin therapy was lower than that in SAP patients who did not receive statin therapy(F=22.084，P=0.001)；whether receiving statin therapy or not，the circulating miR-92a expression levels of SAP patients combined with diabetes showed no significant differences(F<0.001，P=0.992).ConclusionDiabetes and statin therapy have effect on the expression level of circulating miR-92a in SAP patients.Statin therapy can lower the circulating level of miR-92a in SAP patients combined with diabetes，which indicates that statin may improve endothelial function through regulating and controlling miR-92a.

Angina，stable；Aged；Diabetes mellitus；Statin；MicroRNAs

國家自然科學基金資助項目(81360055)；廣西衛生廳重點課題(S201315-04)；廣西南寧市青秀區科技攻關課題(2014S06)

530021 廣西南寧市，廣西壯族自治區人民醫院心內科

林英忠，530021 廣西南寧市，廣西壯族自治區人民醫院心內科；E-mail：yingzhonglin@126.com

R 541.4

ADOI：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.24.001

2015-12-23；

2016-06-18)