骨橋蛋白與基質金屬蛋白酶9在子宮內膜異位癥患者內膜中的表達情況及孕激素對其表達的影響

楊 眉，蔣春樊，哈春芳

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·論著·

·專題研究·

骨橋蛋白與基質金屬蛋白酶9在子宮內膜異位癥患者內膜中的表達情況及孕激素對其表達的影響

楊 眉，蔣春樊，哈春芳

目的探究子宮內膜異位癥(EMs)患者內膜中骨橋蛋白(OPN)及基質金屬蛋白酶9(MMP-9)的表達情況及二者的相關性,以及不同劑量孕激素對其表達的影響。方法選取2006—2015年在寧夏醫科大學總醫院住院治療的符合納入標準的EMs患者105例，術前1 d行診刮術獲得在位內膜(EMs在位內膜組)，由卵巢囊腫剝除術或患側附件切除術切除組織獲得異位內膜(EMs異位內膜組)。另選取同期行輸卵管絕育手術的患者90例作為對照，絕育手術前1 d行診刮術獲取子宮內膜(正常子宮內膜組)。采用免疫組化法檢測3組內膜中OPN及MMP-9表達情況，并分析EMs在位內膜組、EMs異位內膜組OPN與MMP-9的相關性。2013年1—3月，從105例患者中隨機選取9例患者的在位內膜組織進行后續試驗，采用反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測不同劑量(0、1、10、100、1 000 nmol/L)孕激素干預后在位內膜腺上皮細胞中OPN、MMP-9 mRNA表達水平。結果免疫組化法染色結果顯示，正常子宮內膜組在位內膜DAB染色后腺上皮細胞呈淡黃色，OPN、MMP-9均主要表達于內膜腺上皮細胞中；EMs在位內膜組DAB染色后腺上皮細胞染色加深，呈棕黃色；EMs異位內膜組腺上皮細胞染色進一步加深，呈棕黑色，OPN和MMP-9主要表達于EMs腺上皮細胞中。EMs異位內膜組OPN、MMP-9表達情況強于EMs在位內膜組、正常子宮內膜組(u值分別為7.553、-6.153、-9.754、-10.240，P<0.001)；EMs在位內膜組OPN、MMP-9表達情況強于正常子宮內膜組(u值分別為7.164，8.816，P<0.001)。Spearman相關分析結果顯示，EMs在位內膜組、EMs異位內膜組中OPN與MMP-9表達水平均呈正相關(rs值分別為0.657、0.745，P<0.05)。0、1、10、100、1 000 nmol/L孕激素分別干預EMs腺上皮細胞后，其OPN及MMP-9表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。結論OPN、MMP-9在EMs患者在位、異位內膜中表達均增強，但不同劑量孕激素對EMs患者在位內膜腺上皮細胞OPN、MMP-9表達水平影響不明顯。

子宮內膜異位癥；骨橋蛋白質；基質金屬蛋白酶9；孕激素類

楊眉，蔣春樊，哈春芳.骨橋蛋白與基質金屬蛋白酶9在子宮內膜異位癥患者內膜中的表達情況及孕激素對其表達的影響[J].中國全科醫學，2016，19(24)：2920-2924.[www.chinagp.net]

YANG M,JIANG C F,HA C F.Expression of osteopontin and matrix metalloproteinase 9 in the endometrium of patients with endometriosis and influence of progesterone on their expression[J].Chinese General Practice，2016，19(24)：2920-2924.

不同個體對子宮內膜異位癥(EMs)的易感性與遺傳、激素水平及環境因素有關[1]，但其具體分子機制尚不明確。骨橋蛋白(OPN)是一種結合糖蛋白型的整聯蛋白，其首先在骨基質中被發現，而后又發現其與腫瘤細胞的黏附、抗凋亡及轉移有關[2]。金屬基質蛋白酶9(MMP-9)與腫瘤發生發展有關。有研究顯示，OPN能夠活化PI 3-K/AKt通路，與avβ3整合素結合，通過一系列分子相互作用，上調尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)，從而活化MMP-9，降解細胞外基質，進而促進腫瘤細胞的轉移[3]。OPN在月經周期中晚分泌期的表達水平較高，而在增生期和早分泌期表達水平相對較低[4]。MMP-9則在月經周期晚分泌期的表達水平較高[5]。EMs患者子宮內膜組織中OPN及其mRNA表達水平及血液中分泌型糖蛋白形式的OPN均較正常人升高[6]。有研究顯示，EMs患者子宮內膜組織中MMP-9的表達水平相對較高[7]。OPN及MMP-9的表達水平隨月經周期變化,且均在EMs患者子宮內膜組織中高表達，從而推論兩者之間可能存在關聯，其表達水平可能受雌、孕激素調節。本課題組前期已研究了雌激素對OPN及MMP-9表達水平的影響[8]，本研究進一步分析了孕激素對OPN及MMP-9的表達水平的影響，現報道如下。

1　材料與方法

1.1納入與排除標準納入標準：(1)Ⅳ期EMs患者(依據美國生育協會1985年“修正子宮內膜異位癥分期法”[9])；(2)處于月經分泌期；(3)因卵巢巧克力囊腫行卵巢囊腫剝除術或患側附件切除術。排除標準：(1)合并重大內科疾病；(2)術前6個月曾接受激素治療者。

1.2組織來源選取2006—2015年在寧夏醫科大學總醫院住院治療的符合納入標準的EMs患者105例，術前1 d行診刮術(術前診刮術是為行內膜活檢、排除內膜病變決定手術范圍)獲得在位內膜(EMs在位內膜組)，由卵巢囊腫剝除術或患側附件切除術切除組織獲得異位內膜(EMs異位內膜組)。樣本組織經兩位病理學主任醫師進行HE染色切片復驗，均再次確診為EMs。另選取同期行輸卵管絕育手術的患者90例作為正常子宮內膜組，均處于月經分泌期，術中排除合并EMs者，絕育手術前1 d行診刮術獲取子宮內膜。

1.3免疫組化法獲取樣本組織后立即置入4%中性甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片4 μm，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫去二甲苯，3%過氧化氫溶液去除內源性過氧化物酶，高壓熱修復抗原后山羊血清封閉。小鼠抗人OPN及MMP-9單克隆抗體(美國Abcam公司，均為1∶100稀釋)，4 ℃孵育過夜。采用北京中杉金橋生物技術有限公司兩步法廣譜羊抗小鼠二抗試劑盒(PV-9000，含A液和B液)放大信號，A液和B液分別孵育30 min。二氨基聯苯胺(DAB)顯色(顯色時間根據顯微鏡下觀察所見進行調控，待陽性信號明顯而背景信號未顯現時即停止顯色)；蘇木精復染，中性樹膠封固。

1.4OPN及MMP-9表達情況判定標準每張切片選取10個不重疊的高倍視野(×400)進行觀察，OPN、MMP-9免疫組化染色陽性的標準為細胞膜或細胞質中有棕黃色顆粒，采用半定量積分法進行結果判定，分別對染色強度和鏡下陽性細胞表達率給予評分：(1)陽性染色強度：未染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕黑色為3分；(2)陽性細胞表達率：高倍視野下陽性細胞數占所有細胞數的比例即為表達率，表達率<5%為0分，表達率5%～24%為1分，表達率25%～50%為2分，表達率>50%為3分。兩者評分之和作為綜合評分：總分0分記為陰性(-)，總分1～2分記為弱陽性(+)，總分3～4分記為陽性(++)，總分5～6分記為強陽性(+++)。

1.5細胞培養及藥物干預2013年1—3月，從105例患者中隨機選取9例患者的在位內膜組織進行后續試驗。取出低溫保存的在位內膜組織，采用無菌無酚紅Hanks平衡鹽溶液(HBSS)清洗3次，剪成約1 mm3大小，10 ml HBSS(3×)溶解的膠原酶Type Ⅳ在37 ℃消化10 min；500 r/min離心(離心半徑為16 cm)1 min，懸浮的上皮細胞和間質細胞經離心后分離，去除上清液(主要含懸浮的間質細胞)，加入含10%胎牛血清的無酚紅的DMEM/Ham′s F12培養液(含鏈霉素100 μg/ml、青霉素100 U/ml、氟康唑2 μg/ml)培養腺上皮細胞，分裝在多個直徑為10 cm的培養皿中。隔日換液直至細胞達到60%融合時，吸去培養液，將細胞置于無胎牛血清的DMEM/Ham′s F12培養液中12 h。將不同培養皿中腺上皮細胞的培養液更換為含不同劑量(0、1、10、100、1000 nmol/L)孕激素的DMEM/Ham′s F12培養液，并加入活性炭，進一步去除胎牛血清，培養24 h。1.6反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測腺上皮細胞中OPN、MMP-9 mRNA表達水平Trizol裂解細胞,采用紫外分光光度計測量其在260 nm和280 nm處的OD值,并計算RNA的純度和濃度。反轉錄反應體系配置：總體積20 μl，包括上一步變性處理的RNA溶液12 μl、dNTP混合物 (各10 mM)2 μl、RNA酶抑制劑(10 U/μl)1 μl、5×RT Buffer 4 μl、ReverTra Ace 1 μl。反轉錄后進行PCR，PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，OPN上游引物為5′-ACAGCCGTGGGAAGGACAGTTA-3′，下游引物為5′-CCTGACTATCAATCACATCGGAATG-3′；MMP-9上游引物為5′-AGTCCACCCTTGTGCTCTTCCC-3′，下游引物為5′-TCTGCCACCCGAGTGTAACCAT-3；β-actin上游引物為5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′，下游引物為5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′。 擴增條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，變性、退火、延伸共循環40次。結束前72 ℃再延伸7 min，4 ℃保存。采用2-ΔΔCt法計算OPN、MMP-9 mRNA表達水平。

2　結果

2.1免疫組化染色結果正常子宮內膜組DAB染色后腺上皮細胞呈淡黃色，OPN、MMP-9均主要表達于內膜腺上皮細胞中。EMs在位內膜組DAB染色后腺上皮細胞染色加深，呈棕黃色；EMs異位內膜組腺上皮細胞染色進一步加深，呈棕黑色，OPN和MMP-9主要表達于EMs腺上皮細胞中(見圖1，本文圖1彩圖見本刊官網www.chinagp.net電子期刊相應文章附件)。

2.2OPN、MMP-9在EMs異位內膜組、在位內膜及正常子宮內膜組中表達情況正常子宮內膜組、EMs在位內膜組、EMs異位內膜組OPN、MMP-9表達情況比較，差異有統計學意義(P<0.05)；EMs異位內膜組OPN、MMP-9表達情況強于EMs在位內膜組、正常子宮內膜組，差異有統計學意義(u值分別為7.553、-6.153、-9.754、-10.240，P<0.001)；EMs在位內膜組OPN、MMP-9表達情況強于正常子宮內膜組，差異有統計學意義(u值分別為7.164、8.816，P<0.001，見表1)。

2.3EMs在位內膜組、EMs異位內膜組OPN與MMP-9的相關性分析Spearman相關分析結果顯示，EMs在位內膜組、EMs異位內膜組OPN與MMP-9表達水平均呈正相關(rs值分別為0.657、0.745，P值分別為0.013、0.018)。

2.4不同劑量孕激素干預EMs腺上皮細胞后OPN、MMP-9 mRNA表達水平比較0、1、10、100、1 000 nmol/L孕激素干預EMs腺上皮細胞后，其OPN、MMP-9 mRNA表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05，見表2)。

注：A為正常子宮內膜組，B為EMs在位內膜組，C為EMs異位內膜組

圖1免疫組化法染色結果

Figure 1Result of immunohistochemical staining

表13組OPN、MMP-6表達情況比較(例)

Table 1Comparsion of expression status of OPN and MMP-9 among the three groups

組別例數 OPN- + +++++ MMP-9- + +++++正常子宮內膜組9027362704527180EMs在位內膜組10561860213216615EMs異位內膜組105061584392469H值12.3514.28P值0.0040.003

注：EMs=子宮內膜異位癥，OPN=骨橋蛋白，MMP-9=基質金屬蛋白酶9

Table 2Comparsion of the expression levels of OPN and MMP-9 mRNA after intervention of different doses of progesterone in EMs glandular epithelial cells

孕激素(nmol/L)OPNmRNAMMP-9mRNA01.001.0011.05±0.180.93±0.11101.08±0.220.97±0.191001.11±0.120.92±0.2910001.03±0.330.95±0.16F值8.627.38P值0.1010.182

3　討論

EMs是一種婦科常見病，且發病機制復雜，可能與甾體激素類藥物、免疫分子、遺傳物質、環境因素等多種生物活性因素相關[1,10]。子宮內膜的分離、接觸、黏附、侵襲等一系列生物行為均在早期EMs的發生發展過程中發揮作用[11]。部分相關研究顯示，與惡性腫瘤病理過程密切相關的蛋白，同樣與EMs密切相關，如OPN及MMP-9等[12-13]。為進一步闡明EMs的發病機制，本研究選取了EMs患者的在位、異位內膜，并以正常子宮內膜作為對照，用免疫組化法檢測內膜中OPN及MMP-9表達情況，以明確OPN和MMP-9是否在EMs患者的內膜中表達增強，因本課題組前期研究已明確雌激素對OPN及MMP-9表達情況的影響[8]，故本研究擬觀察孕激素對OPN及MMP-9表達情況的影響，旨在為EMs的臨床治療提供分子理論基礎。

本研究結果顯示，EMs異位內膜組OPN、MMP-9表達情況強于EMs在位內膜組、正常子宮內膜組，且EMs在位內膜組OPN、MMP-9表達情況強于正常子宮內膜組；表明OPN及MMP-9在EMs患者在位、異位內膜中表達均強于非EMs患者。進一步分析OPN與MMP-9的關系顯示，EMs患者異位內膜、在位內膜中OPN與MMP-9均呈正相關，與相關研究結果一致[14]。RANGASWAMI等[15]研究結果顯示，在惡性腫瘤的發病過程中，OPN與MMP-9可促進腫瘤細胞的侵襲、轉移及腫瘤血管生成，MMP-9 活化有賴于 OPN的表達增強，而MMP-9的活化加速了腫瘤的擴散。OPN能通過激活細胞內一系列分子進行信號傳導，最終活化MMP-9,進而溶解細胞外基質,導致細胞的異地黏附、侵襲與轉移[16-17]。

本研究采用不同劑量孕激素干預EMs腺上皮細胞發現，0、1、10、100、1 000 nmol/L孕激素干預EMs腺上皮細胞后，OPN及MMP-9表達水平間無差異。孕激素調控OPN的分子機制復雜，JOHNSON等[18]采用孕激素喂養卵巢切除后的母羊發現，子宮內膜間質細胞上的孕激素受體上調，而腺上皮細胞中卻缺乏孕激素受體，接著用受體拮抗劑ZK137,316喂養已經進食孕激素的卵巢切除后的母羊發現，OPN的表達水平明顯下降，推測孕激素對OPN的調控機制復雜，其中包括腺上皮細胞孕激素受體下調，而孕激素對OPN的調控需有間質細胞來源的旁分泌生長因子參與方可發揮作用。而孕激素調控MMPs方面的研究較多，M?NCKEDIECK等[19]研究結果顯示，在人子宮內膜中，孕激素通過上調特定的腫瘤生長因子來調控細胞間的相互作用及組織的周期性變化，其中起主要作用的是轉化生長因子β(TGF-β)。TGF-β受體則主要分布在子宮內膜間質細胞上，但本研究采用的是原代培養的子宮內膜腺上皮細胞進行體外試驗，排除了子宮內膜間質細胞，故推測孕激素對EMs的抑制作用可能需要子宮內膜間質細胞的存在。

綜上所述，OPN、MMP-9在EMs患者在位、異位內膜中表達增強，但不同劑量孕激素對EMs患者在位內膜腺上皮細胞OPN、MMP-9表達水平影響不明顯。本研究選取子宮內膜腺上皮細胞進行離體試驗，排除了子宮內膜間質細胞，故結果存在一定局限性。而人體內子宮內膜腺上皮細胞與間質細胞間是否存在復雜的相互關聯與作用，本課題組擬進一步探究。

作者貢獻：楊眉進行試驗設計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；楊眉、蔣春樊進行試驗實施、評估、資料收集；哈春芳進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：毛亞敏)

Expression of Osteopontin and Matrix Metalloproteinase 9 in the Endometrium of Patients With Endometriosis and Influence of Progesterone on Their Expression

YANGMei,JIANGChun-fan,HAChun-fang.

DepartmentofObstetricsandGynecology,XiangyangCentralHospital,AffiliatedHospitalofHubeiUniversityofArtsandScience,Xiangyang441021;NingxiaMedicalUntversity,Yinchuan750004,China

HAChun-fang,DepartmentofGynecology,GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity;KeyLaboratoryofFertilityPreservationandMaintenanceoftheMinistryofEducation,Yinchuan750004,China;E-mail:hachunfang@163.com

ObjectiveTo investigate the expression and correlation of osteopontin (OPN) and matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) in the endometrium of patients with endometriosis (EMs),and the influence of different doses of progesterone on their expression.Methods105 patients with EMs,who received treatment in General Hospital of Ningxia Medical University from 2006 to 2015 and met the inclusion criteria,were selected in the study.The eutopic endometrium was got 1 d before surgery by curettage (EMs eutopic endometrium group).The ectopic endometrium was got through oophorocystectomy or tissue adnexectomy (EMs ectopic endometrium group).In addition,90 patients who had underwent sterilization operation of fallopian tube and the endometrium was got through curettage 1 d before sterilization operation (normal endometrium group).Immunohistochemistry was used to detect the expression status of OPN and MMP-9 in the endometrium among the three groups,and the correlation of OPN and MMP-9 between EMs eutopic endometrium group and EMs ectopic endometrium group were also analyzed.The eutopic endometrium of 9 patients were randomly selected from the 105 patients to carry out follow-up experiment,inverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was applied to detect the expression levels of OPN and MMP-9 in the endometrial epithelial cells after progesterone intervention at different doses (0,1,10,100,1 000 nmol/L).ResultsImmunohistochemistry results showed that the color of endometrium epithelial cells in eutopic endometrium after DAB staining in normal endometrium group was light yellow,and OPN and MMP-9 were mainly expressed in endometrium epithelial cells.The staining of endometrium epithelial cells in EMs eutopic endometrium group darkened and presented brown.The staining of endometrium epithelial cells in EMs ectopic endometrium group darkened further and showed brownish black,and OPN and MMP-9 were mainly expressed in EMs epithelial cells.The expression levels of OPN and MMP-9 in EMs ectopic endometrium group were stronger than those in EMs eutopic endometrium group and normal endometrium group (u=7.553,-6.153,-9.754,-10.240,P<0.001);the expression levels of OPN and MMP-9 in EMs eutopic endometrium group was stronger than those in normal endometrium group (u=7.164,8.816,P<0.001).The result of Spearman correlation analysis was shown as follows:the expression levels of OPN and MMP-9 between eutopic and ectopic endometrium group were positively correlated with each other (rs=0.657,0.745,P<0.05).After intervention of progesterone at different doses of 0 nmol/L,1 nmol/L,10 nmol/L,100 nmol/L,and 1 000 nmol/L,the expression levels of OPN and MMP-9 were not significantly different (P>0.05).ConclusionEnhanced expression of OPN and MMP-9 in eutopic and ectopic endmetrium of patients with EMs was presented,but different doses of progesterone has no significant influence on the expression level of OPN and MMP-9 in the eutopic endometrium epithelial cells of EMs patients.

Endometriosis；Osteopontin；Matrix metalloproteinase 9；Progestins

國家自然科學基金資助項目(81160078)

441021 湖北省襄陽市中心醫院 湖北文理學院附屬醫院婦產科(楊眉)，病理科(蔣春樊)；寧夏醫科大學(楊眉)；寧夏醫科大學總醫院婦科，生育力保持重點實驗室(哈春芳)

哈春芳，750004寧夏銀川市，寧夏醫科大學總醫院婦科，生育力保持重點實驗室；E-mail：hachunfang@163.com

R 711.71

ADOI：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.24.010

2016-03-05；

2016-07-12)