白花前胡有效成分Pd-Ia對急性肺損傷的作用及機制研究

周曉霞,張建情,劉春曉,常　賀,鄒　軍，薛茂強

(廈門大學基礎醫學系，福建 廈門　361102)

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白花前胡有效成分Pd-Ia對急性肺損傷的作用及機制研究

周曉霞,張建情,劉春曉,常賀,鄒軍，薛茂強

(廈門大學基礎醫學系，福建 廈門361102)

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.08.026

目的探討白花前胡甲素(dl-praeruptorin,Pd-Ia)對脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導急性肺損傷的作用及其機制。方法氣管滴注LPS建立小鼠急性肺損傷模型，Pd-Ia腹腔注射進行干預治療，應用組織細胞染色及定量PCR、ELISA等方法評估Pd-Ia對急性肺損傷的作用。結果病理形態學顯示，Pd-Ia治療組炎性細胞浸潤明顯減輕，細胞染色也顯示BALF中炎性細胞數量明顯減少，定量PCR及ELISA結果顯示，Pd-Ia治療組抑制了肺組織中細胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β、趨化因子MIP-1α、MIP-2的表達。結論Pd-Ia治療可以明顯減輕肺部的炎癥反應，從而改善肺損傷。

急性呼吸窘迫綜合征; 急性肺損傷;脂多糖; 白花前胡甲素;炎癥; 細胞因子

急性肺損傷(ALI)是由于肺內外的多種因素如感染、創傷、休克及手術等引起的肺毛細血管炎癥損傷，通透性增加，并導致肺水腫和肺不張為病理特性的疾病，進一步發展可以形成急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)[1-2]。迄今為止，急性肺損傷的治療中仍無有效的臨床藥物，高發病率以及高死亡率一直是臨床研究的難點。

白花前胡是傘形科植物中藥前胡的一種，在臨床主要用于止咳平喘、緩解肺動脈高壓等[3]。白花前胡甲素(dl-praeruptorin,Pd-Ia)是白花前胡根中提取出來的吡喃香豆素成分，我們課題組前期研究發現，Pd-Ia在內皮細胞中能夠有效抑制脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導的炎癥反應[4]。本研究采用LPS誘導建立小鼠急性肺損傷模型，探討Pd-Ia對小鼠急性肺損傷的作用[5-10]，為急性肺損傷的臨床研究與治療提供新的思路與途徑。

1　材料

1.1動物健康的SPF級♂ 129品系小鼠30只，6～8周齡，體質量18～20 g, 購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物許可證號為SCXK(京)2002-003，飼養于廈門大學實驗動物中心，符合倫理學標準。

1.2藥品與試劑LPS 0111:B4(美國Sigma)，白花前胡甲素Pd-Ia(日本明治大學奧山轍教授惠贈)，TRIzol(美國 Invitrogen 公司)，逆轉錄試劑盒(德國Fermentas公司)，SYBR Green PCR混液(日本TaKaRa公司),ELISA試劑盒(中國欣博盛生物科技有限公司)，PCR引物(大連寶生物工程公司合成)。

2　方法

2.1急性肺損傷模型制作經過參考多種急性肺損傷模型制作方法[11-14]，以及結合本課題實際情況，模型具體制作方法如下：實驗動物隨機分為3組，每組10只，分別為：對照組、LPS組、LPS+Pd-Ia組，異氟烷麻醉小鼠后鼻腔滴注LPS(1 g·L-1)誘導急性肺損傷，40 μg·g-1，每只50 μL，體積用生理鹽水補足，對照組滴注50 μL生理鹽水。1 h后根據預實驗結果，選取最佳劑量給予Pd-Ia 10 μg·g-1腹腔注射, 對照組注射同等體積生理鹽水，24 h后處死小鼠，采集標本進行相關指標檢測。

2.2小鼠血液采集滅菌彎鑷摘取小鼠眼球后靠近EP管，待血液緩慢滴下500 μL，室溫靜置30 min后，常溫3 000 r·min-1離心20 min, 收集血清用于ELISA檢測。

2.3肺泡灌洗液小鼠處死后，仰臥于操作臺上，暴露氣管，酒精棉球消毒，灌洗分為單側和雙側，若為單側灌洗則還需要解剖胸部，結扎一側氣管。滯留針緩慢插入頸部氣管1/3處，預冷生理鹽水灌洗每次0.5 mL，灌洗2次。生理鹽水注入后可停留1 min,之后緩慢回吸2～3次，使灌洗更為充分，回收率>90%。灌洗液轉入EP管后立即置于冰上，BALF 1 000 r·min-1、4℃離心10 min，將所得上清12 000 r·min-1再次離心30 min，收集上清-80℃保存用于ELISA檢測。第1次離心所得細胞沉淀重懸后制作細胞涂片，吉姆薩染色后顯微鏡下觀察，對BALF中細胞進行分類計數。

2.4病理形態學采集采集小鼠雙側肺葉后，取右肺中葉，放入40 g·L-1多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中，固定48 h，組織脫水，石蠟包埋后切片，通過HE染色觀察肺組織病理學改變。

Tab 1　Primer sequence for Real time PCR

Fig 1　Effects of Pd-Ia on histopathological of lung tissue in different groups

A:Control;B:LPS;C:LPS+Pd-Ia

2.5肺組織中炎性因子檢測取左肺葉用DEPC水處理的剪刀剪碎后，取適量組織TRIzol法提取總RNA，取2 μg加1 μL primer-oligo(dT)，DEPC水補足12 μL, 65 ℃ 5 min預變性，結束后立即取出促冷，之后依次加入5×Reaction buffer 4 μL; RiboLock RNase Inhibitor 1 μL; 10 mmol·L-1dNTP Mix 2 μL; Revert Aid Reverse Transcriptase 1 μL,進行逆轉錄合成cDNA, 反應條件為： 42 ℃ 60 min;70℃ 5 min;95 ℃ 5 min;4 ℃保存。

取逆轉錄產物cDNA，進行Real time PCR，20 μL反應體系:cDNA 1 μL; SYBR Taq酶混合物10 μL; ROX 0.4 μL; Primer F 0.5 μL; Primer R 0.5 μL，滅菌水補足20 μL。反應條件為95 ℃ 1 min預變性;95 ℃ 15 s變性; 60 ℃ 31 s退火，共40個循環, 收集結果后，以GAPDH作為內參，采用相對定量ΔΔCt法分析結果，檢測肺組織中炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β及趨化因子MIP-1α、MIP-2表達變化。引物由大連寶生物工程公司合成，具體序列見Tab 1。2.6血清及BALF中細胞因子檢測ELSIA試劑盒檢測血清及BALF中IL-6、TNF-α含量，按照ELISA說明書操作，測定OD值，計算各細胞因子含量變化。

3　結果

3.1肺組織病理學HE染色對照組肺泡結構清晰，肺泡內未見滲出物，無出血、炎性細胞浸潤及水腫，肺泡間隔未出現增厚現象； LPS誘導組可見肺泡結構被嚴重破壞，出現大面積肺泡融合，并且可見大量的炎性細胞浸潤，肺泡間隔明顯增寬；與LPS誘導組相比，Pd-Ia組肺泡結構恢復完整，炎性細胞浸潤明顯減少，肺泡壁未見明顯增厚(Fig 1)。

3.2BALF中細胞數目的變化LPS誘導肺部炎癥爆發后，肺泡中的細胞種類以及數量出現明顯改變，可見對照組的細胞數量較少，大部分為巨噬細胞，LPS組炎性細胞數量明顯增加，且大多為中性粒細胞，Pd-Ia治療后炎性細胞總數明顯減少，中性粒細胞及巨噬細胞數量也明顯減少(Fig 2)。

3.3肺組織中炎性因子的基因表達變化Real time PCR的結果顯示，LPS誘導后，肺組織中細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α以及趨化因子MIP-1α、MIP-2的表達明顯增高；而Pd-Ia治療組明顯降低了這些細胞因子的表達，提示Pd-Ia對小鼠肺部炎癥損傷有保護作用(Fig 3)。

3.4血漿及BALF中細胞因子的蛋白表達變化ELISA的結果顯示，LPS組誘導了血漿以及 BALF 中炎性因子IL-6、TNF-α的表達；Pd-Ia治療組降低了IL-6與TNF-α的表達，顯示了Pd-Ia可以有效抑制LPS誘導的炎癥反應(Fig 4)。

4　討論

ARDS在臨床中是急性呼吸衰竭的主要因素，它的主要特點是爆發性的肺部炎癥，ALI屬于ARDS的早期階段[1-2]。LPS是革蘭陰性菌細胞壁中的一種成分，是造成急性肺損傷的重要因素之一。LPS進入肺組織后可以誘導炎癥反應，引起大量的免疫細胞聚集，分泌多種細胞因子，引起肺組織的損傷[15-16]。目前，急性肺損傷尚無有效的藥物治療方案，大多數研究都停留在體外以及動物實驗階段，因此尋找新的藥物治療肺損傷是當前急需解決的問題之一[17-18]。

Fig 2　Effects of Pd-Ia on inflammatory cell changes in BALF

A:Effects of Pd-Ia on total cells in BALF; B: Effects of Pd-Ia on neutrophils cells in BALF; C: Effects of Pd-Ia on macrophages cells in BALF.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsLPS

Fig 3Effects of Pd-Ia on mRNA expression of inflammatory cytokines in lung tissue

A:Effect of Pd-Ia on IL-6 mRNA expression;B: Effect of Pd-Ia on IL-1β mRNA expression;C:Effect of Pd-Ia on TNF-α mRNA expression; D:Effect of Pd-Ia on MIP-2 mRNA expression;E:Effect of Pd-Ia on MIP-1α mRNA expression.**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsLPS.

Fig 4　Effect of Pd-Ia on inflammatory cytokine changes in BALF and serum

A: Effect of Pd-Ia on IL-6 expression in BALF; B: Effect of Pd-Ia on TNF-α expression in BALF; C: Effect of Pd-Ia on IL-6 expression in serum; D: Effect of Pd-Ia on TNF-α expression in serum.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsLPS

白花前胡是傘形科植物，可用于清肺止咳、散風清熱、緩解肺動脈高壓等，在肺損傷的中醫藥治療中具有重要作用[19]。研究發現，在缺血/再灌注心肌損傷以及內皮細胞炎癥反應中均發揮較好的抗炎作用[4,20]。目前，Pd-Ia在急性肺損傷中的相關研究較少，作用尚不清楚。本研究通過LPS誘導小鼠急性肺損傷模型，探討Pd-Ia對急性肺損傷的作用及其機制。

急性肺損傷的發病機制涉及到多種炎性細胞以及炎性反應介質的釋放與調節[15-16]。肺部或者外周血中以及其他組織中的中性粒細胞、巨噬細胞的活化是炎癥反應的起始[21-23]，活化后引起TNF-α以及IL-1β的釋放，從而啟動炎癥的級聯反應。這兩種細胞因子具有多種功能，活化后不僅可以刺激中性粒細胞及單核巨噬細胞產生多種趨化因子以及其他的炎性介質，如IL-6、MIP-1α、MIP-2等，炎癥損傷部位血管內皮細胞中黏附分子表達上調，可以使更多的中性粒細胞黏附聚集在損傷部位，從而加重損傷。因此在本研究中，我們檢測了在急性肺損傷模型中Pd-Ia對相關炎性因子表達的影響，結果顯示，Pd-Ia能夠明顯降低IL-6、MIP-2等炎性因子的表達，從而發揮對肺損傷的改善作用。

綜上所述，我們發現Pd-Ia對于LPS誘導的急性肺損傷具有一定的治療作用，其機制可能與抑制相關炎性因子的表達及分泌有關。本文對Pd-Ia在急性肺損傷中的作用只做了初步探討，進一步探究Pd-Ia對急性肺損傷的作用機制，對于急性肺損傷的臨床治療將具有深遠意義。

(致謝:本研究在廈門大學醫學院成智樓102實驗室完成，感謝鄒軍副教授指導。)

[1]Caironi P, Langer T, Gattinoni L. Acute lung injury/acute respiratory distress syndrome pathophysiology: what we have learned from computed tomography scanning[J].CurrOpinCritCare, 2008, 14(1): 64-9.

[2]Ware L B. Pathophysiology of acute lung injury and the acute respiratory distress syndrome[J].SeminRespirCritCareMed,2006, 27(4): 337-49.

[3]劉瑛,韓恩鳳. 白花前胡對心肺功能的藥理作用[J].毒理學雜志,2007,21(4): 328.

[3]Liu Y, Han E F. The pharmacological effects of Bai hua qian hu for cardio-pulmonary function[J] .JToxicol,2007, 21(4): 328.

[4]王焱,楊翠,常賀,等.前胡甲素通過PPARα抑制LPS誘導的內皮細胞的炎癥反應[J].中國藥理學通報,2012,28(11): 1594-7.

[4]Wang Y, Yang C, Chang H, et al.Effects of Pd-Ia on LPS-induced inflammation in endotheliocyte via PPAR-α[J] .ChinPharmacolBull,2012, 28(11): 1594-7.

[5]Jiang W, Luo F, Lu Q, et al. The protective effect of Trillin LPS-induced acute lung injury by the regulations of inflammation and oxidative state[J].ChemBiolInteract,2016, 243:127-34.

[6]Kim J, Jeong S W, Quan H, et al. Effect of curcumin(Curcuma longa extract) on LPS-induced acute lung injury is mediated by the activation of AMPK[J].JAnesth,2016, 30(1): 100-8.

[7]劉丹丹,曹綱, 張琦,等. 三葉青黃酮經p38MAPK和NF-κB途徑抑制老年小鼠急性肺損傷[J].中國藥理學通報,2015,31(12): 1725-30.

[7]Liu D D, Cao G, Zhang Q, et al.Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg flavone inhibits lung linjury in aged mice through p38MAPK and NF-κB pathway[J] .ChinPharmacolBull,2015, 31(12): 1725-30.

[8]劉煥龍,朱忠寧,江平,等. Apelin/APJ系統在脂多糖誘導大鼠肺微血管內皮細胞損傷中的變化及其作用研究[J].中國藥理學通報,2015,31(8):1152-8.

[8]Liu H L, Zhu Z N, Jiang P, et al.The changes and effects of Apelin/APJ system in rat pulmonary microvascular endothelial cells injury induced by LPS[J] .ChinPharmacolBull,2015, 31(8): 1152-8.

[9]王宏,劉剛,符煒,等. Nrf2在丙泊酚抑制內毒素性急性肺損傷中的作用[J].中國藥理學通報,2013, 29(9):1286-90.

[9]Wang H, Liu G, Fu W,et al. The role of Nrf2 on propofol inhibits acute lung linjury induced by endotoxin[J] .ChinPharmacolBull,2013, 29(9):1286-90.

[10]徐秀娟,孫耕耘,尤青海,等. cAMP反應元件結合蛋白在LPS致肺微血管內皮細胞損傷過程中的作用[J].中國藥理學通報,2014,30(7):965-9.

[10]Xu X J, Sun G Y, You Q H, et al. Effects of cAMP responsive element binding protein in pulmonary microvascular endothelial cells injury induced by LPS[J] .ChinPharmacolBull,2014, 30(7):965-9.

[11]Niu N, Li B, Hu Y, et al. Protective effects of scoparone against lipopolysaccharide-induced acute lung injury[J].IntImmunopharmacol,2014, 23(1): 127-33.

[12]Tang Y, Chen Y, Chu Z, et al. Protective effect of cryptotanshinone on lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice[J].EurJPharmacol,2014, 723: 494-500.

[13]Yang H, Li Y, Huo P, et al. Protective effect of Jolkinolide B on LPS-induced mouse acute lung injury[J].IntImmunopharmacol,2015, 26(1): 119-24.

[14]黃建華, 李理,袁偉鋒,等. 脂多糖經不同給藥方式致急性肺損傷小鼠模型的比較研究[J].中國呼吸與危重監護雜志,2013, 12(3): 264-8.

[14]Huang J H, Li L, Yuan W F, et al. The comparative study on different method of dosing lipopolysaccharide to induce acute lung injury model in mice[J] .ChinJResCritCareMed,2013, 12(3): 264-8.

[15]Deng J C, Standiford T J. Growth factors and cytokines in acute lung injury[J].ComprPhysiol,2011, 1(1): 81-104.

[16]張青, 李 琦,毛寶齡, 等. 內毒素致傷大鼠肺組織促炎與抗炎細胞因子mRNA表達的時相性研究[J]. 中國危重病急救醫學, 2004, 16(10):585-8.

[16]Zhang Q, Li Q, Mao B L, et al. Studies on the expression of mRNA of anti-and pro-inflammatory cytokines in acute lung injury induced by lipopolysaccharide in rat[J].ChinCritCareMed,2004, 16(10): 585-8.

[17]Fang C L, Wen C J, Aljuffali I A, et al. Passive targeting of phosphatiosomes increases rolipram delivery to the lungs for treatment of acute lung injury: an animal study[J].JControlRelease,2015, 213: 69-78.

[18]Yang C, Jiang J, Yang X, et al. Stem/progenitor cells in endogenous repairing responses: new toolbox for the treatment of acute lung injury[J].JTranslatMed,2016, 14(1): 47.

[19]林冬杰. 白花前胡甲素的藥理作用研究進展[J].中國中醫藥現代遠程教育,2008, 6(7): 797-8.

[19]Lin D J.Progress in stuy onpharmacological effects of Pd-Ia[J] .ChinMedModDistanceEducChina，2008,6(7): 797-8.

[20]常天輝,章新華,邢軍,等. 白花前胡及前胡甲素對心肌缺血/再灌注大鼠IL-6水平及Fas、bax、bcl-2蛋白表達的影響[J].中國醫科大學學報,2003, 32(1): 1-6.

[20]Chang T H, Zhang X H, Xing J, et al. Effects of Pd-Ia on interleukin-6 level and Fas, bax, bcl-2 protein expression in ischemia-reperfusion myocardium[J] .JChinMedUniv,2003, 32(1):1-6.

[21]Bao S, Zou Y, Wang B, et al. Ginsenoside Rg1 improves lipopolysaccharide-induced acute lung injury by inhibiting inflammatory responses and modulating infiltration of M2 macrophages[J].IntImmunopharmacol,2015, 28(1): 429-34.

[22]Hu R, Chen Z F, Yan J, et al. Endoplasmic reticulum stress of neutrophils is required for ischemia/reperfusion-induced acute lung injury[J].JImmunol,2015, 195(10): 4802-9.

[23]Park D W, Jiang S, Liu Y, et al. GSK3beta-dependent inhibition of AMPK potentiates activation of neutrophils and macrophages and enhances severity of acute lung injury[J].AmJPhysiolLungCellMolPhysiol,2014, 307(10): L735-45.

Protective effect of Pd-Ia on LPS-induced mouse acute lung injury and its mechanism

ZHOU Xiao-xia, ZHANG Jian-qing,LIU Chun-xiao, CHANG He,ZOU Jun,XUE Mao-qiang

(DeptofBasicMedicalCollege,XiamenUniversity,XiamenFujian361102,China)

AimTo explore the protective effects of dl-praeruptorin(Pd-Ia) against acute lung injury induced by lipopolysaccharide(LPS).MethodsAcute lung injury model was induced by intranasal instillation LPS, and Pd-Ia was administered by intraperitoneal injection after 1 h of LPS exposure. Lung tissue samples were collected after 24 h of LPS administration to investigate the role of Pd-Ia in acute lung injury.ResultsPathomorpholoy showed a marked improvement of inflammatory cell infiltration in Pd-Ia treated group, cellular staining also indicated a marked decrease of inflammatory cells in BALF, and quantitative PCR and ELISA revealed a significant inhibition of cytokine IL-6,TNF-α,IL-1β, and chemokine MIP-1α,MIP-2 expression. Pd-Ia attenuated LPS-induced histological severities and TNF-α, IL-6, IL-1β,MIP-1α and MIP-2 production. ConclusionPd-Ia can alleviate the lung injury by ameliorating inflammation in lung.

ARDS; ALI; LPS; Pd-Ia; inflammation; cytokines

2016-03-01，

2016-04-07

國家自然科學基金資助項目(No 81270294);福建省高校省級自然科學基金項目(No 2013J01357)

周曉霞(1990-)，女，碩士，研究方向：藥理學，E-mail:zxx9012@sina.cn;

鄒軍(1971-)，男，博士，副教授，研究方向：藥理學，通訊作者，E-mail:zoujun@xmu.edu.cn；

A

1001-1978(2016)08-1165-06

R-332；R284.1；R322.35；R392.12；R563.022；R563.053.1

網絡出版時間：2016-7-19 10:43網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160719.1043.052.html

薛茂強(1964-)，男，博士，教授，研究方向：藥理學，通訊作者，E-mail:xmq8887@xmu.edu.cn