米非司酮對子宮內膜異位癥子宮內膜腺上皮細胞骨橋蛋白和基質金屬蛋白酶9表達的影響

楊 眉，蔣春樊，哈春芳

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·論著·

·專題研究·

米非司酮對子宮內膜異位癥子宮內膜腺上皮細胞骨橋蛋白和基質金屬蛋白酶9表達的影響

楊 眉，蔣春樊，哈春芳

背景目前子宮內膜異位癥的治療方法仍比較有限，而米非司酮在臨床上可用于治療子宮內膜異位癥，但其具體機制尚未明確。目的探討米非司酮對子宮內膜異位癥子宮內膜腺上皮細胞中骨橋蛋白(OPN)、基質金屬蛋白酶9(MMP-9)表達的影響。方法選取2014年8月—2015年3月寧夏醫科大學總醫院婦科因卵巢巧克力囊腫行卵巢囊腫剝除術或患側附件切除術的子宮內膜異位癥患者21例為研究對象。按照術前是否接受米非司酮治療將其分為米非司酮組(11例)和對照組(10例)。獲取所有患者在位、異位內膜組織，采用免疫組化法檢測其中OPN、MMP-9表達水平；取對照組患者在位子宮內膜組織，培養子宮內膜腺上皮細胞，以不同劑量(0、0.1、1.0、10.0 mmol/L)米非司酮進行干預，采用反轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)法檢測子宮內膜腺上皮細胞中OPN、MMP-9表達水平。結果米非司酮組在位、異位內膜組織中OPN、MMP-9表達水平均低于對照組(P<0.05)。0.1 mmol/L、1.0 mmol/L米非司酮干預子宮內膜腺上皮細胞中OPN、MMP-9 mRNA表達水平低于0 mmol/L(P<0.05)；1.0 mmol/L、10.0 mmol/L米非司酮干預子宮內膜腺上皮細胞中OPN、MMP-9 mRNA表達水平高于0.1 mmol/L(P<0.05)；10.0 mmol/L米非司酮干預子宮內膜腺上皮細胞中OPN、MMP-9 mRNA表達水平高于1.0 mmol/L(P<0.05)。結論米非司酮可明顯下調子宮內膜異位癥子宮內膜中OPN、MMP-9表達水平，從而抑制子宮內膜的侵襲、黏附以及種植性轉移。

子宮內膜異位癥；米非司酮；骨橋蛋白質；基質金屬蛋白酶9

楊眉，蔣春樊，哈春芳.米非司酮對子宮內膜異位癥子宮內膜腺上皮細胞骨橋蛋白和基質金屬蛋白酶9表達的影響[J].中國全科醫學，2016，19(24)：2925-2929.[www.chinagp.net]

YANG M,JIANG C F,HA C F.Influence of mifepristone on the expression of osteopontin and matrix metalloproteinase 9 in the endometrium epithelial cells of patients with endometriosis[J].Chinese General Practice，2016，19(24)：2925-2929.

子宮內膜異位癥是一種婦科常見疾病，以子宮內膜的異位黏附、侵襲為特點[1-2]。本課題組前期研究證明，骨橋蛋白(OPN)及基質金屬蛋白酶9(MMP-9)在子宮內膜異位癥的發病過程中起關鍵性作用[3-4]。臨床上米非司酮可以用于治療子宮內膜異位癥，但其具體機制尚未明確[5-6]。為此，本研究分析米非司酮對子宮內膜異位癥子宮內膜腺上皮細胞中OPN、MMP-9表達的影響，以期進一步明確米非司酮治療子宮內膜異位癥的分子機制。

1　材料與方法

1.1納入與排除標準納入標準：(1)為Ⅳ期子宮內膜異位癥；(2)處于月經分泌期。排除標準：合并重大內科疾病及有激素治療史患者。

1.2研究對象選取2014年8月—2015年3月寧夏醫科大學總醫院婦科因卵巢巧克力囊腫行巧克力囊腫剝除術或患側附件切除術的子宮內膜異位癥患者21例為研究對象，年齡21～49歲，平均年齡(34.2±5.4)歲；術前給予米非司酮治療(10 mg/d，1次/d，療程3個月)11例(米非司酮組)，未進行藥物治療10例(對照組)。子宮內膜異位癥診斷經2位病理科醫師復診明確。本研究經寧夏醫科大學總醫院倫理委員會審批通過，患者均簽署知情同意書。

1.3研究方法

1.3.1獲取內膜組織術中行診刮術獲取在位、異位內膜組織。

1.3.2免疫組化法檢測在位、異位內膜組織中OPN、MMP-9表達水平收集在位、異位內膜組織，用4%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋后切片，二甲苯脫蠟，嚴格按照試劑說明書操作。加入小鼠抗人OPN及MMP-9單克隆抗體(美國Abcam公司，均為1∶100稀釋)，4 ℃孵育過夜。DAB顯色，顯微鏡下等同條件下觀察并拍照。應用Image-Pro Rlus 6.0圖像分析系統對圖像進

本研究價值：

目前子宮內膜異位癥的治療方法仍比較有限，米非司酮在臨床上可用來治療子宮內膜異位癥，但其具體機制尚未明確。本研究證明，米非司酮可下調子宮內膜異位癥子宮內膜中OPN、MMP-9表達水平，從而抑制子宮內膜的侵襲、黏附以及種植性轉移。這有助于推動藥物治療子宮內膜異位癥的新進展，為后續對子宮內膜異位癥從機制上進行有效的藥物干預、指導臨床治療和隨訪提供依據。

行分析，每張切片選取5個高倍鏡(×400)視野，分別計算每高倍鏡視野下的OPN、MMP-9的IOD值，即OPN、MMP-9表達水平。

1.3.3子宮內膜腺上皮細胞培養及藥物干預取對照組患者在位子宮內膜組織，低溫條件下迅速送往實驗室，剪成1 cm3小塊，膠原酶消化，采用差速離心法去除間質細胞，將純度95%以上的子宮內膜腺上皮細胞進行培養。子宮內膜腺上皮細胞達到60%融合時，去除培養液，將細胞置于無血清的培養液中12 h。將培養液換為含不同劑量(0、0.1、1.0、10.0 mmol/L)米非司酮(美國Sigma公司)的DMEM/Ham′s F12培養液48 h，并加入活性炭，進一步去除胎牛血清。

1.3.4反轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)法檢測子宮內膜腺上皮細胞中OPN、MMP-9表達水平Trizol裂解細胞，檢測并計算出RNA的濃度和純度，反轉錄后進行PCR，條件為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環，72 ℃再延伸7 min，4 ℃保存。OPN上游引物：5′-ACAGCCGTGGGAAGGACAGTTA-3′，下游引物：5′-CCTGACTATCAATCACATCGGAATG-3′；MMP-9上游引物：5′-AGTCCACCCTTGTGCTCTTCCC-3′，下游引物：5′-TCTGCCACCCGAGTGTAACCAT-3′；β-actin上游引物：5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′，下游引物：5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′。采用2-ΔΔCt法計算出OPN、MMP-9 mRNA表達水平[3]。

2　結果

2.1米非司酮組與對照組在位、異位內膜組織中OPN、MMP-9表達水平比較米非司酮組在位、異位內膜組織中OPN、MMP-9表達水平均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05，見表1、圖1～4)。

Table 1Comparison of expression levels of OPN and MMP-9 in the eutopic and ectopic endometrium of patients in mifepristone group and control group

組別例數在位內膜組織OPN MMP-9異位內膜組織OPN MMP-9對照組103.31±1.314.81±1.535.13±1.475.50±2.15米非司酮組111.25±0.712.89±1.382.09±1.283.27±2.04t值3.012.653.103.40P值0.0180.0210.0120.005

注：OPN=骨橋蛋白，MMP-9=基質金屬蛋白酶9

注：A1～A3為對照組，B1～B3為米非司酮組

圖1米非司酮組與對照組在位內膜組織中OPN的表達

Figure 1Expression of OPN in the eutopic endometrium of patients in mifepristone group and control group

注：A1～A3為對照組，B1～B3為米非司酮組

圖2米非司酮組與對照組在位內膜組織中MMP-9的表達

Figure 2Expression of MMP-9 in the eutopic endometrium of patients in mifepristone group and control group

注：A1～A3為對照組，B1～B3為米非司酮組

圖3米非司酮組與對照組異位內膜組織中OPN的表達

Figure 3Expression of OPN in the ectopic endometrium of patients in mifepristone group and control group

注：A1～A3為對照組，B1～B3為米非司酮組

圖4米非司酮組與對照組異位內膜組織中MMP-9的表達

Figure 4Expression of MMP-9 in the ectopic endometrium of patients in mifepristone group and control group

2.2不同劑量米非司酮干預子宮內膜腺上皮細胞中OPN、MMP-9 mRNA表達水平比較不同劑量米非司酮干預子宮內膜腺上皮細胞中OPN、MMP-9 mRNA表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)。0.1 mmol/L、1.0 mmol/L米非司酮干預子宮內膜腺上皮細胞中OPN、MMP-9 mRNA表達水平低于0 mmol/L，差異有統計學意義(P<0.05)；1.0 mmol/L、10.0 mmol/L米非司酮干預子宮內膜腺上皮細胞中OPN、MMP-9 mRNA表達水平高于0.1 mmol/L，差異有統計學意義(P<0.05)；10.0 mmol/L米非司酮干預子宮內膜腺上皮細胞中OPN、MMP-9 mRNA表達水平高于1.0 mmol/L，差異有統計學意義(P<0.05，見表2)。

Table 2Comparison of mRNA expression levels of OPN and MMP-9 in endometrium epithelial cells that intervened with mifepristone at the different doses

米非司酮(mmol/L)OPNmRNAMMP-9mRNA01.001.000.10.56±0.13a0.48±0.16a1.00.70±0.19ab0.75±0.21ab10.00.96±0.25bc1.05±0.26bcF值66.3042.75P值<0.001<0.001

注：與0 mmol/L比較，aP<0.05；與0.1 mmol/L比較，bP<0.05；與1.0 mmol/L比較，cP<0.05

3　討論

目前關于子宮內膜異位癥的研究多集中在內膜異位黏附、種植的具體機制，但仍不十分清楚[7]。眾多研究顯示，OPN在子宮內膜異位癥的發病過程中可誘導細胞的侵襲、黏附、抗凋亡能力增強，并促進血管生成[3]。而MMP-9是分子量最大的一種明膠酶，能降解細胞外基質，促進血管內皮細胞出芽并表達于細胞膜表面，促使細胞向周圍浸潤、侵襲和轉移[3,8]。目前對子宮內膜異位癥的藥物治療主要是甾體激素類藥物，如米非司酮，但其具體機制尚未明確[5-6,9-10]。本研究組前期論證了雌激素調節OPN/MMP-9通路導致子宮內膜異位癥腺上皮細胞侵襲性增強，可能是子宮內膜異位癥發病的重要因素[3]。米非司酮是一種抗孕酮和抗糖皮質激素的甾體類藥物，那么米非司酮對子宮內膜異位癥腺上皮細胞中OPN、MMP-9的表達起到什么樣的作用呢？

本研究結果顯示，米非司酮組在位、異位內膜組織中OPN、MMP-9表達水平均低于對照組，0.1 mmol/L、1.0 mmol/L米非司酮干預子宮內膜腺上皮細胞中OPN、MMP-9 mRNA表達水平低于0 mmol/L，1.0 mmol/L、10.0 mmol/L米非司酮干預子宮內膜腺上皮細胞中OPN、MMP-9 mRNA表達水平高于0.1 mmol/L，10.0 mmol/L米非司酮干預子宮內膜腺上皮細胞中OPN、MMP-9 mRNA表達水平高于1.0 mmol/L，提示米非司酮可抑制子宮內膜異位癥腺上皮細胞OPN、MMP-9表達，其最佳干預劑量為0.1 mmol/L。米非司酮為19-去甲類固醇、炔諾酮的衍生物，通過與其受體競爭性結合而發揮作用，在臨床上已廣泛用于抗早孕、中孕引產、軟化宮頸等，亦可用于子宮內膜異位癥、子宮腺疾病的治療[11-13]。本研究組前期的動物實驗發現，米非司酮可降低子宮內膜異位癥模型大鼠在位、異位內膜中OPN、MMP-9表達水平[14]。而其他學者的研究顯示，米非司酮可競爭性結合下丘腦、垂體組織中的孕激素受體，使卵巢功能受抑制，出現閉經現象，進一步導致異位的子宮內膜萎縮[15]。米非司酮通過直接抑制雌、孕激素受體的合成從而阻斷內膜對雌、孕激素的反應性，使異位內膜萎縮[16]。米非司酮可通過抑制異位內膜細胞白介素6、纖維母細胞生長因子、血管內皮生長因子的合成，提升異位內膜中人第10號染色體缺失的磷酸酶(PTEN)、B淋巴細胞瘤-2基因、Fas表達水平，抑制異位內膜的生長并促進其凋亡[17-18]。米非司酮可通過作用于下丘腦、垂體、子宮內膜等多水平抑制在位、異位內膜對雌激素的反應，從而下調在位、異位內膜中OPN、MMP-9表達水平。

本研究從組織及細胞層面驗證了米非司酮對子宮內膜異位癥子宮內膜OPN、MMP-9表達的抑制作用，但其對子宮內膜異位癥的治療機制可能是多層面的，OPN、MMP-9表達的下調只是多種機制之一。另外，米非司酮可抑制雌、孕激素受體的合成，其是否造成子宮內膜異位癥腺上皮細胞雌、孕激素受體比例變化，其與子宮內膜異位癥腺上皮細胞受體結合的具體機制如何，均不明確，有待進一步研究。

綜上所述，米非司酮可明顯下調子宮內膜異位癥子宮內膜中OPN、MMP-9表達水平，從而抑制子宮內膜的侵襲、黏附以及種植性轉移，這可能也是米非司酮治療子宮內膜異位癥的重要機制。

作者貢獻：楊眉進行試驗設計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；楊眉、蔣春樊進行試驗實施、評估、資料收集；哈春芳進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。

[1]CROSIGNANI P,OLIVE D,BERGQVIST A,et al.Advaces in the management of endometriosis:an update for clinicians[J].Hum Reprod Update,2006,12(2):179-189.

[2]WIMBERGER P,GRüBLING N,RIEHN A,et al.Endometriosis-a chameleon:patients′ perception of clinical symptoms,treatment strategies and their impact on symptoms[J].Geburtshilfe Frauenheilkd,2014,74(10):940-946.

[3]楊眉,蔣春樊,哈春芳,等.雌激素介導骨橋蛋白/基質金屬蛋白酶9通路調節子宮內膜異位癥腺上皮細胞侵襲性的研究[J].中國全科醫學,2016,19(5):554-559.

YANG M,JIANG C F,HA C F,et al.Up-regulation of matrix metalloproteinase-9 via activation of the osteopontin induced by estrogen correlates with migration of endometrial epithelial cells in endometriosis[J].Chinese General Practice,2016,19(5):554-559.

[4]哈春芳,肖成明,劉培淑.OPN與MMP-9在大鼠子宮內膜異位癥中的表達及意義[J].寧夏醫學雜志,2011,33(7):585-587.

HA C F,XIAO C M,LIU P S,et al.The expression and significance of OPN and MMP-9 in endometriosis rats[J].Ningxia Medical Journal,2011,33(7):585-587.

[5]LI A,FELIX J C,YANG W,et al.Effect of mifepristone on endometrial matrix metalloproteinase expression and leukocyte abundance in new medroxyprogesterone acetate users[J].Contraception,2007,76(1):57-65.

[6]JAIN J K,LI A,YANG W,et al.Effects of mifepristone on proliferation and apoptosis of human endometrium in new users of medroxyprogesterone acetate[J].Hum Reprod,2006,21(3):798-809.

[7]BENAGIANO G,BROSENS I,LIPPI D.The history of endometriosis[J].Gynecol Obstet Invest,2014,78(1):1-9.

[8]XIAO Y,LI T,XIA E,et al.Expression of integrin β3 and osteopontin in the eutopic endometrium of adenomyosis during the implantation window[J].Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol,2013,170(2):419-422.

[9]LI X,BAO Y,FANG P,et al.Effect of mifepristone on COX-2 both in eutopic and ectopic endometrium in mouse endometriotic model[J].Arch Gynecol Obstet,2012,286(4):939-946.

[10]HELMESTAM M,LINDGREN K E,STAVREUS-EVERS A,et al.Mifepristone-exposured human endometrial endothelial cells in vitro[J].Reprod Sci,2014,21(3):408-414.

[11]CHEN Y,WANG W,ZHUANG Y,et al.Effects of low-dose mifepristone administration in two different 14-day regimens on the menstrual cycle and endometrial development:a randomized controlled trial[J].Contraception,2011,84(1):64-70.

[12]周應芳,守隆夫,鄭淑蓉,等.米非司酮對垂體移植誘發小鼠子宮腺肌癥的影響[J].北京醫科大學學報,2000,32(6):500-502,507.

ZHOU Y F,SHOU L F,ZHENG S R,et al.Treatment of experimentally-induced uterine adenomyosis with mifepristone (RU486)[J].Journal of Beijing Medical University,2000,32(6):500-502,507.

[13]PEI K,YU C,SHI X,et al.The effects of mifepristone on the expressions of osteopontin,interleukin-6 and leukemia inhibitory factor in the villi of early pregnant women[J].Contraception,2010,82(4):379-384.

[14]肖成明,張紅,曹丹,等.米非司酮對子宮內膜異位癥大鼠內膜OPN及MMP-9表達的影響[J].寧夏醫科大學學報,2012,34(1):17-21,封4.

XIAO C M,ZHANG H,CAO D,et al.Effect of mifepristone on OPN and MMP-9 in endometriosis models of rats[J].Journal of Ningxia Medical University,2012,34(1):17-21,back cover.

[16]TANG OS,HO P C.Clinical applications of mifepristone[J].Gynecol Endocrinol,2006,22(12):655-659.

[17]NARVEKAR N,CRITCHLEY H O,CHENG L,et al.Mifepristone-induced amenorrhoea is associated with an increase in microvessel density and glucocorticoid receptor and a decrease in stromal vascular endothelial growth factor[J].Hum Reprod,2006,21(9):2312-2318.

[18]陳必良,馬佳佳,馬向東,等.米非司酮對子宮內膜異位癥細胞PTEN基因表達與凋亡的影響[J].現代婦產科進展,2005,14(2):138-141.

CHEN B L,MA J J,MA X D,et al.Effects of mifepristone on the expression of PTEN gene and apoptosis of ectopic endometrium cells[J].Progress in Obstetrics and Gynecology,2005,14(2):138-141.

(本文編輯：崔麗紅)

Influence of Mifepristone on the Expression of Osteopontin and Matrix Metalloproteinase 9 in the Endometrium Epithelial Cells of Patients With Endometriosis

YANGMei,JIANGChun-fan,HAChun-fang.

DepartmentofObstetricsandGynecology,XiangyangCentralHospital,AffiliatedHospitalofHubeiUniversityofArtsandScience,Xiangyang441021;NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,ChinaCorrespondingauthor:HAChun-fang，DepartmentofGynecology,GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity;KeyLaboratoryofFertilityPreservationandMaintenanceoftheMinistryofEducation,Yinchuan750004,China;E-mail:hachunfang@163.com

BackgroundThe therapeutic method towards endometriosis is still in limitation,and mifepristone can be used to treat endometriosis in clinic,but its specific mechanism still remains unclear.ObjectiveTo investigate the influence of miferpristone on the expression of osteopontin (OPN) and matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) in the endometrium epithelial cells of patients with endometriosis.Methods21 patients with endometriosis,who suffered ovarian cyst enucleation or adnexectomy due to ovarian chocolate cyst in Department of Gynecology in General Hospital of Ningxia Medical University from August 2014 to March 2015,were recruited in the study.They were divided into mifepristone group (11 cases) and control group (10 cases) based on whether they had undergone mifepristone therapy.The eutopic and ectopic endometrium of all these patients were obtained through surgery,and immunohistochemistry method was used to detect the expression level of OPN and MMP-9;the culture of endometrium epithelial cells in the eutopic endometrium of patients in control group were performed with the intervention of different doses of mifepristone (0,0.1,1.0,10.0 mmol/L),and inverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) method was used to investigate the expression level of OPN and MMP-9 in the endometrial epithelial cells.ResultsThe expression levels of OPN and MMP-9 in mifepristone group both in eutopic and ectopic endometrium were lower than those in control group (P<0.05).The mRNA expression levels of OPN and MMP-9 in endometrium epithelial cells after the intervention of mifepristone at a dose of 0.1 and 1.0 mmol/L were lower than those at 0 mmol/L (P<0.05);the mRNA expression levels of OPN and MMP-9 in endometrium epithelial cells after the intervention of mifepristone at a dose of 1.0 and 10.0 mmol/L were higher than those at 0.1 mmol/L (P<0.05);the mRNA expression levels of OPN and MMP-9 in endometrium epithelial cells after the intervention of mifepristone at the dose of 10.0 mmol/L were higher than those at 1.0 mmol/L (P<0.05).ConclusionMifepristone can obviously lower the expression levels of OPN and MMP-9 in endometrium of endometriosis,and thus inhibit the invasion,adhesion and implantation metastasis of endometrium.

Endometriosis;Mifepristone;Osteopontin;Matrix metalloproteinase 9

國家自然科學基金資助項目(81160078)

441021 湖北省襄陽市中心醫院 湖北文理學院附屬醫院婦產科(楊眉)，病理科(蔣春樊)；寧夏醫科大學(楊眉)；寧夏醫科大學總醫院婦科，生育力保持重點實驗室(哈春芳)

哈春芳，750004 寧夏銀川市，寧夏醫科大學總醫院婦科，生育力保持重點實驗室；E-mail：hachunfang@163.com

R 711.71

ADOI：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.24.011

2016-03-05；

2016-07-05)