Nafion修飾碳纖維微電極在抗壞血酸共存下選擇性測定去甲腎上腺素

李　梅，陳　慧，伍雪巍，農燕婷，陳思伶，唐旻奕，程　寒

(中南民族大學　藥學院，湖北　武漢　430074)

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Nafion修飾碳纖維微電極在抗壞血酸共存下選擇性測定去甲腎上腺素

李梅，陳慧，伍雪巍，農燕婷，陳思伶，唐旻奕，程寒*

(中南民族大學藥學院，湖北武漢430074)

制備了碳纖維微電極，將潔凈的碳纖維微電極浸入Nafion溶液中，采用電沉積的方法制得Nafion修飾碳纖維微電極。采用循環伏安法(CV)、差分脈沖伏安法(DPV)研究了去甲腎上腺素(NE)和抗壞血酸(AA)在電極上的電化學行為。結果表明：在最優條件下制備的Nafion修飾電極能完全屏蔽AA的電化學響應，而對NE仍表現出良好的電化學響應。修飾電極能在1.0 mmol/L AA的共存下選擇性地測定NE，采用DPV進行檢測，NE的氧化峰電流與其濃度在1.0×10-6～1.0×10-4mol/L范圍內呈良好的線性關系，相關系數(r2)為0.991 2，檢出限(S/N=3)為8.6×10-7mol/L。利用該方法測定了模擬樣品中NE的含量，平均加標回收率為101.6%。該電極的重現性和穩定性良好，且具有良好的靈敏度和選擇性，有望用于復雜生物環境中NE濃度的檢測。

Nafion；碳纖維電極；差分脈沖伏安法；循環伏安法；去甲腎上腺素；抗壞血酸

去甲腎上腺素(Norepinephrine,NE)是一種神經遞質，主要由交感節后神經元和腦內腎上腺素能神經末梢合成和分泌。動物體內的NE含量變化反映了肢體神經系統植物交感神經的活動狀況，其代謝障礙會引起含量的改變，從而影響心血管功能的調節、鎮痛、情感障礙、體溫調節、攝食等生理功能，因此在臨床和基礎研究中具有非常重要的作用[1-4]。抗壞血酸(Ascorbic acid,AA)又稱維生素C，是一種在生物體內維持機體正常生理功能的維生素，作為一種抗氧化劑，AA還可以保護身體免受自由基的威脅。NE與AA均為電化學活性物質，可采用電化學方法進行檢測。由于在哺乳動物體內AA與NE共存，但AA平均濃度比NE高10～1 000倍，且與NE氧化峰重疊，從而干擾NE的測定[5-6]。因此排除AA的干擾，選擇性測定NE在生理功能研究和臨床檢測中有重要意義。張宏等[7]利用電沉積的方法制得納米金修飾玻碳電極，該修飾電極對NE氧化反應有催化作用。由NE和AA在納米金修飾電極上的循環伏安圖可觀察到兩個明顯分開的氧化峰，峰電位差達131 mV，因此，可利用該修飾電極在AA存在下選擇性測定NE。但因納米金修飾層易脫落，導致修飾電極不穩定。

Nafion聚合物因具有導電性好、對熱和化學物質穩定、阻抗小、水中溶解度小，同時還具有化學惰性、耐腐蝕性等優點，成為一種良好的電極修飾材料[8-11]。由于Nafion膜含有帶負電的磺酸基團，只與陽離子發生選擇性交換，排斥中性分子和陰離子，是一種優良的陽離子交換劑[12-14]，因此用作電極修飾材料具有良好的離子選擇性。Nafion膜廣泛應用于化學修飾電極以增加修飾電極對陽離子的選擇性[15-17]。金利通等[8]的研究顯示，Nafion膜修飾電極對表面活性物質具有良好的抗干擾能力，因此應用Nafion修飾電極可提高分析靈敏度和抗干擾能力。

本文利用兩種方法制備了Nafion修飾碳纖維電極，對兩種方法的修飾效果進行比較，選擇較優的電沉積法將Nafion修飾到碳纖維電極表面，對電沉積時間進行了優化，并進一步探索了AA和NE在修飾電極上的電化學行為。實驗結果表明，修飾電極對NE有良好的電化學響應及穩定性，且能完全屏蔽AA的電化學信號，采用該修飾方法可在高濃度AA共存下選擇性地測定NE。

1　實驗部分

1.1儀器與試劑

XD-RFL實驗室倒置顯微鏡(寧波舜宇儀器有限公司)，CHI660D電化學工作站(上海辰華儀器公司)，采用兩電極系統，碳纖維微電極為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極。分析天平(奧豪斯上海責任有限公司)，FE20K型酸度計(瑞士梅特勒-托利多集團)。

碳纖維(直徑6 μm，吉林市神舟碳纖維有限責任公司)；5% Nafion(Sigma公司)；去甲腎上腺素(NE，Sigma公司)用0.1 mol/L的HClO4配成1.0×10-2mol/L的母液，置于4 ℃的冰箱冷藏室中保存，使用時以Tris-HCl緩沖溶液稀釋至所需濃度；碳粉導電膠(自制)，無水乙醇(分析純，天津醫藥公司)，抗壞血酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)，所有其它試劑均為國產分析純，實驗用水為二次去離子水。

1.2碳纖維微電極的制作

在酒精燈的外焰上拉制玻璃毛細管(內徑1 mm)，使拉制好的毛細管尖端內徑約20 μm，將分離好的碳纖維(直徑6 μm，長約15 mm)和銅絲(銅絲兩端均去掉約1.5 cm的絕緣層，銅絲直徑0.2 mm，長約10 cm)用碳粉導電膠粘連，將碳纖維從玻璃毛細管另一端穿入至露出玻璃毛細管尖端外約2 mm，用AB膠將玻璃毛細管末端封住，且保證粘膠固化后固定在銅絲上，然后于酒精燈外焰上灼燒，迅速取出，直至玻璃毛細管尖端熔封，封好后，在倒置顯微鏡下測量電極長度，若碳纖維過長，則將露出的碳纖維在酒精燈外焰上燒蝕，確保露出的碳纖維長度為100～200 μm，即得碳纖維微電極。

1.3電沉積法制作Nafion修飾電極

用無水乙醇將5% Nafion試劑稀釋至1%后使用。將裸電極置于制備好的1%Nafion溶液中，1.5 V電壓下電鍍5 s，取出，室溫條件下自然晾干(3～5 min)，重復沉積多次，優化Nafion修飾量，修飾電極洗凈待用。

1.4滴涂法制作Nafion修飾電極

將裸電極放在載玻片上，取制備好的1% Nafion溶液10 μL(Nafion溶液剛好能將碳纖維電極尖端浸沒)，滴在電極尖端，室溫下自然晾干，修飾電極洗凈待用。

2　結果與討論

2.1電沉積法與滴涂法修飾電極的穩定性比較

選擇經電沉積5 s修飾的電極以及滴涂法制備的電極分別在1.0×10-4mol/L NE溶液中進行連續測定(DPV，n=5)。實驗結果表明，采用電沉積法修飾的碳纖維電極在NE中多次測定，響應電流幾乎不變，電極的重現性良好；而滴涂法修飾的電極多次測量后電流明顯減弱。因此，采用電沉積法制備Nafion膜更穩定，碳纖維修飾電極的電化學性能亦更穩定。本實驗選擇電沉積法制備Nafion膜。

2.2Nafion修飾量的優化

將潔凈碳纖維電極置于1% Nafion溶液中，于1.5 V電壓下采用電流～時間曲線電沉積5 s，取出，室溫下放置3～5 min，自然晾干，重復電沉積多次，每次電沉積完畢，均于1.0×10-3mol/L AA中記錄DPV圖。結果顯示，由于Nafion 膜只與陽離子發生選擇性交換，靜電排斥陰離子，在20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.2)緩沖溶液中，AA帶負電荷，因此，隨著電沉積次數的增加，修飾電極于1.0×10-3mol/L AA溶液中的電化學響應逐漸減小，經1% Nafion溶液反復電沉積9次(5 s/次)后，修飾電極完全屏蔽了AA的電化學響應。

2.3Nafion修飾電極的掃描電鏡表征

碳纖維微電極和Nafion修飾的碳纖維微電極的掃描電鏡圖片如圖1所示，碳纖維微電極的表面平整光滑(圖1A)，而修飾電極幾何尺寸增加(圖1B)，表明帶負電荷的Nafion膜沉積在電極表面。

2.4Nafion修飾電極的伏安特性

采用1% Nafion溶液反復電沉積9次(5 s/次)得到Nafion修飾的碳纖維電極，在20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.2)緩沖溶液中，考察了電極修飾前后在1.0×10-3mol/L AA和1.0×10-4mol/L NE溶液中的差分脈沖伏安曲線。由圖可見，修飾Nafion前，電極在AA溶液中有較強電流信號，修飾后電極在1.0×10-3mol/L AA中幾乎無響應，AA的電化學信號完全被屏蔽(圖2A)；在1.0×10-4mol/L NE中Nafion修飾電極比裸電極的響應電流略小，但仍表現出良好的電化學響應(圖2B)。

由此可見，采用最優條件下的Nafion修飾電極能完全屏蔽AA的電化學響應，而對NE仍表現出良好的電化學響應。這是因為在pH 7.2的Tris-HCl中，由于Nafion結構中含有磺酸基，在溶液中解離后可使修飾的電極表面帶負電荷。NE結構中含有兩個酚羥基和一個氨基，堿性較強，在pH 7.2的條件下，以質子化形式存在，帶正電荷；而AA在此體系中帶負電荷。由于異性電荷相吸引，NE吸附在電極表面，使得其在電極表面的濃度增加，同時Nafion修飾層的存在也在一定程度上減弱了電極的電子傳遞能力，在上述兩種作用的影響下，NE的氧化峰電流略有減小，但仍表現出良好的電化學響應。

2.5NE氧化峰電流與掃速的關系

研究了潔凈碳纖維電極在1.0×10-4mol/L NE中的氧化峰電流(I，μA)與掃描速率(v,mV/s)之間的關系。結果顯示，在20～2 000 mV/s掃速范圍內，NE的氧化峰電流隨著掃速的增大而增大，且氧化峰電流與掃速成正比，線性回歸方程為I=7×10-12v+2×10-8，r=0.995 0，表明NE在碳纖維電極上的氧化過程受吸附控制。

同時，研究了Nafion修飾電極在1.0×10-4mol/L NE中的氧化峰電流與掃描速率之間的關系，結果顯示，在20～2 000 mV/s掃速范圍內，NE的氧化峰電流與掃速成正比，回歸方程為I=6×10-12v+1×10-8，r=0.999 0，表明NE在修飾電極上的氧化過程亦受吸附控制。

2.6工作曲線及線性范圍

在1.0×10-3mol/L AA共存條件下，在20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.2)緩沖溶液中，利用DPV法測定NE，結果見圖3。在1.0×10-6～1.0×10-4mol/L范圍內，NE的氧化峰電流隨其濃度的增大而增大，且NE的濃度與氧化峰電流呈良好的線性關系(圖3插圖)，其線性方程為I=3×10-5c+4×10-10,r2=0.991 2。修飾電極對Nafion的檢出限(S/N=3)達8.6×10-7mol/L。即使在AA濃度高出NE 3個數量級的情況下，Nafion修飾電極仍能選擇性地檢測NE。

2.7實際樣品的測定

在優化條件下，采用20 mmol/L Tris-HCl配制3.0×10-5mol/L NE及1.0×10-3mol/L AA混合溶液，在優化條件下對電極進行電沉積修飾，并對NE做3個水平(4.0×10-5，3.0×10-5，5.0×10-5mol/L)的加標回收率實驗，測得回收率分別為101.1%，101.7%，102.0%，平均回收率為101.6%。

3　結　論

本文采用電沉積法及滴涂法將Nafion修飾到碳纖維電極表面，形成Nafion修飾的碳纖維電極，實驗結果表明電沉積法制備的修飾電極電化學性能更穩定。研究了NE和AA在該修飾電極上的電化學行為，優化了Nafion的修飾用量，使得修飾電極能屏蔽AA的電化學響應。Nafion修飾電極能在高濃度(1.0×10-3mol/L)AA共存下選擇性測定NE，且NE的氧化峰電流與濃度在1.0×10-6～1.0×10-4mol/L范圍內呈良好的線性關系。該修飾方法具有良好的靈敏度和選擇性，有望用于復雜生物環境中NE濃度的檢測。

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Selective Detection of Norepinephrine at Nafion Modified Carbon Fiber Microelectrode in the Presence of Ascorbic Acid

LI Mei,CHEN Hui,WU Xue-wei,NONG Yan-ting,CHEN Si-ling,TANG Min-yi,CHENG Han*

(College of Pharmacy,South-Central University for Nationalities,Wuhan430074，China)

A carbon fiber microelectrode modified with Nafion was fabricated by electrodeposition method on the basis of previous work.The electrochemical behaviour of norepinephrine(NE) and ascorbic acid(AA) at the prepared microelectrodes before and after modification were investigated using cyclic voltammetry(CV) and differential pulse votammetric(DPV) methods.Under the optimum conditions,the Nafion modified electrode can completely shield the electrochemical response of AA,however,a sensitive response to NE was obtained on the modified electrode.Based on this,the modified electrode can be used to selectively detect NE without interference from high concentration AA.DPV response of NE showed a good linearity(r2=0.991 2) at the modified microelectrode with its concentration in the range of 1.0×10-6-1.0×10-4mol/L,with a detection limit(S/N=3) of 8.6×10-7mol/L.The proposed method was applied in the determination of NE in simulation sample with spiked recovery of 101.6%.The modified electrode exhibited almost the same electrochemical behavior after a month,indicating that the modified electrode is pretty stable and has a good reproducibility.The advantages of excellent sensitivity and selectivity made the modified electrode could be used to monitor NE in complex biological environment.

Nafion；carbon fiber electrode；differential pulse voltammetry(DPV)；cyclic voltammetry(CV)；norepinephrine(NE)；ascorbic acid(AA)

2015-10-01；

2015-12-21

國家自然科學基金項目(21205144)；中南民族大學學術團隊(XTZ15013)；中南民族大學民族藥學十二五實驗教學示范中心資助

程寒，博士，副教授，研究方向：藥物分析，Tel:027-67841196，E-mail:chenghan@mail.scuec.edu.cn

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.06.020

O657.1;R458.3

A

1004-4957(2016)06-0744-05