核轉錄因子κB p65和骨橋蛋白在子宮內膜異位癥中的表達及相關性研究

白治苗，李望舒，姚衛衛，盧玉鳳，楊 眉，哈春芳

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·專題研究·

核轉錄因子κB p65和骨橋蛋白在子宮內膜異位癥中的表達及相關性研究

白治苗，李望舒，姚衛衛，盧玉鳳，楊 眉，哈春芳

背景目前子宮內膜異位癥(EMs)的病因和發病機制尚不清楚，治療措施有限，嚴重影響女性的身心健康。目的探討核轉錄因子κB(NF-κB)p65和骨橋蛋白(OPN)在EMs組織中的表達及二者的相關性。方法收集2013年1—12月于寧夏醫科大學總醫院婦產科因EMs行手術的患者35例(病例組),于術中或術后確診，其中增生期17例，分泌期18例；收集同期行雙側輸卵管結扎手術并經病理科診斷排除EMs的正常子宮內膜者30例作為對照(正常子宮內膜組)，其中增生期15例，分泌期15例。分別采用免疫組化SP法、RT-PCR法檢測正常子宮內膜組、EMs在位內膜組和EMs異位內膜組NF-κB p65、OPN及其mRNA的表達。結果NF-κB p65、OPN主要表達于子宮內膜腺上皮細胞的胞質中，極少數表達于間質細胞中。EMs在位、異位內膜組NF-κB p65和OPN表達高于正常子宮內膜組，EMs異位內膜組高于EMs在位內膜組(P<0.05)。3組增生期及分泌期NF-κB p65的表達比較，差異無統計學意義(P>0.05)，EMs在位、異位內膜組分泌期OPN的表達均高于增生期(P<0.05)；EMs在位內膜組和EMs異位內膜組中NF-κB 與OPN的表達均呈正相關(r在位=0.88，r異位=0.78，P<0.05)。NF-κB p65、OPN mRNA在EMs在位、異位內膜組中的表達高于正常子宮內膜組,EMs異位內膜組高于EMs在位內膜組(P<0.05)。結論NF-κB p65、OPN及其mRNA在EMs患者在位、異位內膜組織的表達明顯增強，并呈正相關，提示二者極有可能通過相互激活進而誘導EMs的發生、發展。

子宮內膜異位癥；核因子κB；骨橋蛋白質

白治苗，李望舒，姚衛衛，等.核轉錄因子κB p65 和骨橋蛋白在子宮內膜異位癥中的表達及相關性研究[J].中國全科醫學，2016，19(24)：2915-2919.[www.chinagp.net]

BAI Z M,LI W S,YAO W W,et al.Expression of NF-κB p65 and OPN in endometriosis and their correlations research[J].Chinese General Practice，2016，19(24)：2915-2919.

子宮內膜異位癥(EMs)是指子宮內膜移位到宮腔以外的任何部位，尤以卵巢最為常見；是引起下腹墜脹痛、月經失調、性交痛以及不孕的常見病因[1]。目前該病的病因與發病機制尚不清楚，治療措施有限，臨床上主要以手術治療為主，但術后復發、術中病灶清除不干凈等使患者的預后欠佳，因此藥物治療在EMs患者的術后恢復中發揮重要作用[2]。EMs在病理上呈現為良性疾病，卻有著類似惡性腫瘤的侵襲、種植及遠處轉移等生物學行為。隨著對EMs研究的不斷深入，有研究發現EMs的發生極有可能與細胞的異常增殖、凋亡的抑制活動有關聯[3]。核轉錄因子κB(NF-κB)是細胞內重要的核轉錄因子之一，可促進細胞因子、黏附分子、生長因子、環氧化酶-2、基質金屬蛋白酶等表達，參與啟動并調節機體免疫和炎性反應、細胞的凋亡及增殖分化[4]。骨橋蛋白(OPN)是細胞信息傳導通路中一種由多種細胞表達和分泌的磷酸糖蛋白，有研究表明OPN與其受體結合后參與細胞黏附、趨化、應激依賴的血管新生、凋亡的阻抑活動，誘導EMs的發生[5]。本課題組前期實驗已經證實OPN在大鼠模型的在位內膜、異位內膜中呈高表達，且與EMs的發生、發展密切相關[6]。本實驗通過免疫組化SP法、RT-PCR法分別檢測NF-κB p65、OPN及其mRNA在正常子宮內膜、EMs在位內膜以及異位內膜中的表達；并分析兩者之間的相關性，以推測兩者在EMs發病機制中的可能作用。

1　資料與方法

1.1病例納入標準病例組和正常子宮內膜組前次月經周期均正常，病例組術中或術后經病理科證實為EMs，近3個月均未接受過激素類藥物治療，無子宮息肉、子宮內膜非典型性增生、生殖道炎癥等婦科器質性疾病。患者年齡20～45歲。

1.2病例組收集2013年1—12月于寧夏醫科大學總醫院婦產科因EMs行手術,術中或術后確診的患者35例，其中增生期17例，分泌期18例。病例組按照組織獲取部位分為EMs在位內膜組和EMs異位內膜組。

1.3正常子宮內膜組收集同期行雙側輸卵管結扎手術并經病理科診斷排除EMs的30例正常子宮內膜作為對照，增生期、分泌期各15例。

1.4主要試劑免疫組化SP法：兔抗人NF-κB p65、OPN多克隆抗體均購自美國Abcam生物公司(稀釋濃度分別為1∶100、1∶80)，DAB顯色試劑盒、PV-6001試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。NF-κB p65、OPN引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；RT-PCR法：cDNA反轉錄核、免疫熒光定量試劑盒均購自美國Thermo公司。

1.5實驗方法

1.5.1免疫組化SP法組織由病理科證實為EMs后于40%甲醛溶液中浸泡過夜，10%甲醛溶液固定，程序脫水、石蠟包埋，3～4 μm厚度連續切片，在65 ℃烤箱過夜，經過脫蠟、抗原修復、一抗孵育過夜、二抗孵育2 h，DAB顯色、梯度乙醉脫水、二甲苯透明等步驟后用中性樹膠封固，以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.5.2RT-PCR法步驟根據引物設計原則并參照人類NF-κB p65、OPN基因排序，采用引物設計軟件 Primer Premier 5 設計，NF-κB p65上游引物為：TCAATGGCTACACAGGACCA,下游引物為：CACTGTCACCTGGAAGCAGA,OPN上游引物為：AGACCTGACATCCAGTACCCTG，下游引物為：GTGGGTTTCAGCACTCTGGT。RNA 提取：稱取約50 mg內膜組織置于勻漿器中加入 1 ml Trizzol后充分勻漿，將裂解液移入1.5 ml EP 管，4 ℃，12 000 r/min(離心半徑5.5 cm)離心10 min，取上層裂解液加入0.2 ml四氯化碳，冰浴5 min，再次離心后取上層水相加0.5 ml異丙醇，顛倒混勻后冰浴10 min，離心去除上清液，加入1 ml 75%乙醇溶液，4 ℃，7 500 r/min(離心半徑5.5 cm)離心5 min，棄去上清液，RNA自然干燥10 min。RNA 定量：用20 μl無RNA 酶的水溶解RNA，取 2 μl采用750紫外分光光度計測量OD260/OD280確定 RNA 的完整性與純度。反應條件:94 ℃ 預變性 3 min，1個循環，94 ℃ 變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環,72 ℃終反應5 min。

1.6結果判定標準(1)采用OLYMPUS.BX51顯微鏡觀察結果,以胞質中出現黃色或棕黃色顆粒為陽性表達。采用Image-Pro Plus 6.0專業圖像分析軟件對陽性結果進行半定量分析并計算平均積分光密度值(IOD)。(2)BIO-RAD凝膠掃描系統分析攝像，用Roche-Lightcycler 96對產物進行半定量分析,以2-ΔΔCt表示NF-κB p65、OPN mRNA的相對表達量。

2　結果

2.1NF-κB p65主要表達于子宮內膜腺上皮細胞的胞質中，胞核中有少量表達，極少數表達于子宮內膜間質細胞；OPN主要表達于子宮內膜腺上皮細胞的胞質中，少數表達于子宮內膜間質細胞中(見圖1，本文圖1彩圖見本刊官網www.chinagp.net電子期刊相應文章附件)。

2.2EMs在位、異位內膜組NF-κB p65和OPN的表達均高于正常子宮內膜組，EMs異位內膜組的表達高于EMs在位內膜組，差異均有統計學意義(P<0.05，見表1)。3組增生期及分泌期NF-κB p65的表達比較，差異無統計學意義(P>0.05)，EMs在位、異位內膜組分泌期OPN的表達高于增生期，差異有統計學意義(P<0.05，見表2)。

2.3EMs在位、異位內膜組中NF-κB p65與OPN的表達呈正相關(r在位=0.88，P<0.05；r異位=0.78，P<0.05，見圖2)。

2.4NF-κB p65、OPN mRNA在EMs在位內膜組、EMs異位內膜組中的表達高于正常子宮內膜組，EMs異位內膜組高于EMs在位內膜組，差異均有統計學意義(P<0.05，見表3)。

注：A、B、C分別是核轉錄因子κB(NF-κB)p65在正常子宮內膜組、子宮內膜異位癥(EMs)在位內膜組、EMs異位內膜組的表達；D、E、F分別是骨橋蛋白(OPN)在正常子宮內膜組、EMs在位內膜組、EMs異位內膜組的表達

圖13組內膜NF-κB p65及OPN的表達(免疫組化SP法，×400)

Figure 1Expression of NF-κB p65 and OPN in endometrium among three groups

Table 1Comparison of the expression of NF-κB p65 and OPN protein in endometrium among the three groups

組別例數NF-κBp65OPN正常子宮內膜組300.154±0.0740.128±0.047EMs在位內膜組350.460±0.089a0.697±0.089aEMs異位內膜組350.771±0.155ab0.877±0.146abF值240.180444.010P值<0.001<0.001

注：與正常子宮內膜組比較，aP<0.05；與EMs在位內膜組比較，bP<0.05；EMs=子宮內膜異位癥，NF-κB=核轉錄因子κB;OPN=骨橋蛋白

3　討論

本研究通過實驗方法分別檢測NF-κB p65、OPN及其mRNA在正常子宮內膜、EMs在位及異位內膜組織中的表達，并分析二者之間的關系，以期進一步揭示兩者在誘導該病發生過程中發揮的作用。

表2　3組增生期和分泌期NF-κB p65及OPN表達的比較

圖2　EMs在位內膜組、EMs異位內膜組NF-κB p65與OPN表達的相關性

Table 3Comparison of the expression of NF-κB p65 mRNA and OPN mRNA among the three groups

組別例數NF-κBp65mRNAOPNmRNA正常子宮內膜組351.321±0.1010.351±0.282EMs在位內膜組353.438±0.285a2.851±0.252aEMs異位內膜組353.742±0.350ab3.012±0.261abF值853.651107.01P值<0.001<0.001

注：與正常子宮內膜組比較，aP<0.05；與EMs在位內膜組比較，bP<0.05

3.1NF-κB p65與EMs目前，NF-κB p65在醫學各領域中備受矚目，屬于Rel家族中的一個因子，含有轉錄活化區域，可直接刺激轉錄設備而激活轉錄過程，還可抑制細胞凋亡，促進細胞增殖及多種炎性因子的激活[7]。人體中NF-κB存在于胞質中，受到異常刺激后激活MAPK、PI 3-K/AKt通路，進入細胞核中與多種細胞基因啟動子或增強子序列特定位點結合，參與相關基因的轉錄調控及細胞凋亡的調控。已有研究證明NF-κB在多種惡性腫瘤如宮頸癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌等的細胞增殖，抗凋亡、促血管生成及轉移過程中發揮重要作用[8-9]。但 NF-κB通路在EMs的研究甚少,國內孫群燕[10]用子宮內膜移植法建立NF-κB p50基因敲除小鼠EMs動物模型，建模后通過免疫組化檢測發現NF-κB在異位內膜、在位內膜以及陰道中的表達明顯下降，與觀察到的異位病灶變小的結果相吻合，揭示了NF-κB通路在EMs的發病機制中可能發揮作用。本實驗通過免疫組化SP法、RT-PCR法檢測NF-κB p65及其mRNA在EMs中的表達，發現NF-κB p65在EMs在位、異位內膜組中的表達明顯高于正常子宮內膜組，且主要定位于子宮內膜的腺上皮細胞胞質中，極少數表達于間質細胞中，且其在月經周期中的表達與月經周期無關，進一步從蛋白、基因水平證實其與EMs的發病機制可能密切相關。

3.2OPN與EMsOPN是細胞信息傳導通路中一種重要的磷酸化基質蛋白，含有特異的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Glu-Asp,RGD) 序列,這一序列與許多細胞外基質蛋白的黏附序列相同,通過酶切后與其受體整合素avβ3和CD44結合，使多種激酶( PI 3-K、NIK、PLC、PKC 和MAPK) 磷酸化激活,介導細胞侵襲過程、細胞外基質的降解和重塑、細胞遷移、宿主免疫細胞的逃逸和新生血管的形成。國外學者利用OPN基因剔除大鼠及OPN抗體抑制劑研究OPN在EMs中的作用，結果顯示OPN與EMs病灶的大小、體積及數目密切相關[11]。課題組前期實驗也已經證實OPN在大鼠EMs模型中呈高表達且與EMs患者在位內膜腺上皮細胞的侵襲性密切相關[5，12]。本課題分別通過免疫組化SP法、RT-PCR法等實驗方法檢測OPN及其mRNA在EMs患者中的表達發現，OPN及其mRNA在EMs異位內膜組中的表達高于EMs在位內膜組和正常子宮內膜組中的表達，且主要表達于內膜腺上皮細胞胞質中；除此之外，發現OPN在分泌期中的表達明顯高于增生期，說明其與孕酮在體內增高有內在的聯系，與臨床上使用激素類藥物治療EMs的機制相吻合，進一步驗證了OPN可能是導致EMs發生的關鍵因子。

3.4NF-κB p65與OPN在EMs中的關系有研究表明OPN與其受體avβ3或CD44結合后可使與NF-κB結合的抑制劑IkB磷酸化，促使NF-κB p65-50二聚體從胞質進入胞核，調控細胞因子的轉錄及促進尿激酶型纖溶酶原激活物的表達，加快了細胞外基質及基底膜的降解步伐，為異位內膜的黏附、種植、生長提供了有利條件[13-14]。本實驗結果也表明NF-κB p65與OPN在EMs在位、異位內膜組中的表達呈正相關，與上述研究觀點基本相符，進一步說明兩者在EMs的發病機制中相輔相成共同誘導其發生。由此推測，OPN與其受體結合后可能通過激活NF-κB通路而導致EMs。

本課題組期望今后通過特異性OPN siRNA干擾EMs患者在位內膜腺上皮細胞后經Western blotting法、RT-PCR法及Transwell等方法檢測NF-κB p65、OPN及其mRNA的變化進一步證實二者在EMs發病機制中的作用及相關性，為EMs的病因研究提供一種新的思路，為其藥物靶向治療提供一種更可靠的依據。

作者貢獻：白治苗、李望舒負責收集病例并完成相關實驗部分，撰寫論文、成文并對文章負責。姚衛衛進行相關知情同意書資料、處理、收集整理；盧玉鳳進行相關的文獻查閱；楊眉對相關查閱的文獻進行翻譯、分析，提供可靠的數據；哈春芳進行質量控制。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：趙躍翠)

Expression of NF-κB p65 and OPN in Endometriosis and Their Correlations Research

BAIZhi-miao,LIWang-shu,YAOWei-wei,LUYu-feng,YANGMei,HAChun-fang.

DepartmentofObstetricsandGynecology,theSecondHospitalofYulin,Yulin719000;NingxiaMedicalUniversity，Yinchuan750004,China

HAChun-fang，DepartmentofGynecology,GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity;KeyLaboratoryofFertilityPreservationandMaintenanceoftheMinistryofEducation,Yinchuan750004,China;E-mail:hachunfang@163.com

BackgroundThe etiology and pathogenesis of endometriosis (EMs) is still unclear with limited therapeutic measures,which seriously influence the physical and mental health of women.ObjectiveTo investigate the expression of NF-κB p65 and osteopontin (OPN) in EMs tissues and their correlations.Methods35 patients with EMs,who had been implemented operation in Department of Gynaecology and Obstetrics in General Hospital of Ningxia Medical University from January to December 2013,were selected as the case group,of which 17 are in proliferative phase and 18 in secretory phase;30 cases with normal endometrium,who had taken contraceptive operation at the same period and were diagnosed without EMs,were enrolled as a comparison (normal endometrium group),15 cases are in proliferative phase and 15 in secretory phase.Immunohistochemistry SP method and RT-PCR were applied to detect the expression of NF-κB p65,OPN and their mRNA in normal endometrium group,eutopic endometrium and ectopic endometrium groups respectively.ResultsNF-κB p65 and OPN were mainly expressed in the cytoplasm of endometrial glandular epithelial cells and few were expressed in stromal cells.The expression of NF-κB p65 and OPN in EMs eutopic and ectopic endometrium groups of EMs eutopic and ectopic endometrium groups were higher than that in normal endometrium group,their expression in EMs ectopic endometrium groups was higher than that in EMs eutopic endometrium group (P<0.05).There was no significant difference in the expression of NF-κB p65 proteins in proliferative phase and secretory phase within the three groups (P>0.05),the expression of OPN in secretory phase of EMs eutopic and ectopic endometrium groups were higher than that in proliferative phase (P<0.05);the expression of NF-κB p65 and OPN showed a positive correlation in EMs eutopic and EMs ectopic endometrium groups (rb=0.88 andrc=0.78，P<0.05).The relative expression of NF-κB p65,OPN mRNA in EMs eutopic and EMs ectopic endometrium groups was higher than that in normal endometrium group,and their expression in EMs ectopic endometrium group was higher than that in EMs eutopic endometrium group (P<0.05).ConclusionThe expression of NF-κB p65,OPN and their mRNA in eutopic and ectopic endometrial tissues increases obviously and they are positively correlated with each other,which indicates that the mutual activation of them may induce the occurrence and development of EMs.

Endometriosis;NF-kappa B;Osteopontin

國家自然科學基金資助項目(81160078)；2015生殖與遺傳基礎及臨床研究創新團隊開放課題(220/2002080102)

719000陜西省榆林市第二醫院婦產科(白治苗)；寧夏醫科大學(白治苗，李望舒，姚衛衛，盧玉鳳，楊眉)；湖北省襄陽市中心醫院 湖北文理學院附屬醫院婦產科(楊眉)；寧夏醫科大學總醫院婦科，生育力保持重點實驗室(哈春芳)

哈春芳，750004寧夏銀川市，寧夏醫科大學總醫院婦科，生育力保持重點實驗室；E-mail：hachunfang@163.com

R 711.71

ADOI：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.24.009

(投稿日期：2016-04-10；2016-07-10)

【編者按】子宮內膜異位癥可發生于所有育齡期女性，據統計，子宮內膜異位癥在婦科剖宮產手術患者中占15%～30%，在腹腔鏡絕育手術中占2%～43%，在不孕癥患者中占20%～40%，且近年來其發病率呈逐年增長的趨勢，然而發病機制尚不清楚且臨床治療措施有限，患者手術治療后仍存在復發、疼痛、預后欠佳等不良現象。因此，進一步探究子宮內膜異位癥的發生發展機制以尋求更安全、高效的臨床治療方法。為此，本期特邀寧夏醫科大學總醫院婦科主任哈春芳教授組織了有關子宮內膜異位癥方面的“專題研究”，從分子水平探討子宮內膜異位癥的發生發展機制，得出核轉錄因子κB p65、骨橋蛋白、基質金屬蛋白酶9在子宮內膜異位癥患者中表達異常，為推動子宮內膜異位癥的病因治療提供參考。