六君子湯提取物抑制食管癌Ec9706細(xì)胞增殖及其對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3信號(hào)通路的影響

崔姍姍，高小玲，王慧慧，吳耀松，尹素改，陳玉龍

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·論著·

·中醫(yī)·中西醫(yī)結(jié)合研究·

六君子湯提取物抑制食管癌Ec9706細(xì)胞增殖及其對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3信號(hào)通路的影響

崔姍姍，高小玲，王慧慧，吳耀松，尹素改，陳玉龍

目的研究六君子湯提取物對(duì)食管癌Ec9706細(xì)胞增殖的抑制作用及其對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3(STAT3)信號(hào)通路的影響。方法于2013—2015年，采用70%乙醇提取六君子湯，正丁醇、乙酸乙酯及水提法過夜萃取，用MTT法觀察提取物對(duì)Ec9706細(xì)胞活性的影響，選取最優(yōu)提取部位，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法觀察六君子湯乙酸乙酯部位對(duì)Ec9706細(xì)胞分泌相關(guān)細(xì)胞因子〔包括白介素6(IL-6)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)〕的影響，采用Western-blotting法測(cè)定六君子湯乙酸乙酯部位對(duì)食管癌Ec9706細(xì)胞STAT3和磷酸化STAT3(p-STAT3)蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果對(duì)照組、六君子湯70%乙醇部位、六君子湯正丁醇部位、六君子湯水提部位Ec9706細(xì)胞OD值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=448.90，P<0.01)。藥物處理組對(duì)Ec9706細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效果依次為：六君子湯正丁醇部位>六君子湯70%乙醇部位>六君子湯水提部位。六君子湯乙酸乙酯部位Ec9706細(xì)胞OD值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=19.78，P<0.001)。在250 μg/ml時(shí)，六君子湯70%乙醇部位、六君子湯正丁醇部位、六君子湯水提部位對(duì)Ec9706細(xì)胞的抑制率分別為7.31%、23.24%、-25.07%，而在200 μg/ml時(shí)，六君子湯乙酸乙酯部位對(duì)Ec9706細(xì)胞的抑制率為77.03%，抑制效果明顯優(yōu)于其他部位，故篩選的有效部位為六君子湯乙酸乙酯部位。應(yīng)用概率法計(jì)算六君子湯乙酸乙酯部位抑制率IC35、IC50、IC70，代表低、中、高濃度，相應(yīng)的濃度為63.08、93.00、133.70 μg/ml。對(duì)照組、六君子湯低濃度組、六君子湯中濃度組IL-6、TGF-β1、VEGF水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；其中六君子湯低濃度組、六君子湯中濃度組IL-6、TGF-β1、VEGF水平低于對(duì)照組(P<0.05)。對(duì)照組、六君子湯低濃度組、六君子湯中濃度組STAT3、p-STAT3表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中六君子湯低濃度組、六君子湯中濃度組STAT3、p-STAT3表達(dá)水平低于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論六君子湯不同試劑提取物中，乙酸乙酯提取物抑制食管癌細(xì)胞增殖作用最強(qiáng)，其抑制作用可能與調(diào)節(jié)STAT3信號(hào)通路有關(guān)。

食管腫瘤；六君子湯；提取物；乙酸乙酯；STAT3

崔姍姍，高小玲，王慧慧，等.六君子湯提取物抑制食管癌Ec9706細(xì)胞增殖及其對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3信號(hào)通路的影響[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2016，19(24)：2948-2952.[www.chinagp.net]

CUI S S，GAO X L，WANG H H，et al.Inhibition of extract of Liujunzi decoction on Ec9706 cells growth of esophageal carcinoma and its effects on signaling pathway of signal transducers and activations of transcripition 3[J].Chinese General Practice，2016，19(24)：2948-2952.

食管癌(esophageal carcinoma)是人類常見的惡性腫瘤之一，居全球癌癥所致死因的第6位[1-2]，5年生存率不足20%[3-4]。中醫(yī)藥學(xué)對(duì)食管癌具有深刻的認(rèn)識(shí)和悠久的診療歷史，健脾和胃法是食管癌中醫(yī)臨床辨治的基本法則，六君子湯是健脾和胃的代表方劑。六君子湯水煎劑和乙醇提取物可直接抑制食管癌Ec9706細(xì)胞的體外增殖，下調(diào)腫瘤細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和白介素6(IL-6)的分泌，從而阻止腫瘤細(xì)胞引起的血管生成、內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及遷移和小管形成[5-6]，但具體分子作用機(jī)制仍需探究。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3(STAT3)作為一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的信號(hào)，與食管癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[7-8]。為了研究六君子湯對(duì)食管癌細(xì)胞增殖的抑制作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用乙醇、正丁醇、乙酸乙酯及水提法提取六君子湯，觀察這4種試劑的提取物對(duì)食管癌細(xì)胞增殖的抑制作用，并研究其對(duì)STAT3信號(hào)通路的影響。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)時(shí)間與實(shí)驗(yàn)材料2013—2015年，人食管鱗癌細(xì)胞株Ec9706，由河南中醫(yī)學(xué)院分子生物中心提供，本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥品六君子湯的藥物組成：人參3.0 g、生白術(shù)4.5 g、茯苓3.0 g、生甘草3.0 g、陳皮3.0 g、清半夏4.5 g。上述藥物均購(gòu)于北京同仁堂鄭州藥店有限責(zé)任公司，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)苗艷艷副研究員鑒定皆為正品。

1.1.3主要試劑95%乙醇分析純(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，乙酸乙酯分析純、正丁醇分析純(天津富宇精細(xì)化工有限公司)，胰蛋白酶消化液(Solarbio公司，批號(hào)：20130424)，胎牛血清(Gibco公司，批號(hào)：1133067)，RPMI Medium1640(Solarbio公司，批號(hào)：20130416)，四甲基偶氮唑鹽(MTT，Solarbio公司，批號(hào)：M8180)，二甲基亞砜(DMSO，Amresco，批號(hào)：302A0315)，IL-6、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)、VEGF酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)試劑盒(Boster公司，批號(hào)：13110971028、2271072108、25310561028)，凝膠配制試劑盒(Boster公司，批號(hào)：09K03A38)，磷酸酶抑制劑(Thermo公司，批號(hào)：OD182286)，苯甲基磺酰氟(PMSF)(Boster公司，批號(hào)：09F05A78)，RIPA裂解液(Boster公司，批號(hào)：09F12B05)，兔抗人STAT3(proteintech公司，批號(hào)：10253-2-AP)，磷酸化STAT3(p-STAT3)(Tyr-705)(abcam，批號(hào)：ab76315)，兔抗人β-tublin(santacruz公司，批號(hào)：L1713)，山羊抗兔IgG(proteintech公司，批號(hào)：SA00001-2)，ECL Plus超敏發(fā)光液A和B(Solarbio公司，批號(hào)：20141118)。

1.1.4主要儀器CO2培養(yǎng)箱(德國(guó)Eppendorf公司)，超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，熒光倒置相差顯微鏡(德國(guó)Laica公司)，ELx-800型酶標(biāo)儀(BIO-TEK公司)，RE-3000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，垂直電泳槽、濕轉(zhuǎn)儀(上海天能儀器公司)，全能型凝膠成像分析儀(Bio-Rad公司)，低溫高速冷凍離心機(jī)(HITACHICR 226)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1藥物提取

1.2.1.1乙醇回流提取稱取六君子湯100副藥量(2 100 g)，粉碎機(jī)制成粗粉后混勻各藥。以M(藥物重量)∶V(70%乙醇體積)=1∶8混勻，置于加熱套內(nèi)，連接回流冷凝裝置和真空泵。設(shè)置加熱溫度為50 ℃，待70%乙醇浸液沸騰后開始計(jì)時(shí)，1.5 h后，關(guān)閉電源，過濾藥液，室溫放置。將濾得藥渣重復(fù)上述操作，進(jìn)行第2次醇提，時(shí)間為1 h，過濾后與第1次醇提液混合，靜置過夜，取上清液，藥渣棄之。

1.2.1.2萃取回收乙醇提液置無醇味后濃縮藥液，濃縮至體積大約與生藥總重量相當(dāng)，即每毫升含1 g生藥。量取1/20體積濃縮液作為70%乙醇部位，余下濃縮液(19/20體積)與乙酸乙酯體積比為2∶1進(jìn)行萃取，第1次萃取前需靜置過夜。萃取6次，每隔2 h將分液漏斗上下顛倒7～8次。合并6次萃取液，負(fù)壓抽濾，收集濾液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，減壓回收乙酸乙酯后，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿，置58 ℃恒溫水浴鍋上繼續(xù)濃縮、低溫真空干燥，刮藥、稱重。收集最后一次乙酸乙酯萃取時(shí)下層水相液體，揮發(fā)殘留乙酸乙酯，進(jìn)行水飽和正丁醇萃取，操作同前(2∶1萃取)。收集最后一次正丁醇萃取時(shí)下層水相，即水部位。最終獲得各部位提取物。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)Ec9706細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2～3 d換液1次，3～4 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3MTT檢測(cè)六君子湯提取物對(duì)人食管鱗癌Ec9706細(xì)胞增殖的影響取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Ec9706細(xì)胞，按104/孔的細(xì)胞密度接種于96孔板中，將96孔板置于CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，棄去培養(yǎng)液。70%乙醇部位、正丁醇部位、水提部位分別設(shè)置相同的濃度梯度(125、250、500、1 000 μg/ml)；乙酸乙酯部位設(shè)置6個(gè)濃度梯度(6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00 μg/ml)；設(shè)置含相同體積分?jǐn)?shù)DMSO的RPMI 1640培養(yǎng)基作為對(duì)照組。細(xì)胞加提取物培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入0.5 g/L MTT液100 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去上液，每孔加入DMSO 150 μl，在搖床上輕輕震蕩15 min，待孔內(nèi)紫色結(jié)晶完全溶解后用酶標(biāo)儀在570/630 nm處測(cè)各孔吸光度(OD值)，計(jì)算各用藥組的平均抑制率，細(xì)胞抑制率=(對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次，取平均值。

1.4ELISA試劑盒檢測(cè)六君子湯乙酸乙酯提取物對(duì)Ec9706細(xì)胞分泌相關(guān)細(xì)胞因子的影響取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Ec9706細(xì)胞，按104/孔的細(xì)胞密度接種于96孔板中，將96孔板置于CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，棄去培養(yǎng)液，加入IC35濃度63.08 μg/ml、IC50濃度93.00 μg/ml乙酸乙酯提取物，培養(yǎng)48 h后，收集各瓶細(xì)胞上清液，以1 500 r/min離心5 min，離心半徑18 cm，重復(fù)離心1次，將上清液轉(zhuǎn)移至對(duì)應(yīng)離心管中，共5管(低、高濃度各2管，對(duì)照1管)，標(biāo)記，-20 ℃保存。采用ELISA試劑盒檢測(cè)Ec9706細(xì)胞IL-6、TGF-β1、VEGF水平，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5Western-blotting法測(cè)定細(xì)胞中STAT3和p-STAT3蛋白的表達(dá)細(xì)胞加乙酸乙酯提取物培養(yǎng)48 h后，終止培養(yǎng)，收集各皿上清液，標(biāo)記各管，以1 500 r/min離心5 min，離心半徑18 cm，棄上清液；皿內(nèi)加入2 ml 4 ℃ 1×PBS，用細(xì)胞刮刀緩慢勻速的刮下貼壁細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，測(cè)定蛋白濃度；配制10%分離膠，上樣蛋白量20 μg/孔，濃縮膠和分離膠所用電壓和時(shí)間分別設(shè)定為80 V/30 min和120 V/60 min；轉(zhuǎn)膜、雜交、將NC膜放置于保鮮膜上，將ECL化學(xué)發(fā)光顯色液A和B按1∶1配置后均勻加到膜上。用全能型凝膠成像分析系統(tǒng)拍照并分析目標(biāo)條帶的光密度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2　結(jié)果

2.1六君子湯提取物影響人食管鱗癌Ec9706細(xì)胞生長(zhǎng)有效部位的篩選對(duì)照組、六君子湯70%乙醇部位、六君子湯正丁醇部位、六君子湯水提部位Ec9706細(xì)胞OD值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=448.90，P<0.01)；其中六君子湯水提部位各濃度對(duì)Ec9706細(xì)胞生長(zhǎng)有促進(jìn)作用；六君子湯70%乙醇部位、六君子湯正丁醇部位均存在最高濃度(1 000 μg/ml)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)而中低濃度促進(jìn)或抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的特點(diǎn)。整體藥物處理組對(duì)Ec9706細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效果依次為：六君子湯正丁醇部位>六君子湯70%乙醇部位>六君子湯水提部位(見表1)。六君子湯乙酸乙酯部位Ec9706細(xì)胞OD值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=19.78，P<0.001，見表2)。在250 μg/ml時(shí)，六君子湯70%乙醇部位、六君子湯正丁醇部位、六君子湯水部位對(duì)Ec9706細(xì)胞的抑制率較弱，分別為7.31%、23.24%、-25.07%，而在200 μg/ml時(shí)，六君子湯乙酸乙酯部位對(duì)Ec9706細(xì)胞的抑制率為77.03%，抑制效果明顯優(yōu)于六君子湯70%乙醇部位、六君子湯正丁醇部位、六君子湯水部位，故重點(diǎn)研究六君子湯乙酸乙酯部位。

Table 1Dose-effect relationship of the inhibition of Liujunzi decoction extract on the proliferation of Ec9706 cells

組別濃度(μg/ml)OD值抑制率(%)對(duì)照組-1.532±0.011-六君子湯70%乙醇部位10001.369±0.06310.645001.531±0.1110.072501.644±0.0757.311251.742±0.067-13.73六君子湯正丁醇部位10000.483±0.064a68.495001.204±0.059a21.392501.176±0.162a23.241251.584±0.170-3.37六君子湯水提部位10001.552±0.037-1.285001.822±0.057a-18.912501.916±0.173a-25.071251.917±0.259a-25.13

注：-為無此數(shù)值；與對(duì)照組比較，aP<0.05；抑制率為負(fù)值時(shí)代表藥物促進(jìn)了Ec9706細(xì)胞生長(zhǎng)

2.2六君子湯乙酸乙酯部位對(duì)人食管癌Ec9706細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響應(yīng)用概率法計(jì)算六君子湯乙酸乙酯部位抑制率IC35、IC50、IC70，代表低、中、高濃度，記為六君子湯：IC35%=63.08 μg/ml，IC50%=93.00 μg/ml，IC70%=133.70 μg/ml。對(duì)照組、六君子湯低濃度組、六君子湯中濃度組IL-6、TGF-β1、VEGF水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；其中六君子湯低濃度組、六君子湯中濃度組IL-6、TGF-β1、VEGF水平低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表3)。2.3六君子湯乙酸乙酯部位對(duì)人食管癌Ec9706細(xì)胞STAT3和p-STAT3表達(dá)的影響對(duì)照組、六君子湯低濃度組、六君子湯中濃度組STAT3、p-STAT3表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中六君子湯低濃度組、六君子湯中濃度組STAT3、p-STAT3表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表4、圖1)。

Table 2Dose-effect relationship of the inhibition of the ethyl acetate part of Liujunzi decoction on the proliferation of Ec9706 cells

組別濃度(μg/ml)OD值抑制率(%)對(duì)照組-1.273±0.150-六君子湯乙酸乙酯部位200.000.292±0.012a77.03100.000.142±0.020a88.8750.000.801±0.268a37.0425.001.071±0.23215.8212.501.199±0.1355.816.251.230±0.0223.51

注：-為無此數(shù)值；與對(duì)照組比較，aP<0.05

Table 3Comparison of the levels of Liujunzi decoction on Ec9706 cell secreting cytokines in control group,low concentration and medium concentration groups

組別IL-6TGF-β1VEGF對(duì)照組125.05±2.17655.41±253.83820.01±126.51六君子湯低濃度組100.77±21.16a38.46± 5.99a574.94±43.56a六君子湯中濃度組73.99±7.30a37.07± 4.57a598.28±80.55aF值15.4823.678.99P值<0.01<0.01<0.01

注：與對(duì)照組比較，aP<0.01；IL-6=白介素6，TGF-β1=轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1，VEGF=血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

Table 4Comparison of the expression levels of p-STAT3 and STAT3 in Ec9706 cells of the control group,low concentration and medium concentration groups of Liujunzi decoction

組別STAT3p-STAT3對(duì)照組1.22±0.271.19±0.18六君子湯低濃度組0.82±0.15a0.19±0.12a六君子湯中濃度組0.68±0.09a0.22±0.05aF值3.242.25P值0.04<0.01

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；STAT3=信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3，p-STAT3=磷酸化STAT3

注：STAT3=信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3，p-STAT3=磷酸化STAT3

圖1對(duì)照組、六君子湯低濃度組和六君子湯中濃度組對(duì)Ec9706細(xì)胞STAT3和p-STAT3表達(dá)水平

Figure 1Expression levels of p-STAT3 and STAT3 in Ec9706 cells of the control group,the low concentration and medium concentration groups of Liujunzi decoction

3　討論

中藥復(fù)方是中醫(yī)臨床普遍應(yīng)用的治療方式。目前，對(duì)中藥復(fù)方的研究已不局限于水煎劑，在傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論和現(xiàn)代科學(xué)理論與技術(shù)的結(jié)合下，研究復(fù)方有效部位群，不僅保留了原中藥性味功能，而且通過研究復(fù)方制劑藥理、質(zhì)量可控的化學(xué)成分體系、規(guī)范制劑工藝等，保證了用藥穩(wěn)定性和安全性[9]。中藥復(fù)方的有效部位是指具有相近化學(xué)性質(zhì)的一類化合物(藥效成分群)[10]。“有效浸出物─有效部位(群)─有效成分”這種研究思路為現(xiàn)階段大多數(shù)科學(xué)工作者所采取。

本實(shí)驗(yàn)中，將六君子湯用70%乙醇加熱回流提取后進(jìn)行乙酸乙酯和正丁醇萃取，首次將各部位作用于Ec9706細(xì)胞，用MTT法對(duì)六君子湯提取物不同濃度培養(yǎng)的Ec9706細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測(cè)，初步篩選出乙酸乙酯部位作為本實(shí)驗(yàn)的有效部位。結(jié)果顯示不同濃度的乙酸乙酯部位提取物均不同程度地抑制Ec9706細(xì)胞增殖，且濃度梯度低于70%乙醇部位、正丁醇部位和水提部位。乙酸乙酯可提取出極性較小的游離生物堿、有機(jī)酸、黃酮及香豆素等；正丁醇可提出皂苷等極性較大物質(zhì)；乙醇可提出苷類、生物堿或有機(jī)酸鹽類；水可提取出糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、無機(jī)鹽類等水溶性成分。六君子湯乙酸乙酯部位可完全溶解于DMSO，但在工作液配制過程中，RPMI 1640溶液中卻出現(xiàn)了不溶物，因而實(shí)際發(fā)揮作用的成分可能含量更少。

研究表明，腫瘤細(xì)胞在發(fā)生發(fā)展、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過程中可通過自分泌-旁分泌形式產(chǎn)生一系列細(xì)胞因子，如VEGF、白介素(IL)-10、IL-6、前列腺素E2(PGE2)、TGF-β等，參與腫瘤細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制對(duì)抗機(jī)體的免疫反應(yīng)[11]。本實(shí)驗(yàn)選取六君子湯乙酸乙酯部位對(duì)Ec9706細(xì)胞抑制率分別為35%和50%時(shí)相應(yīng)的濃度，作為中、低濃度組，應(yīng)用ELISA技術(shù)檢測(cè)上清液中IL-6、TGF-β1和VEGF水平。結(jié)果顯示，六君子湯乙酸乙酯部位可降低IL-6、TGF-β1和VEGF的表達(dá)，從而抑制Ec9706細(xì)胞增殖。

STAT3在組織中分布較廣，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)化、細(xì)胞免疫等重要的生理病理過程[10]。STAT3和p-STAT3與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)。在食管癌組織中，STAT3陽(yáng)性率明顯高于癌旁組織，與組織分化程度呈負(fù)相關(guān)[12]。STAT3蛋白過度表達(dá)及磷酸化可推動(dòng)食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展及惡性演進(jìn)[13-15]。IL-6家族的共同受體-gp130參與了STAT3的活化，JENKINS等[15]研究發(fā)現(xiàn)，STAT3的缺失突變，基本能完全逆轉(zhuǎn)gp130突變小鼠導(dǎo)致的脾腫大、肝急性相反應(yīng)、淋巴細(xì)胞異常活化及自發(fā)的胃竇癌。TGF-β1能夠促進(jìn)HepG2細(xì)胞發(fā)生EMT，并激活JAK-STAT3通路，而VEGF是STAT3的靶基因[16-18]。本研究結(jié)果顯示，六君子湯乙酸乙酯部位STAT3、pSTAT3表達(dá)水平低于對(duì)照組，說明六君子湯乙酸乙酯部位可以降低STAT3活性。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，六君子湯乙酸乙酯部位作用下的Ec9706細(xì)胞表達(dá)STAT3和p-STAT3水平均明顯降低，說明STAT3的活化被阻斷，能有效抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡，使其不能發(fā)揮惡性作用。IL-6、TGF-β1、VEGF含量均降低，說明六君子湯乙酸乙酯部位既能降低STAT3上游分子IL-6、TGF-β1分泌，又能降低STAT3表達(dá)和活性，從而降低其下游分子VEGF表達(dá)。由此通過干擾STAT3信號(hào)通路中相關(guān)分子起到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。

作者貢獻(xiàn)：崔姍姍進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；高小玲、王慧慧、吳耀松、尹素改進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施、評(píng)估、資料收集；陳玉龍進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：賈萌萌)

Inhibition of Extract of Liujunzi Decoction on Ec9706 Cells Growth of Esophageal Carcinoma and Its Effects on Signaling Pathway of Signal Transducers and Activations of Transcripition 3

CUIShan-shan，GAOXiao-ling，WANGHui-hui，WUYao-song，YINSu-gai，CHENYu-long.

He′nanUniversityofChineseMedicine，Zhengzhou450046，China

CHENYu-long，He′nanUniversityofChineseMedicine，Zhengzhou450046，China；E-mail：cyl72621@126.com

ObjectiveTo observe the inhibition of extract of Liujunzi decoction on esophageal carcinoma cells Ec9706 growth and the effects on signaling pathway of signal transducers and activations of transcripition 3(STAT3).MethodsFrom 2013 to 2015，Liujunzi decoction was extracted by 70% ethanol，overnight extraction was made by normal butanol，ethyl acetate and water extraction.MTT method was applied to observe the influence of the extracts on the activity of Ec9706 cells.The optimal extracting parts，and enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)was used to observe the effects of ethyl acetate extract in Liujunzi decoction on the related cytokines〔including interleukin-6(IL-6)，transforming growth factor-β1(TGF-β1)，vascular endothelial growth factor(VEGF)〕 secreted by Ec9706 cells.Western-blotting method was adopted to test the effects of ethyl acetate extract in Liujunzi decoction on protein expression of esophageal carcinoma cells Ec9706 STAT3 and phosphorylation STAT3(p-STAT3).ResultsThere was significant difference in OD value of Ec9706 cells among the control group，70% ethanol parts，normal butanol parts，and water-extraction parts of Liujunzi decoction(F=448.90，P<0.01).The inhibition effects of Ec9706 cell growth in all medication groups were shown as follows：normal butanol parts of Liujunzi decoction>70% ethanol parts of Liujunzi decoction>water-extraction part of Liujunzi decoction.There was significant difference in OD value of Ec9706 cells in ethyl acetate parts of Liujunzi decoction(F=19.78，P<0.001).When the concentration was 250 μg/ml，the inhibition ratio of 70% ethanol parts，normal butanol parts，and water-extraction parts of Liujunzi decoction on Ec9706 were 7.31%，23.24%，and-25.07% respectively，while the concentration was 200 μg/ml，the inhibition rate of the ethyl acetate extract of Liujunzi decoction on Ec9706 cells was 77.03%，showing a inhibitory effect that was significantly better than the other parts，so the filtered effective part was ethyl acetate fraction of Liujunzi decoction.The inhibition rates IC35，IC50，IC70of ethyl acetate part of Liujunzi decoction calculated by probabilistic method represented low，medium and high concentrations respectively，and the corresponding concentration were 63.08，93.00 and 133.70 μg/ml.There was significant difference in the levels of IL-6，TGF-β1，and VEGF among the control group，low concentration and medium concentration of Liujunzi decoction groups(P<0.01)；the levels of IL-6，TGF-β1，and VEGF in low concentration and medium concentration of Liujunzi decoction groups were lower than those in control group(P<0.05).The expression levels of STAT3 and p-STAT3 in control group and low concentration and medium concentration of Liujunzi decoction groups were significantly different(P<0.05)；the expression levels of STAT3 and p-STAT3 in the low concentrations and medium concentration of Liujunzi decoction groups were lower than those in the control group(P<0.05).ConclusionAmong the extracts of different reagents in Liujunzi decoction，the ethyl acetate extraction has the best inhibitory effect on the proliferation of esophageal carcinoma cells，and the inhibition effect is probably related to the adjusting of STAT3 signaling pathway.

Esophageal neoplasms；Liujunzi decoction；Extracts；Ethyl acetate；STAT3

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81173177)；河南省教育廳自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(15B360003)

450046 河南省鄭州市，河南中醫(yī)藥大學(xué)

陳玉龍，450046 河南省鄭州市，河南中醫(yī)學(xué)藥大學(xué)；E-mail：cyl72621@126.com

R 735.1

ADOI：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.24.016

2016-01-03；

2016-06-12)