慢病毒介導的NGF基因沉默對PC12細胞分化的影響

竇夢云，何淑芳，黃　成，潘永露，張　野

(安徽醫科大學第二附屬醫院麻醉科，安徽 合肥　230601)

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慢病毒介導的NGF基因沉默對PC12細胞分化的影響

竇夢云，何淑芳，黃成，潘永露，張野

(安徽醫科大學第二附屬醫院麻醉科，安徽 合肥230601)

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.08.024

目的探討慢病毒介導的神經生長因子(nerve growth factor，NGF)基因沉默后對大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞(pheochromocytoma cell，PC12)分化的影響及其機制。方法構建NGF shRNA慢病毒載體。培養PC12細胞，隨機分為5組(n=3)：① 正常對照組(NC)：PC12細胞置于DMEM/HG細胞培養液和促感染試劑polybrene中培養；② 空病毒感染組(LV CON)：PC12細胞置于空病毒和polybrene中培養；③ 慢病毒NGF shRNA1感染組(LV shNGF1)：PC12細胞置于慢病毒NGF shRNA1和polybrene中培養；④ 慢病毒NGF shRNA2感染組(LV shNGF2)：PC12細胞置于慢病毒NGF shRNA2和polybrene中培養；⑤ 慢病毒NGF shRNA3感染組(LV shNGF3)：PC12細胞置于慢病毒NGF shRN3和polybrene中培養。處理結束后，熒光顯微鏡下檢測感染效率、熒光定量RT-PCR法檢測細胞 NGF mRNA表達水平、Western blot法檢測慢病毒感染后細胞NGF、細胞外信號調節激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2)和磷酸化-ERK1/2(phosphorylated ERK1/2，p- ERK1/2)蛋白表達，細胞增殖檢驗試劑(cell counting kit-8，CCK-8)檢測細胞活性，顯微鏡下觀察PC12細胞形態，統計細胞突起長度和最大細胞直徑。結果慢病毒感染PC12細胞的效率超過90%。與NC組相比，LV shNGF3組NGF mRNA表達降低(P<0.05)，NGF蛋白水平明顯降低(P<0.05)，ERK1/2蛋白表達和細胞活性無差異，p-ERK1/2蛋白表達有明顯下降(P<0.01)，細胞形態發生明顯變化，細胞突起長度和最大細胞直徑均變小(P<0.01)，細胞分化被抑制。結論慢病毒介導的NGF基因沉默通過抑制ERK1/2活化，影響PC12細胞分化。

慢病毒；NGF；基因沉默；PC12細胞；分化；ERK1/2

神經生長因子(nerve growth factor，NGF)是神經營養因子家族中重要一員，其在感覺神經和交感神經的生長發育中發揮著至關重要的作用[1]。大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞(pheochromocytoma cell，PC12)是大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞株，由于其可在NGF誘導下向交感神經元樣細胞分化，目前廣泛用于神經細胞功能等的研究。研究證實，NGF與細胞膜上受體酪氨酸激酶A(tyrosinekinase A，TrkA)結合，調節交感神經等的再生和分布[2]。同時，研究證實，細胞外信號調節激酶1/2 (extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2)參與了NGF誘導的PC12細胞分化。RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術是一種由內源性或外源性的雙鏈RNA介導的轉錄后基因沉默技術，目前廣泛應用于基因治療與研究[3]。短發卡RNA(short-hairpin RNA，shRNA)作為一種重要的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)，在使用慢病毒作為載體介導shRNA轉染時，對分裂期和非分裂期細胞均有很高的轉染效率[4]。本研究利用慢病毒介導shRNA 沉默NGF基因后，觀察其對PC12細胞活力和細胞轉化的影響，并探究ERK1/2在這一過程中發揮的作用。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株PC12來源于大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞(購自中科院上海細胞庫)。

1.1.2藥物與試劑慢病毒NGF-GFP(滴度：5×108TU·mL-1,分別為NGF shRNA1、NGF shRNA2、NGF shRNA3)、空病毒CON-GFP(滴度：1×109TU·mL-1)及促轉染試劑polybrene(5 mg·L-1)，由上海吉凱基因科技有限公司構建合成、提供(合同號：GIEL65719)。DMEM/HG細胞培養液購自美國Hy-clone公司；胎牛血清、0.25%胰酶消化液(含0.02% EDTA)購自加拿大Wisent公司；TRIzol購自美國Invitrogen公司；細胞增殖檢驗試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)購自日本同仁化學研究所；PVDF膜購自美國Bio-Rad公司；鼠抗β-actin單克隆抗體購自美國Santa Cruz生物技術公司，兔抗NGF多克隆抗體購自于英國Abcam公司，兔抗ERK1/2單克隆抗體和兔抗p-ERK1/2單克隆抗體均來自于美國Cell Signaling公司；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記羊抗兔、羊抗鼠抗體購自北京中杉生物技術公司；PrimeScriptTMRT reagent kit、SYBR?Premix Ex TaqTM均購自于日本TaKaRa公司；內參β-actin引物購自于上海生工公司，NGF引物購自廣州復能基因公司。

1.1.3儀器細胞培養箱(美國Thermo公司)；CXY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠)；Tanon Fine Do X6全自動化學發光圖像分析系統(上海天能科技有公司)；熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養PC12細胞株置于37 ℃、5% CO2培養箱(95%空氣)中，含10%胎牛血清的DMEM /HG完全培養液培養。細胞貼壁80%～90%時，用0.25%胰酶消化約1 min，計數，以1 ∶3的比例傳代，每2～3 d傳代1次。取對數生長期的細胞用于后續實驗。

1.2.2實驗分組及慢病毒感染PC12細胞以每孔105個接種于6孔培養板。細胞隨機分為5組：正常對照組(NC)、空病毒感染組(LV CON)、慢病毒NGF shRNA1感染組(LV shNGF1)、慢病毒NGF shRNA2感染組(LV shNGF2)、慢病毒NGF shRNA3感染組(LV shNGF3)。種板12 h后，除NC組以含10%胎牛血清的DMEM/HG培養基、polybrene(終濃度為2.5 mg·L-1)處理外，其余各組均以含10%胎牛血清的DMEM/HG培養基、polybrene(終濃度為2.5 mg·L-1)及相應感染復數(multiplicity of infection，MOI)為20的慢病毒進行感染，24 h后換用含10%胎牛血清的DMEM/HG完全培養基正常培養。每組3個復孔。

1.2.3熒光顯微鏡檢測感染效率按照上述方法進行分組和慢病毒感染細胞72 h后，熒光顯微鏡下觀察表達綠色熒光蛋白(green fluorescence protein，GFP)的細胞數目，根據GFP表達情況判斷感染效率。感染效率(熒光率)大于90%，說明已篩選出穩定表達的細胞系。

1.2.4熒光定量RT-PCR檢測NGF mRNA表達水平慢病毒感染96 h后，棄培養液，4 ℃預冷PBS清洗細胞，按照RNA提取試劑TRIzol的說明書進行操作，每孔加800 μL TRIzol置于冰上裂解10 min，提取細胞總RNA。經氯仿萃取，異丙醇法沉淀，75%無酶乙醇洗滌法濃縮，DEPC水溶解后，用紫外分光光度計檢測總RNA的濃度和純度，制成RNA樣品。按照PrimeScriptTMRT reagent kit試劑盒說明書進行逆轉錄，用于檢測NGF和內參β-actin mRNA (NGF引物序列保密)。β-actin引物：上游引物5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’，下游引物5’-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3’。逆轉錄反應條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。采用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒進行PCR擴增反應，PCR擴增程序設定為：95 ℃預變性30 s，95 ℃ 3 s, 60 ℃ 30 s，重復40個循環進行擴增；反應結束后建立熔解曲線。采用StepOne Software v 2.3軟件進行數據分析。同一實驗重復3次，實驗數據分析采用2-△△CT法計算。

1.2.5Western blot法檢測蛋白表達水平細胞感染72 h后，1 ∶3傳代，接種于6孔培養板，繼續培養48 h后，棄培養液。4 ℃預冷PBS清洗細胞，培養板內加入蛋白裂解液充分裂解細胞，冰上靜置30 min后，15 000 r·min-14 ℃離心10 min后，吸取上清，BCA法測定樣品蛋白含量后分裝保存。每組取20 μg蛋白行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳后將蛋白轉移至PVDF膜。將PVDF膜在封閉液(含5%脫脂牛奶的TBST溶液)中室溫孵育2 h，隨后置于兔抗NGF多克隆抗體、兔抗ERK1/2單克隆抗體、兔抗p-ERK1/2單克隆抗體或鼠抗β-actin單克隆抗體中，4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗膜3次，每次5 min；再將膜置入HRP標記的二抗中室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min；采用ECL發光試劑盒，在Tanon全自動凝膠成像系統中自動曝光采集圖像，并進行條帶光密度分析。

1.2.6CCK-8法檢測細胞活性取對數生長期PC12細胞，以每孔104個接種于96孔培養板，置于37 ℃、5% CO2培養箱中。按上述方法進行分組及慢病毒感染，分別于轉染后24、48、72 h檢測吸光度。每孔加入10 μL CCK-8溶液(加入的體積為原來培養體積的10% )，細胞培養箱內繼續孵育4 h后，置于酶標儀上450 nm測定各組吸光度。在不含細胞的培養液中加入等量CCK-8溶液，按相同方法測定吸光度作為空白對照孔。細胞活力=測定孔的吸光度-空白對照孔吸光度，并計算平均值。實驗獨立重復3次。

1.2.7細胞分化程度測定慢病毒感染72 h后，顯微鏡下觀察NC組、LV CON組和LV shNGF3組細胞形態并攝片。采用Image J2圖像分析軟件測量每組細胞突起長度和最大細胞直徑。同一細胞至少重復統計3次。

2.1熒光顯微鏡檢測細胞感染效率細胞感染72 h后，熒光顯微鏡下觀察可見大量綠色熒光顆粒，細胞表達GFP蛋白，見Fig 1A。與同一視野下明場相比，表達GFP細胞超過90%，見Fig 1 B，說明已建立穩定表達的細胞系。

Fig 1　Lentivirus transfection efficiency in PC12 cells

A:GFP expression of lentivirus infected PC12 cells under fluorescent microscope;B:Cells under bright field of optical microscope

2.2慢病毒LV shNGF3可有效抑制NGF mRNA表達熒光定量RT-PCR檢測結果顯示，LV shNGF3組NGF mRNA表達明顯降低，是NC組的(13±4)%(P<0.05)，差異有統計學意義，見Fig 2。

Fig 2　LV shNGF3 restrained NGF

*P<0.05vsNC group

2.3慢病毒LV shNGF3可有效抑制NGF蛋白表達Western blot結果顯示，LV shNGF3 NGF蛋白表達水平明顯降低，是NC組的(38±19)%(P<0.05)，差異有統計學意義，見Fig 3。說明慢病毒LV shNGF3可有效抑制NGF蛋白的表達。

2.4NGF表達抑制未明顯影響PC12細胞活性與NC組相比，LV shNGF3組細胞活性差異無統計學意義，見Fig 4。說明慢病毒感染介導NGF基因沉默未影響PC12細胞活性。

Fig 3　LV shNGF3 decreased NGF protein

*P<0.05vsNC group

Fig 4　Lentivirus mediated NGF shRNA transfection

2.5NGF表達降低抑制PC12細胞分化NGF表達抑制后，PC12細胞形態發生明顯變化，見Fig 5A。NC組和LV CON組PC12細胞胞體呈圓形、長梭形，兩極有長突起，細胞折光性較強，細胞間形成網絡狀結構。LV shNGF3組NGF表達抑制后，PC12細胞胞體呈三角形、多角形，細胞除兩極有軸突樣突起外，有的細胞質伸出其他突起，突起長度明顯縮短，細胞折光性降低。與NC組相比，LV CON組細胞突起長度和最大細胞直徑無差異，而LV shNGF3組細胞突起長度和最大細胞直徑均明顯縮短(P<0.01)，差異有統計學意義，見Fig 5B。說明慢病毒轉染對PC12細胞分化未產生明顯影響，而NGF表達降低明顯抑制了PC12細胞的分化。

Fig 5　LV shNGF3 inhibited differentiation of PC12 ±s,n=3)

A：The morphology of PC12 cells;B:The length of neuritis and max diameter of cells were strained in LV shNGF3 group than that in NC group.**P<0.01vsNC group

2.6NGF表達抑制對PC12細胞ERK1/2蛋白、p-ERK1/2蛋白表達的影響ERK蛋白以及p-ERK1/2是絲裂素活化蛋白激酶(mitogen-activted protein kinase, MAPK)信號通路的重要蛋白。Western blot結果顯示，NC組、LV CON組和LV shNGF3組ERK1/2蛋白表達無差異。而與NC相比，LV shNGF3組p-ERK1/2蛋白表達下降了85.2%(P<0.01)，差異有統計學意義，見Fig 6。說明NGF表達抑制后，通過抑制p-ERK1/2表達影響PC12細胞分化。

3　討論

慢病毒是一種以人類免疫缺陷病毒-1(human immunodeficiency virus-1，HIV-1)為基礎構建的新型載體系統，因其對分裂期和非分裂期細胞均有很高的轉染效率，廣泛應用于基因轉染和基因治療等[5]。shRNA在利用慢病毒為載體時，shRNA可整合到細胞基因組中。shRNA在細胞內通過一系列酶的作用后，通過堿基互補配對，以序列特異性的方式結合到靶mRNA，從而抑制靶基因的表達[6]。故shRNA在體內抑制靶基因的表達具有很高的特異性[7]。polybrene是一種陽離子聚合物，可以促進慢病毒包膜與細胞膜的相互作用，協助慢病毒對細胞膜的感染過程。本實驗參照預實驗結果，在polybrene協助下以MOI=20進行感染。結果證實，此感染復數下可以建立穩定表達的細胞系，并且NGF LV shRNA3可以有效抑制NGF mRNA和蛋白的表達(P<0.05)。實驗過程中，LV shNGF2組NGF蛋白相比于NC組降低，差異無統計學意義，但LV shNGF2組NGF mRNA表達卻明顯升高?？赡苡捎贜GF LV shRNA2未能與其特異靶序列相結合，并通過影響內源性微小RNA(micro RNA，miRNA)，產生脫靶效應，從而影響細胞NGF mRNA和蛋白的表達[8]。

Fig 6　Lentivirus mediated NGF gene silencing decreased

A: Western blot analysis of ERK1/2, p-ERK1/2 and β-actin protein;B: The relative protein expression of ERK1/2 and p-ERK1/2 bands were normalized to β-actin.**P<0.01vsNC group

NGF是神經營養因子家族中重要一員，通過作用于高親和力受體TrkA和低親和力受體(p75 neurotrophin receptor，P75NTR)調控中樞及周圍神經的生長、發育和再生等[2]。最近研究表明，NGF除了具有神經營養作用以外，還可增加初級傳入神經元對傷害性刺激的敏感性，在神經元傷害感受信號傳導過程中發揮重要作用[9]。NGF通過與TrkA結合，導致自身酪氨酸殘基磷酸化，逆轉運至胞質，產生多種信號分子，并將信號傳遞至細胞核，調控細胞的基因表達、代謝等，從而影響細胞分化[10]。近年來研究證實，NGF可以促進PC12細胞向神經元分化，并呈濃度相關性[11]。細胞最長突起長度和最大細胞直徑可以作為評價PC12細胞分化程度的指標。本研究通過慢病毒介導的NGF表達沉默后，PC12細胞突起長度和最大細胞直徑突起長度均明顯縮短，細胞分化程度降低，差異具有統計學意義(P<0.01)。證實NGF表達降低抑制了PC12細胞向神經元分化。

MAPK信號通路在細胞增殖、分化、再生等方面發揮著至關重要的作用[12]。ERK1/2是MAPK信號通路中重要的蛋白，磷酸化后的ERK1/2通過Ras-Raf-MEK-ERK級聯通路將信號從胞質轉運至胞核，參與調控細胞的增殖和分化等多種生理功能[13]。近來研究表明[14]，ERK1/2蛋白在NGF誘導的PC12細胞分化早期活化增加。推測ERK1/2早期活化可能為NGF誘導的PC12分化提供了起始信號。其后，活化的ERK1/2被降解，避免了長時間過度刺激對細胞的不良影響。本研究通過慢病毒介導NGF shRNA轉染入PC12細胞，特異性并長期穩定地抑制PC12細胞NGF表達，從而導致了ERK1/2蛋白活化被長期抑制。

綜上所述，本實驗證實，慢病毒介導的NGF基因沉默通過抑制ERK1/2活化，影響PC12細胞分化，為進一步研究體內NGF基因沉默對神經元功能和傷害感受信號傳導的影響，提供了實驗基礎和理論依據。

(致謝：感謝安徽醫科大學第二附屬醫院中心實驗室為本課題研究提供儀器設備和技術支持。)

[1]Zheng L R, Zhang Y Y, Han J, et al. Nerve growth factor rescues diabetic mice heart after ischemia/reperfusion injury via up-regulation of the TRPV1 receptor[J].JDiabetesComplications, 2015, 29(3):323-8.

[2]Marlin M C, Li G. Biogenesis and function of the NGF/TrkA signaling endosome[J].IntRevCellMolBiol, 2015, 314(6):239-57.

[3]Guzman-Aranguez A, Loma P, Pintor J. Small-interfering RNAs (siRNAs) as a promising tool for ocular therapy[J].BrJPharmacol, 2013,170(4) :730-47.

[4]Hu Q, Chen C, Khatibi N H, et al. Lentivirus-mediated transfer of MMP-9 shRNA provides neuroprotection following focal ischemic brain injury in rats[J].BrainRes, 2011, 1367(3):347-59.

[5]嚴建平, 李亞清, 鐘暉,等. 慢病毒介導的解整合素-金屬蛋白酶17 RNA干擾對氣道上皮細胞MMP-9表達及NF-κB活性的影響[J]. 中國藥理學通報, 2014,30(4):559-65.

[5]Yan J P, Li Y Q, Zhong H, et al. Lentivirus-mediated shRNA interference targeting ADAM17 down-regulates MMP-9 expression in airway epithelial cells via TNF-α/NF-κB signaling[J].ChinPharmacolBull, 2014,30(4):559-65.

[6]Singer O, Verma I M. Applications of lentiviral vectors for shRNA delivery and transgenesis[J].CurrGeneTher, 2008, 8(6):483-8.

[7]Yu S Q,Wang D H.Enhanced salt sensitivity following shRNA silencing of neuronal TRPV1 in rat spinal cord[J].ActaPharmacolSin, 2011, 32(6):845-52.

[8]Fellmann C, Lowe S W. Stable RNA interference rules for silencing[J].NatCellBiol, 2014, 16(16):10-8.

[9]Mills C D, Nguyen T, Tanga F Y,et al. Characterization of nerve growth factor-induced mechanical and thermal hypersensitivity in rats[J].EurJPain, 2012,17(4): 469-79.

[10]Hirose M, Kuroda Y, Murata E. NGF/TrkA signaling as a therapeutic target for pain[J].PainPract, 2016,16(2):175-82.

[11]王秀力, 陳東, 劉佳梅. NGF誘導PC12細胞向神經元的分化[J]. 吉林大學學報：醫學版,2007, 33(5):827-30.

[11]Wang X L, Chen D, Liu J M.Differentiation of PC12 cells into neurons induced by NGF[J].JilinUnivJ(MedEd), 2007, 33(5):827-30.

[12]Beverly E, Lior V, Eintou F, et al. Pheromone-induced morphogenesis and gradient tracking are dependent on the MAPK Fus3 binding to Gα[J].MolBiolCell, 2015, 26(18):3343-58.

[13]Park Y J,Lee J M,Shin S Y, Kim Y H. Constitutively active Ras negatively regulates Erk MAP kinase through induction of MAP kinase phosphatase 3(MKP3) in NIH3T3 cells[J].BMBRep, 2014, 47(12):685-90.

[14]Ryu H, Chung M, Dobrzynski M, et al.Frequency modulation of ERK activation dynamics rewires cell fate[J].MolSystBiol,2015,11(11):838-52.

Lentivirus-mediated NGF gene silencing inhibited differentiation of PC12 Cells

DOU Meng-yun, HE Shu-fang, HUANG Cheng, PAN Yong-lu, ZHANG Ye

(DeptofAnesthesiology,theSecondAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity，Hefei230601,China)

AimTo investigate the effects of lentivirus mediated nerve growth factor(NGF) gene silencing on pheochromocytoma cells(PC12) and the possible mechanisms.MethodsThe NGF shRNA expression vector was constructed. PC12 cells were randomly divi-ded into five groups(n=3 each) as follows:negative control group(NC), control lentivirus group(LV CON), lentivirus NGF shRNA1 group(LV shNGF1), lentivirus NGF shRNA2 group(LV shNGF2), lentivirus NGF shRNA3 group(LV shNGF3). The cells in NC group were cultured in DMEM/HG and polybrene medium, while others were cultured in DMEM/HG, polybrene and corresponding lentivirus medium. After the treatment, the infection efficiency was determined by fluorescent microscope. Relative expression of NGF, extracellular signal-regulated kinase(ERK1/2) and p-ERK1/2 were assessed by Western blot. The expression of NGF mRNA was analyzed by quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(qRT-PCR). The differentiation degree was valued according to the length of neuritis and max diameter of cells. The cell viability was detected by CCK-8.ResultsThe infection efficiency in PC12 cells reached over 90%. Compared with NC group, the relative expression of NGF mRNA and NGF protein was significantly down-regulated(P<0.05).There was no difference in the expression of ERK1/2 protein and cell viability. The expression of p-ERK1/2 protein was markedly down-regulated in LV shNGF3 group(P<0.01).The cells morphology was changed, and the length of neuritis and max diameter of cells were strained in LV shNGF3 group than those in NC group(P<0.01).ConclusionLentivirus-mediated NGF gene silencing inhibits the differentiation of PC12 cells through suppressing the activation of ERK1/2.

lentivirus; NGF; gene silencing; pheochromocytoma cell; differentiation;extracellular signal-regulated kinase

2016-04-17，

2016-05-10

國家自然科學基金資助項目(No 81471145)

竇夢云(1993-)，女，碩士生，研究方向：麻醉藥理學，E-mail: 1570122622@qq.com；

張野(1968-)，男，博士，教授，主任醫師，博士生導師，研究方向：麻醉藥理學，通訊作者，E-mail: zhangye_hassan@sina.com

A

1001-1978(2016)08-1153-06

R373.9；R329.24；R394.2；R977.6

網絡出版時間：2016-7-19 10:43網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160719.1043.048.html