靶向CD123嵌合抗原受體T細胞治療急性髓系白血病最新進展

張家奎，阮燕潔，王會平，翟志敏

(安徽醫科大學第二附屬醫院血液科，生物醫療研究中心，安徽醫科大學血液病研究中心,安徽 合肥　230601)

?

靶向CD123嵌合抗原受體T細胞治療急性髓系白血病最新進展

張家奎，阮燕潔，王會平，翟志敏

(安徽醫科大學第二附屬醫院血液科，生物醫療研究中心，安徽醫科大學血液病研究中心,安徽 合肥230601)

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.08.004

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是最常見的、死亡率最高的一類白血病。在過去的40年里，盡管人們對于AML的認識更加深入，但是與其他血液腫瘤相比，AML的治療并沒有明顯的變化。CD123是AML相關抗原，高表達于白血病干細胞，低或不表達于正常造血干細胞。作為治療AML的潛在治療靶點，近期靶向CD123+細胞免疫治療技術已經有了新的進展，尤其是嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor,CAR)T細胞治療技術發展迅速。早期研究也已經證實CD123 CAR-T細胞具有抗白血病效應，而且對正常造血系統有不同程度的影響，這也為臨床治療復發/難治AML提供了新的思路。

急性髓系白血病；CD123；干細胞；免疫治療；嵌合抗原受體；T細胞

隨著腫瘤免疫學技術的發展, 細胞免疫治療技術在急性白血病中的作用日益受到重視。近年來，表達某些腫瘤特異性嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor,CAR)的T細胞治療技術發展迅速,在體外和臨床試驗中已經顯示出良好的靶向性、殺傷能力和持久性, 為過繼性細胞免疫治療惡性腫瘤提供了新的有效解決方案, 展示了巨大的應用潛力和發展前景。CD123是急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)相關抗原，高表達于白血病干細胞，低或不表達于正常造血干祖細胞，是AML的潛在治療靶點。本文就目前靶向CD123的細胞免疫治療技術治療急性髓細胞白血病的最新進展做一綜述。

1　AML治療現狀

急性白血病是一類造血干細胞的惡性克隆性疾病，因白血病細胞自我更新增強、增殖失控、分化障礙、凋亡受阻，而停滯在細胞發育的不同階段，在骨髓和其他造血組織中，白血病細胞大量增生累積，使正常造血受抑制并浸潤其他器官和組織。在成人急性白血病患者當中，AML是最常見的、死亡率最高的一類白血病。在過去的40年里，盡管人們對于AML的認識更加深入，但是與其他血液腫瘤相比，AML的治療并沒有明顯的變化，目前60歲及60歲以下AML患者的治愈率為35% ～ 40%，而60歲以上老年AML患者治愈率僅5% ～ 15%[1]。無法接受強化療老年AML患者的中位生存期僅為5～10個月。目前，成人初診AML誘導治療的完全緩解(complete remission,CR)率約為70%，而其中約43%的患者會最終復發，此外還有約18%的患者不能通過一線誘導化療方案獲得CR[2]。AML患者首次復發后的5年OS也僅為7%～12%[2-3]。

目前，異基因造血干細胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,alloHSCT)仍然是難治/復發AML的主要治療手段，也是AML患者獲得二次緩解后的首選治療方法。它可以將AML患者的5年無病生存率(disease-free survival,DFS)提升至40%～50%[2,4]。然而不幸的是，現有的治療手段并不能使大多數AML患者獲得二次CR，其中首次CR周期>6個月的患者復發后僅約50%能夠獲得二次CR，首次CR周期<6個月的患者復發后僅約20%的患者能夠獲得二次CR[5]。同時，復發后的挽救化療方案常常為大劑量或非常規的化療藥物，如此會使患者的身體狀況以及臟器功能嚴重惡化，同時也會降低alloHSCT的成功率。因此，對于難治/復發及誘導失敗的AML患者，迫切需要尋找有效且副作用可控的全新治療方法。

2　CD123與AML

近年來，隨著對白血病細胞耐藥機制研究的逐漸深入，已認識到傳統化療對于急性白血病效果不佳主要是因其無法有效針對白血病干細胞(leukemic stem cells,LSCs)。究其原因主要是由于LSCs基本上都是處于靜止期，并可以隨時增殖分化成為白血病細胞，同時他們還具有較強的自我修復能力。因此，AML患者若想取得能長期CR必須根除LSCs。對于LSCs表面特異性抗原的研究以及特異性細胞免疫治療技術也都是目前的研究熱點。

CD123是一種包含360個氨基酸的糖蛋白，它也是IL-3受體(interleukin-3 receptor, IL-3R)α鏈，與IL-3Rβ(CD131)一起構成高親和力的IL-3R。CD131是IL-3R、IL-5R和GM-CSFR的共同β鏈，而CD123則僅存在于IL-3R，并表達于造血干/祖細胞、單核細胞、巨核細胞、B淋巴細胞和漿細胞樣樹突狀細胞上。IL-3R特異性識別并結合IL-3后，能促進細胞的生長和增殖，與腫瘤、過敏性炎癥、自身免疫性疾病的發生有關。CD123低或不表達于原始造血細胞和紅系祖細胞上，而在髓系或B系祖細胞上是高表達的。隨著這些細胞的成熟，CD123的表達強度也在逐漸減弱，并消失于成熟的粒細胞和淋巴細胞上[6]。

有研究已證實，CD123同樣高表達于75%～89%的AML患者的白血病細胞和LSCs上[7]。有學者對CD123+細胞群的功能進行研究后發現，將CD34+/CD123+細胞亞群植入非肥胖糖尿病/重度聯合免疫缺陷(nonobese diabetic /severe-combined immunodeficient,NOD/SCID)小鼠體內后可誘發小鼠AML[8]。此外，CD123通常也會高表達在漿細胞樣樹突狀細胞、嗜堿性粒細胞，低表達在單核細胞、嗜酸性粒細胞、骨髓來源的樹突狀細胞上[9]。

CD123在AML中的表達與信號轉導與轉錄激活因子5(signal transducer and activator of transcription 5, STAT5)密切相關。AML患者的白血病細胞能自發磷酸化激活STAT5，使細胞增殖分化并抵抗凋亡[10]，因此，高表達CD123是AML預后不良因素之一。除了AML以外，CD123還會過表達于其他血液系統腫瘤，如急性B淋巴細胞白血病、慢性粒細胞白血病、漿細胞樣樹突細胞腫瘤和多毛細胞白血病等[11]。

3　CD123單抗治療AML

SL-401是白喉毒素與IL-3作用過程中的一個催化和易位的片段，它是早期研究比較多的一種針對CD123的免疫治療手段[7]。SL-401與白血病細胞上CD123相互作用以后，會內化并促使細胞產生新的蛋白，并抑制白血病細胞增殖。早期臨床研究發現，SL-401的活性與IL-3β的表達程度相關。然而，與CD123不同，IL-3β并不常表達于AML細胞上。Frankel等[12]將SL-401應用在治療9例AML患者的I期臨床試驗中，7例患者有較為明顯的治療反應，其中5例是CR，2例是部分緩解(partial remission,PR)，但中位時間僅約5個月。Frankel等[13]將SL-401應用于40例難治性AML和骨髓異常增生綜合征患者治療的Ⅰ期臨床試驗中，1名患者獲得CR(隨訪8個月),1例獲得PR(隨訪3個月),提示 SL-401療效不佳。究其原因，可能是與抗 CD123偶聯的白喉毒素的治療劑量與中毒劑量接近，且人群因預防免疫常攜帶有白喉毒素抗體， 故其臨床應用有限。

CSL-360(7G3)為鼠源抗CD123單克隆抗體，7G3能與IL-3Rα鏈結合，抑制其與IL-3 結合，從而拮抗IL-3的功能。然而，在一項針對27例AML患者的I期臨床試驗中，僅1例患者獲得長期CR，提示中和IL-3R在治療AML中是無效的[14]。

CSL362是一種人源化的抗CD123單抗，是CSL360的衍生物。它是通過抗體工程技術使之與自然殺傷(natural killer,NK)細胞表面的CD16有較強的親和力，通過提高NK細胞的抗體依賴性細胞毒(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)作用來提高抗白血病效應。動物實驗中已發現 CSL362 能明顯抑制 AML 移植小鼠的白血病細胞增殖，同時，CSL-362也正在I期臨床試驗中[15]。

此外，還有一些針對CD123的雙特異性抗體。MGD006可以同時針對CD123和CD3，早期臨床研究中也證實其具有抗白血病效應，目前其也已經被用于試驗性治療難治/復發AML[16]。

XmAb14045同樣是同時針對CD123和CD3，它也已經完成非人類的靈長類動物實驗，研究結果也提示其可以清除骨髓和外周血中CD123+細胞[17]。

迄今為止，針對CD123的單克隆抗體治療AML并未發生明顯毒副反應，但目前還沒有抗CD123抗體被正式應用于臨床治療，它們在人體內的抗白血病效應仍有待觀察。

4　CD123 CAR-T治療AML

4.1CAR-T簡介CAR-T是一種高尖端免疫細胞基因工程技術，通過修飾自體殺傷腫瘤性T淋巴細胞，使其表達可靶向識別腫瘤細胞表面特定分子的受體并加以擴增激活。基于Ig和TCR結構的相似性，CAR是以單克隆抗體的單鏈可變區(single chain variable fragment,scFv)取代TCR的a、G鏈可變區，然后scFv直接以單一多肽鏈形式和T細胞信號傳導區域CD3ζ連接，加或不加共刺激分子所組成(Fig 1)。scFv通過識別腫瘤特異性抗原，直接將信號向細胞內傳導，使T細胞活化，分泌細胞因子，并殺傷腫瘤細胞[18]。CAR識別的是細胞表面完整的蛋白或糖脂分子，無需抗原處理和提呈，故為MHC非限制性。同時與傳統化療和單克隆抗體治療不同，CAR-T細胞可能會長期存在于患者體內發揮持久免疫效應。

Fig 1　Chimeric antigen receptor(CAR) structure and design

The common elements of all CARs consist of:① A targeting domain, typically an scFv:a single-chain variable fragment derived from a monoclonal antibody;② A hinge region, both extends the binding domain away from the T-cell membrane and allows suitable freedom of orientation. This region is usually derived from IgG4, CD8α, or CD28 molecules;③ A transmembrane domain. This region is usually derived from CD8 or CD28 molecules;④ co-stimulatory molecule(s). Early first generation CARs had no co-stimulatory components,second or third generation CARs had two or more co-stimulatory molecules. This region is usually derived from CD27，CD28，4-1BB，OX40or ICOS molecules;⑤ An intracellular signalling domain, usually the TCRζ or FCRγ chain.

近年來，CAR-T細胞在部分腫瘤中已經取得了令人鼓舞的療效。Porter等[19]利用CD19 CAR-T細胞治療了3例慢性淋巴細胞白血病(CLL)患者，其中2例達到CR, 1例PR, 未發生明顯不良反應，而且這2例CR患者隨訪2年后仍處于CR，療效得到肯定。美國Memorial Sloan Kettering癌癥中心利用CD19 CAR-T細胞治療了16例B-ALL患者，其中88%的患者獲得CR，而且CR的患者中大部分繼續成功接受了造血干細胞移植術[20]。本研究中心也已在美國Clinicaltrials.gov注冊了采用CAR-T細胞治療難治/復發急性非T淋巴細胞白血病的臨床研究(NCT02735291)，截至目前有14例難治/復發B-ALL患者入組，除4名患者目前正在接受治療，本研究組已對10名患者進行療效評估，其中5例患者獲得CR，1例獲得PR，總反應率60%。相比國外報道的結果，本研究組反應率相對較低的原因可能與入組患者病情更加嚴重復雜有關：10例患者中9例患者復發次數≥2次，8例患者存在提示預后差的細胞遺傳學異常和/或髓外復發(其中提示預后差的細胞遺傳學異常的5例，髓外復發的6例)。因此，能夠獲得60%的總反應率也是很好的突破。今后隨著病例數的增加，將對療效和不良反應進行全面系統的分析。

4.2CD123 CAR-T的基礎研究盡管CAR-T細胞是目前的研究熱點，但關于CD123 CAR-T的研究才剛剛起步。目前CD123 CAR-T細胞的制備仍在努力探索中，比如使用的scFv類型、制備的T細胞亞群比例以及制備相關技術等。

Mardiros等[5]最早測試了二代CD123 CAR-T細胞，它是由1個CD123 CAR和CD28共刺激分子組成。這種CAR-T細胞在異基因小鼠體內表現出了有效的抗白血病效應，而且在體外實驗中發現，利用AML患者T細胞制作成的CD123 CAR-T細胞能夠重新殺傷患者自身的白血病細胞。他們還將CD123 CAR-T 細胞與臍血中的CD34+細胞共培養，仍然能培養出正常的細胞集落，提示CD123 CAR-T 細胞對臍血中CD34+細胞并沒有殺傷作用。Tettamanti等[21]也在細胞因子誘導的殺傷(cytokine-induced killer,CIK)細胞上加上了一代CD123 CAR，即一代CD123 CAR CIK細胞，證實了CD123 CAR-T的抗白血病效應及靶向性。他們還測試了三代CD123-28OX40 CAR CIK細胞，即添加了共刺激分子CD28和OX40，同樣展示出了更強的抗白血病效應，且共培養后對臍血細胞及人或動物的造血干祖細胞僅有很弱的殺傷作用。

然而，Gill等[22]用CD123-41BB CAR-T細胞治療AML小鼠時，CAR-T細胞在展示出了抗白血病效應的同時卻對小鼠自身造血系統造成嚴重損傷，這令他們對CD123 CAR-T的安全性產生質疑。然而后來檢測發現，這是由于小鼠的造血祖細胞來源于CD34+胎肝細胞，而這種細胞是高表達CD123的，不同于骨髓和臍血來源的造血祖細胞。

4.3CD123 CAR-T的臨床研究關于CD123 CAR-T的臨床試驗正在進行當中。而即使通過CD123 CAR-T細胞治療使復發/難治AML患者獲得二次CR，后續治療仍需首選異基因造血干細胞移植術。CAR-T細胞能否取代alloHCT仍有待臨床檢驗。

Mardiros等[5]利用慢病毒載體制備出CD123 CAR-T細胞，并成功通過美國FDA批準臨床試驗。他們正在開展CD123 CAR-T細胞針對難治/復發的AML患者的I期臨床試驗。該試驗中，CD123 CAR-T細胞治療作為一種挽救性治療手段，目的是最大程度降低患者的腫瘤負荷，并為進行造血干細胞移植做準備。同時，為了應對治療過程中可能發生的不良反應，他們采取了以下措施：① 為了解決CAR-T細胞可能引起的不可逆性血細胞減少，所有患者在接受CD123 CAR-T細胞輸注前必須有合適的造血干細胞移植供者或者臍血供者；② 同其他CAR-T細胞一樣，需要嚴格控制CD123 CAR-T細胞在體內的存活時間，以降低長期血細胞減少及后期移植過程中殘留CAR-T細胞損傷造血干細胞的風險；③ 慢病毒載體的構成包括一段剪切的表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)，它可以用于選擇、追蹤CAR-T細胞，同時在需要時可利用西妥昔單抗作用于EGFR以清除CAR-T細胞。

然而，目前尚無CD123 CAR-T成功治療AML患者的報道，究其原因可能如下：① 最佳的CAR設計尚不清楚。例如如何選擇共刺激分子及其數量、細胞膜外連接片段的長度等；② CAR-T細胞的制備技術尚不成熟，導致不同實驗室制備的CAR-T細胞在CD4/CD8比例、調節性T細胞的比例、記憶細胞亞群比例等方面各不相同，也沒有統一的最佳標準；③ CAR-T細胞在體內的存在時間尚無法合理控制。臨床上輸注的CAR-T細胞的數量與治療效果并沒有明顯的聯系，因為即使輸注的CAR-T細胞數量很少，進入體內經過擴增以后仍然可能發揮良好的抗腫瘤效果。目前已知的提高CAR-T在體內存在時間的途徑是應用二代及以上的CAR-T細胞，但更強的免疫應答也會引起更強的不良反應。因此，最佳的CAR的設計及CAR-T細胞的輸注數量需要更多研究；④ 不良反應。目前臨床上報道的不良反應主要有B淋巴細胞“再障”、細胞因子釋放綜合征及神經系統毒性。因此，還需要盡可能提高治療效果并降低不良反應。值得一提的是，對于CAR-T治療過程中出現嚴重的相關不良反應時，相對于清除CAR-T細胞的方式，若能實時精確控制體內CAR表達其實更為理想；⑤ 無法有效克服腫瘤微環境的抑制作用。因此，治療過程需在有豐富免疫治療經驗的醫生指導下進行，以降低治療風險。

5　結語

綜上所述，鑒于CD123在AML白血病干細胞和正常造血細胞上的表達差異，它已經成為特別關注的一個特殊的腫瘤抗原靶點。CD123的抗體治療技術及CAR-T細胞技術的研究也已經證實存在抗白血病效應。相信在不久的將來，針對CD123的細胞治療技術很可能會有效改善AML患者預后，甚至改變AML長久以來的標準治療方案。

[1]D?hner H, Estey E H, Amadori S, et al. Diagnosis and management of acute myeloid leukemia in adults: recommendations from an international expert panel, on behalf of the European Leukemia Net[J].Blood, 2010, 115(3):453-74.

[2]Forman S J, Rowe J M. The myth of the second remission of acute leukemia in the adult[J].Blood，2013，121(7):1077-82.

[3]Breems D A, Van Putten W L, Huijgens P C, et al. Prognostic index for adult patients with acute myeloid leukemia in first relapse[J].JClinOncol，2005，23(9):1969-78.

[4]Stone R M. Acute myeloid leukemia in first remission: to choose transplantation or not[J]?JClinOncol，2013，31(10):1262-6.

[5]Mardiros A, Forman S J, Budde L E. T cells expressing CD123 chimeric antigen receptors for treatment of acute myeloid leukemia[J].CurrOpinHematol，2015，22(6):484-8.

[6]Liu K,Zhu M, Huang Y,et al. CD123 and its potential clinical application in leukemias[J].LifeSci，2015，122:59-64.

[7]Frankel A E, McCubrey J A, Miller M S, et al. Diphtheria toxin fused to human interleukin-3 is toxic to blasts from patients with myeloid leukemias[J].Leukemia，2000，14(4):576-85.

[8]Jin L，Lee E M，Ramshaw H S，et al.Monoclonal antibody-mediated targeting of CD123, IL-3 receptor alpha chain,eliminates human acute myeloidleukemic stem cells[J].CellStemCell，2009，5(1):31-42.

[9]Moretti S, Lanza F, Dabusti M, et al. CD123 (interleukin 3 receptor alpha chain)[J].JBiolRegulHomeostAgents，2001，15(1):98-100.

[10]魏偉. 炎癥免疫反應軟調節[J]. 中國藥理學通報，2016，32(3)：297-303.

[10]Wei W. Soft regulation of inflammatory immune responses[J].ChinPharmacolBull,2016,32(3):297-303.

[12]Frankel A E, Woo J H, Ahn C, et al. Activity of SL-401, a targeted therapy directed to interleukin-3 receptor, in blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm patients[J].Blood，2014，124(3):385-92.

[13]Frankel A，Liu J S，Rizzieri D，et al. Phase I clinical study of diphtheria toxin-interleukin 3 fusion protein in patients with acute myeloid leukemia and myelodysplasia[J].LeukLymphoma，2008，49(3):543-53.

[14]He S Z, Busfield S, Ritchie D S, et al. A phase 1 study of the safety, pharmacokinetics and antileukemic activity of the anti-CD123 monoclonal antibody CSL360 in relapsed, refractory or high-risk acute myeloid leukemia[J].LeukLymphoma，2015，56(5):1406-15.

[15]Busfield S J,Biondo M,Wong M, et al. Targeting of acute myeloid leukemiainvitroandinvivowith an anti-CD123 mAb engineered for optimal ADCC[J].Leukemia，2014，28(11):2213-21.

[16]Hussaini M A, Ritchey J, Retting M, et al. Targeting CD123 in leukemic stem cells using dual affinity re-targeting molecules (DARTs) [C]//Proceedingsofthe55thASHannualmeeting. New Orleans, 2013: 360.

[17]Chu S, Pong E, Chen H, et al. Immunotherapy with long-lived anti-CD123×anti-CD3 bispecific antibodies stimulates potent T cell-mediated killing of human AML cell lines and of CD123+ cells in monkeys: a potential therapy for acute myelogenous leukemia[C]//Proceedingsofthe56thASHannualmeeting. San Francisco, 2014: 2316.

[18]Colovos C,Villena-Vargas J, Adusumilli P S,et al. Safety and stability of retrovirally transduced chimeric antigen receptor T cells[J].Immunotherapy，2012，4(9):899-902.

[19]Porter D L, Levine B L, Kalos M, et al. Chimeric antigen receptor modified T cells in chronic lymphoid leukemia[J].NEnglJMed，2011，365(8):725-33.

[20]Davila M L, Riviere I, Wang X, et al. Efficacy and toxicity management of 19-28z CAR T cell therapy in B cell acute lymphoblastic leukemia[J].SciTranslMed，2014，6(224):224ra25.

[21]Tettamanti S, Marin V, Pizzitola I, et al. Targeting of acute myeloid leukemia by cytokine-induced killer cells redirected with a novel CD123-specific chimeric antigen receptor[J].BrJHaematol，2013，161(3):389-401.

[22]Gill S, Tasian S K, Ruella M, et al. Preclinical targeting of human acute myeloid leukemia and myeloablation using chimeric antigen receptor-modified T cells[J].Blood，2014，123(15):2343-54.

Research progress of T cells expressing CD123 chimeric antigen receptor for treatment of AML

ZHANG Jia-kui, RUAN Yan-jie, WANG Hui-ping, ZHAI Zhi-min

(DeptofHematologyandBio-medicalResearchCenteroftheSecondAffiliatedHospital,HematologicDiseasesResearchCenter,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230601,China)

Acute myeloid leukemia(AML) is the most common acute leukemia in adults and has the highest death rate of all leukemias. Compared with other hematologic malignancies, there was only a small increment in the 5-year relative overall survival for patients with AML in the last 40 years, despite the advancement in our understanding of AML. CD123 is an AML-associated antigen that expresses at a high level in leukemic stem cells and leukemic blasts and a low level in normal hematopoietic stem cells. As an attractive surface target for AML therapies, immune-based therapies targeting CD123 are being developed recently, especially chimeric antigen receptor(CAR) T-cell-based immunotherapy. Preclinical data have demonstrated that CD123 CAR-T cells exhibit potent antileukemic activity and various impacts on normal hematopoiesis. This will probably be a promising treatment for patients with relapsed/refractory AML.

AML；CD123；stem cells；immune-based therapies；CAR；T cells

2016-03-26,

2016-04-25

國家自然科學基金資助項目(No 81401293)；安徽高校省級自然科學研究重大項目(No KJ2014Z017)

張家奎(1988-)，男，博士生，研究方向：血液腫瘤的免疫治療，E-mail:6855585@sina.com；

翟志敏(1963-)，女，博士，主任醫師，博士生導師，研究方向：血液腫瘤的診斷與治療，通訊作者， E-mail:zzzm889@163.com

A

1001-1978(2016)08-1049-04

R-05；R392.11；R392.12；R733.720.5

網絡出版時間：2016-7-19 10:43網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160719.1043.008.html