含人LINGO-1慢病毒干擾載體的構建與鑒定

索 磊，楊印祥，欒 佐

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·論著·

·方法學研究·

含人LINGO-1慢病毒干擾載體的構建與鑒定

索 磊，楊印祥，欒 佐

目的體外構建含人LINGO-1慢病毒干擾載體，并測定其對靶基因LINGO-1的干擾效應。方法2015年3—11月，根據GenBank數據庫中報道的人LINGO-1基因序列，設計合成針對人LINGO-1短發夾RNA(LINGO-1 shRNA)干擾序列，并將其克隆至重組質粒載體，測序驗證后在293T細胞內包裝慢病毒并測定病毒滴度。將慢病毒載體分為目標基因干擾載體組(實驗組)和錯配序列干擾載體組(對照組)，并轉染至人膠質細胞瘤細胞U251，熒光顯微鏡下觀察其感染效率,并采用免疫熒光染色、實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qPCR)法檢測LINGO-1 mRNA表達水平，采用Western blotting法檢測LINGO-1表達水平。結果成功構建兩組慢病毒干擾載體，經過包裝分別得到滴度為2×108TU/ml和4×108TU/ml的病毒原液。病毒載體感染人膠質細胞瘤細胞U251后，實驗組和對照組載體轉染效率分別為96.6%、95.2%。免疫熒光染色顯示，人膠質細胞瘤細胞U251高表達LINGO-1，經慢病毒載體轉染后，實驗組免疫熒光呈現減弱現象。實驗組LINGO-1 mRNA表達水平(0.09±0.01)較對照組的(1.00±0.00)降低(t=12.87，P<0.01)，實驗組LINGO-1 mRNA相對表達抑制率為91.0%。實驗組LINGO-1表達水平(0.28±0.02)較對照組的(1.00±0.00)降低(t=-8.13,P<0.01)。結論本研究成功構建了含人LINGO-1 shRNA干擾載體，并證實了干擾載體對靶基因有較好的干擾效果，為研究LINGO-1在軸突再生中的作用奠定了基礎。

慢病毒屬；RNA干擾；LINGO-1

索磊，楊印祥，欒佐.含人LINGO-1慢病毒干擾載體的構建與鑒定[J].中國全科醫學，2016，19(24)：2962-2966.[www.chinagp.net]

SUO L,YANG Y X,LUAN Z.Construction and identification of lentiviral interference vector that including human LINGO-1[J].Chinese General Practice，2016，19(24)：2962-2966.

中樞神經系統損傷后如何有效地促進神經元的軸突再生、突觸形成，已經成為當前神經再生領域研究的熱點，近年來研究發現，LINGO-1在多種中樞神經系統損傷動物模型中表達明顯升高，其可能在神經再生過程中發揮了重要的負調控作用[1-2]；而RNA干擾(RNA inference,RNAi) 作為一種新興基因治療手段,能夠特異性抑制目的基因的表達，為進一步研究LINGO-1在調控神經元增殖和分化的發生、發展中的功能機制提供了新的研究方法[3-4]。國內關于LINGO-1基因的研究主要集中在動物源細胞實驗研究[5]。本實驗設計構建了針對人LINGO-1短發夾RNA(LINGO-1 shRNA)的慢病毒載體，并檢測其對人膠質細胞瘤細胞U251 LINGO-1基因的干擾效率，為后續探究人LINGO-1拮抗性實驗研究奠定基礎。

1　材料與方法

1.1主要材料人膠質細胞瘤細胞U251、慢病毒干擾載體〔pGCSIL-綠色熒光蛋白(GFP)質粒〕及慢病毒包裝系統均由北京溯源精微科技有限公司提供；其他主要實驗材料包括質粒抽提試劑盒(Omega公司)，AgeⅠ、EcoRⅠ內切酶及T4 DNA連接酶(NEB公司)，瓊脂糖(上海賽百盛基因技術有限公司)，DMEM培養基及高糖DMEM培養基(Gibco公司)，β甘油磷酸鈉、二磷酸維生素C、地塞米松(Sigma公司)，胎牛血清(HyCione公司)，Trizol試劑(Invitrogen公司)，反轉錄試劑盒、聚合酶鏈式反應(PCR)試劑盒(Sigma公司)及LINGO-1一抗和二抗(Abcam公司)。

1.2方法

1.2.1細胞的培養2015年3—11月，人膠質細胞瘤細胞U251使用含10%胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培養基，在37 ℃、5% CO2及飽和濕度的條件下培養，貼壁生長，3～4 d傳代一次。

1.2.2含人LINGO-1 shRNA慢病毒載體構建根據GenBank數據庫中報道的人LINGO-1基因序列(NM_001301186.1)，設計、合成LINGO-1 shRNA序列以及無靶向隨機打散序列(LINGO-ctl)，LINGO-1上游引物為5′-CCGGGCAAGGAGTTCAAGGACTTCCCTCGAGGGAAGTCCTT

GAACTCCTTGCTTTTTG-3′，下游引物為5′-AATTCAAAAAG

CAAGGAGTTCAAGGACTTCCCTCGAGGGAAGTCCTTGAACTCC

TTGC-3′；LINGO-ctl上游引物為5′-CCGGGCGAGAAGTT

CATCGTTATCCCTCGAGGGATAACGATGAACTTCTCGCTTTTTG

-3′，下游引物為5′-AATTCAAAAAGCGAGAAGTTCATCGTT

ATCCCTCGAGGGATAACGATGAACTTCTCGC-3′。采用限制性內切酶AgeⅠ和EcoRⅠ對兩對載體框架及慢病毒載體pGCSIL-GFP進行雙酶切(37 ℃，過夜),酶切后將干擾載體框架與干擾載體進行連接(16 ℃，過夜),形成重組干擾載體pGCSIL-GFP-LINGO-1。

1.2.3重組干擾載體的轉化、PCR鑒定及測序取2 μl連接產物加入200 μl大腸埃希菌感受態細胞DH5a，冰浴30 min，42 ℃水浴90 s，快速冰浴2 min，加入800 μl SOC培養液混勻，37 ℃搖床振蕩培養45 min，取150 μl已轉化的大腸埃希菌感受態細胞DH5a，均勻涂布于含氨芐霉素(Amp)抗性(100 μg/ml)的LB瓊脂培養平板，37 ℃培養16 h。然后進行陽性克隆的PCR鑒定,挑選陽性單克隆菌液送公司測序(上海美季生物技術有限公司進行ABI3733型測序儀測序分析)。

1.2.4病毒包裝及病毒滴度測定將轉染混合物(稀釋后的DNA與轉染試劑混合)滴加到293T細胞培養液中，搖勻，于細胞培養箱中培養。轉染后24 h，采用熒光顯微鏡觀察含標簽熒光(GFP/RFP)細胞的數量，判定轉染效率，確定轉染成功后(GFP熒光細胞比例≥90.0%)，進行收毒操作，收集含重組慢病毒的細胞上清液，過濾、濃縮，置-80 ℃保存備用。采用逐孔倍比稀釋法(10倍)，將病毒原液感染293T細胞后,進行病毒滴度測定。細胞轉染72 h后在熒光顯微鏡下觀察含有目的病毒標記的細胞數(GFP)，計數病毒滴度。

1.2.5慢病毒載體對LINGO-1基因表達干擾效率的檢測人膠質細胞瘤細胞U251接種于48孔板中，2×104個細胞/孔，接種24 h后進行慢病毒轉染；實驗分為兩組：目標基因干擾載體組(實驗組)和錯配序列干擾載體組(對照組)；轉染用重組病毒液感染復數(MOI)為100。轉染后12 h更換培養基,繼續培養。轉染3 d后應用熒光顯微鏡測定各組細胞的載體轉染效率,載體轉染效率(%)=(GFP陽性細胞數/所測細胞總數)×100%；若GFP陽性細胞數比例大于95.0%，則繼續培養3 d后，收集細胞分別行免疫熒光染色、實時熒光定量PCR(qPCR)、Western blotting法檢測。

1.2.6qPCR法檢測LINGO-1 mRNA表達水平收集人膠質細胞瘤細胞U251轉入無RNA酶的PCR管中，加入1 ml Trizol試劑，冰上反應5 min后置于-80 ℃冰箱備用；經RNA反轉錄得到cDNA，SYBRGreenⅠ法進行qPCR。LINGO-1上游引物為5′-TCTCCTACAACCCCATCAGC-3′，下游引物為5′-TTGCCAGAGACATTGAGCAC-3′；hACTB上游引物為5′-TGCGCAGAAAACAAGATGAG-3′，下游引物為5′-CACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′；PCR反應條件： 95 ℃預變性5 min；95 ℃變性15 s，55 ℃復性15 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環；75 ℃退火10 min。置于4 ℃保存備用。擴增產物上樣電泳，凝膠成像系統對條帶進行掃描分析。采用2-ΔΔCt方法分析基因相對表達量。實驗重復3次。

1.2.7Western blotting法檢測LINGO-1表達水平貼壁人膠質細胞瘤細胞U251，洗滌后，加入適量RIPA裂解液(約細胞體積6倍)，裂解5～10 min，轉至1.5 ml EP中，孵育1.5 h充分裂解后，12 000×g離心10 min，取上清液，即為蛋白提取物。各組樣品，取上清液測定并記錄蛋白濃度后置于-80 ℃冰箱凍存。定量蛋白樣品采用10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳，100 V電壓轉膜。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加Anti-LINGO-1一抗(1∶1 000)4 ℃孵育12 h后，辣根過氧化物酶(HRP)標記的對應二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h，ECL發光顯影，定影。運用Image J軟件分析目的條帶灰度值(β-actin標準內參對照)，計算LINGO-1相對值表達量。實驗重復3次。

2　結果

2.1重組干擾載體的轉化、PCR鑒定及測序重組干擾載體轉化大腸埃希菌感受態細胞DH5a后,陽性克隆PCR擴增,其產物經瓊脂糖凝膠電泳測定,表達特異性條帶 (見圖1)。上述結果說明,合成的干擾載體框架被成功連接到慢病毒載體中。質粒測序結果表明,重組載體序列與合成的干擾載體框架完全一致(見圖2，本文彩圖見本刊官網www.chinagp.net電子期刊相應文章附件),可進一步說明重組干擾載體構建是成功的。

注：shRNA=短發夾RNA

圖1重組干擾載體的PCR鑒定

Figure 1PCR identification of recombinant virus vectors

圖2　LINGO-1-shRNA質粒測序結果

2.2病毒包裝及病毒滴度測定質粒載體轉染293T細胞24 h后，熒光顯微鏡下觀察含標簽熒光(GFP/RFP)細胞的數量，經計算轉染效率高達95.0%以上(見圖3)。收集病毒原液后,經逐孔稀釋法滴度測定,重組慢病毒均獲得了較高的滴度,分別為2×108TU/ml和4×108TU/ml，符合后續實驗要求。

2.3人膠質細胞瘤細胞U251病毒載體感染及干擾效率目標基因干擾載體和錯配序列干擾載體轉染人膠質細胞瘤細胞U251后(MOI值100)，24 h后鏡下GFP呈弱陽性，轉染第3天后GFP呈強陽性(見圖4)。實驗組和對照組載體轉染效率分別為96.6%、95.2%。

2.4免疫熒光染色LINGO-1表達情況免疫熒光染色顯示，人膠質細胞瘤細胞U251高表達LINGO-1，經干擾載體轉染干擾后，實驗組免疫熒光呈現減弱現象，可間接表明實驗組LINGO-1表達量較對照組有所減少(見圖5)。

2.5qPCR法檢測LINGO-1 mRNA表達水平實驗組LINGO-1 mRNA表達水平為(0.09±0.01)，對照組為(1.00±0.00)，差異有統計學意義(t=12.87，P<0.01)。實驗組LINGO-1 mRNA相對表達抑制率為91.0%。

2.6Western boltting法檢測LINGO-1表達水平實驗組LINGO-1表達水平為(0.28±0.02)，對照組為(1.00±0.00)，差異有統計學意義(t=-8.13，P<0.01，見圖6)。

注：A、C為明場293細胞，B、D為帶GFP熒光細胞

圖3質粒轉染效率(×100)

Figure 3Transfection efficiency of plasmid

注：A：實驗組GFP病毒感染，B：實驗組4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核，C：實驗組Merge圖，D：對照組GFP病毒感染，E：對照組DAPI染核，F：對照組Merge圖

圖4人膠質細胞瘤細胞U251病毒載體感染(×200)

Figure 4Lentiviral vectors transfected into in U251 cells of human glioma

注：A：實驗組LINGO-1熒光染色，B：實驗組DAPI染核，C：實驗組Merge圖，D：對照組LINGO-1熒光染色，E：對照組DAPI染核，F：對照組Merge圖

圖5LINGO-1免疫熒光染色(×200)

Figure 5LINGO-1 immunofluorescence staining

圖6　Western boltting法檢測LINGO-1表達水平電泳圖

Figure 6Electrophoretogram of expression level of LINGO-1 protein by Western blotting method

3　討論

中樞神經系統損傷性疾病包括缺氧缺血性腦病、創傷性腦損傷、脊髓損傷、運動神經元疾病等，是一類嚴重威脅人類健康的疾病。中樞神經系統損傷導致神經元永久性死亡、軸突崩解及髓鞘脫失，而神經系統的自我修復過程又十分復雜，其中中樞神經生長微環境是影響神經元、軸突再生的一個關鍵因素[6]。因此，近年來從神經再生微環境著手，如何有效促進中樞神經系統損傷神經的再生，尋找促進軸突再生的有效靶點成為研究的新方向[7]。研究者現已發現，多種神經再生抑制性因子在神經再生過程中發揮著重要的作用[8]；而LINGO-1就是其中一個典型代表，LINGO-1是一個由614個氨基酸組成的跨膜蛋白，早期研究發現LINGO-1可以抑制軸突生長[9]；近年來動物實驗研究表明，LINGO-1在神經元軸突的髓鞘化過程中也發揮了重要的調控作用[10-12]，LINGO-1是成髓鞘細胞分化和髓鞘化的一個關鍵的負調節因素[13]。因此，若人源細胞中LINGO-1表達下調也可能會對中樞神經再生產生重要的影響作用。

慢病毒載體主要是由人類免疫缺陷型病毒(human immunodeficiency virus,HIV)發展改造而來，其對感染靶細胞的細胞周期要求低，感染靶細胞后不但可以長期穩定表達，而且不會產生生物危害。一般根據實驗需要對慢病毒載體進行改造，通過慢病毒介導的RNAi進行腫瘤疾病、神經系統疾病的研究[14-15]；RNAi作為一種新興基因治療手段,能夠特異性抑制目的基因的表達效果[3-4]。

本研究根據LINGO-1基因的特異性,通過慢病毒干擾載體降低人源U251細胞LINGO-1的表達。采用分子生物學技術，應用慢病毒作為RNAi的載體,通過基因重組技術構建了人LINGO-1基因重組慢病毒干擾載體,重組載體經轉化、PCR鑒定及DNA測序，證實插入序列與設計的shRNA寡聚核苷酸序列完全一致，證明成功構建重組載體，進一步包裝后，獲得了高純度的病毒原液；且LINGO-1 RNAi載體帶有綠色熒光蛋白基因，便于慢病毒包裝時轉染效率的測定及對靶細胞U251感染效率的評估，實驗結果顯示，質粒轉染效率均在95.0%以上。慢病毒感染U251細胞3 d后，熒光顯微鏡下觀察發現，實驗組和對照組細胞內均可見大量綠色熒光，經計算GFP陽性細胞數分別為96.6%和95.2%，初步判定感染靶細胞成功。為驗證所構建的干擾載體對U251細胞中LINGO-1基因表達的干擾效果，分別運用免疫熒光染色、qPCR和Western blotting法進行了檢測。在qPCR檢測中，采用了相對定量比較CT值法，計算結果得出實驗組LINGO-1 mRNA表達水平明顯低于對照組，基因沉默效率高達91.0%。Western blotting法檢測LINGO-1表達水平，結果顯示，實驗組LINGO-1表達水平明顯低于對照組；免疫熒光染色間接證明實驗組LINGO-1表達有所減少。

綜上所述，本實驗成功構建含人LINGO-1慢病毒干擾載體對人源靶基因LINGO-1表達具有顯著的抑制作用，為LINGO-1的拮抗性相關性實驗研究以及探究LINGO-1在神經再生中的作用奠定了實驗基礎。但是鑒于神經軸突再生微環境的極其復雜，受多重因素的影響；通過RNAi來降低人源細胞LINGO-1的表達，能否促進神經軸突的再生以及對LINGO-1相關信號轉導通路是否產生影響，均需要進一步探究。

作者貢獻：楊印祥、欒佐進行實驗設計；索磊進行實驗實施、評估、資料收集以及論文撰寫；欒佐進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。

[1]MI S,PEPINSKY R B,CADAVID D.Blocking LINGO-1 as a therapy to promote CNS repair:from concept to the clinic[J].CNS Drugs,2013,27(7):493-503.

[2]WANG C,GUO S,QU C,et al.LINGO-1 expression of brain tissue in experimental autoimmune encephalomyelitis mouse[J].Zhonghua Yi Xue Za Zhi,2014,94(15):1184-1188.

[3]SIOUD M.RNA interference:mechanisms,technical challenges,and therapeutic opportunities[J].Methods Mol Biol,2015,1218:1-15.

[4]NGUYEN L H,DIAO H J,CHEW S Y.MicroRNAs and their potential therapeutic applications in neural tissue engineering[J].Adv Drug Deliv Rev,2015,88:53-66.

[5] 高峰.shRNA干擾Lingo-1基因表達促進脊髓損傷修復的實驗研究[D].長春：吉林大學,2010.

[6]DOOLEY D,VIDAL P,HENDRIX S.Immunopharmacological intervention for successful neural stem cell therapy:new perspectives in CNS neurogenesis and repair[J].Pharmacol Ther,2014,141(1):21-31.

[7]ZHAO X H,JIN W L,JU G.An in vitro study on the involvement of LINGO-1 and Rho GTPases in Nogo-A regulated differentiation of oligodendrocyte precursor cells[J].Mol Cell Neurosci,2007,36(2):260-269.

[8]BARRETTE B,VALLIERES N,DUBE M,et al.Expression profile of receptors for myelin-associated inhibitors of axonal regeneration in the intact and injured mouse central nervous system[J].Mol Cell Neurosci,2007,34(4):519-538.

[9]MI S,MILLER R H,LEE X,et al.LINGO-1 negatively regulates myelination by oligodendrocytes[J].Nat Neurosci,2005,8(6):745-751.

[10]ZHANG Y,ZHANG Y P,PEPINSKY B,et al.Inhibition of LINGO-1 promotes functional recovery after experimental spinal cord demyelination[J].Exp Neurol,2015,266:68-73.

[11] COBRET L,DE TAUZIA M L,FERENT J,et al.Targeting the cis-dimerization of LINGO-1 with low MW compounds affects its downstream signalling[J].Br J Pharmacol,2015,172(3):841-856.

[12] XING H Y,MENG E Y,XIA Y P,et al.Effect of retinoic acid on expression of LINGO-1 and neural regeneration after cerebral ischemia[J].J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci,2015,35(1):54-57.

[13] YIN W,HU B.Knockdown of Lingo1b protein promotes myelination and oligodendrocyte differentiation in zebrafish[J].Experimental Neurology,2014,251:72-83.

[14]BOETTCHER M,MCMANUS M T.Choosing the right tool for the Job:RNAi,TALEN,or CRISPR[J].Mol Cell,2015,58(4):575-585.

[15]SUMIMOTO H,KAWAKAMI Y.Lentiviral vector-mediated RNAi and its use for cancer research[J].Future Oncol,2007,3(6):655-664.

(本文編輯：陳素芳)

Construction and Identification of Lentiviral Interference Vector That Including Human LINGO-1

SUOLei,YANGYin-xiang,LUANZuo.

TheThirdClinicalCollegeofMedicine,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China

LUANZuo，theThirdClinicalCollegeofMedicine,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515；DepartmentofPediatrics，NAVYGeneralHospital,Beijing100048,China；E-mail:luanzuo2009@163.com

ObjectiveTo construct the lentiviral interference vector that including human LINGO-1 in vitro and evaluate its interference effects on the target gene LINGO-1.MethodsFrom March to November in 2015,interference sequences that targeted at human LINGO-1 interfered by short hairpin RNA (LINGO-1 shRNA) were designed and synthesized according to the LINGO-1 gene sequence reported in GenBank database,LINGO-1 shRNA was cloned into recombinant plasmid vectors.They were assembled in 293T cells after sequence verification.The test divided into interference vector group of target gene (experimental group) and interference vector group of mismatch sequence (control group),the lentiviral vectors were transfected into U251 cells of human glioma,and its efficiency of infection was observed by fluorescence microscopy.Immunofluorescent staining and real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction (qPCR) method were adopted to detect the expression level of LINGO-1 mRNA.The expression level of LINGO-1 was detected by Western blotting method.ResultsTwo groups of lentiviral interference vectors were successfully constructed,and the virus stock solutions with a titer of 2×108TU/ml and 4×108TU/ml were obtained respectively after package.After U251 cells of human glioma were transfected with virus vectors,the transfection efficiency of vectors in experimental group and control group were 96.6% and 95.2% respectively.Immunofluorescent staining presented that LINGO-1 was highly expressed in U251 cells of human glioma,and immunofluorescence in experimental group weakened after the transfection of lentiviral vectors.The expression level of LINGO-1 mRNA in experimental group (0.09±0.01) was significantly decreased compared with that in control group (1.00±0.00) (t=12.87，P<0.01),and the interference rate of LINGO-1 mRNA relative expression in experimental group was 91.0%.Compared with control group (1.00±0.00),the LINGO-1 expression level of experimental group (0.28±0.02) was significantly decreased (t=-8.13,P<0.01).ConclusionThe paper has successfully constructed lentiviral shRNA interference vectors that targeting at human LINGO-1,and verified there are good inference effects of interference vectors on target genes,which provides basis for studying the role of LINGO-1 in axon regeneration.

Lentivirus；RNA interference；LINGO-1

國家自然科學基金面上項目(81471486)

510515廣東省廣州市，南方醫科大學第三臨床醫學院(索磊，欒佐)；中國人民解放軍海軍總醫院兒科(楊印祥，欒佐)

欒佐,510515廣東省廣州市，南方醫科大學第三臨床醫學院，中國人民解放軍海軍總醫院兒科；

E-mail:luanzuo2009@163.com

R 349.65

ADOI：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.24.019

2016-01-02；

2016-06-25)