果膠阿霉素對大鼠心臟毒性的研究

彭　琳,唐小海, 嚴　偉,冉茂盛,張雪梅,,范　菲,

(1.四川師范大學生命科學學院，四川 成都　610101；2.重慶萊美藥業股份有限公司, 重慶　401336)

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果膠阿霉素對大鼠心臟毒性的研究

彭琳1，2,唐小海1，2, 嚴偉1,冉茂盛2,張雪梅1,2,范菲1,2

(1.四川師范大學生命科學學院，四川 成都610101；2.重慶萊美藥業股份有限公司, 重慶401336)

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.08.009

目的考察果膠阿霉素(PAC)對大鼠心臟毒性的影響。方法50只大鼠隨機分成5組，每組10只。阿霉素(ADM)組腹腔注射3 mg·kg-1，隔天給藥1次，連續給藥6次；PAC組分別腹腔注射ADM當量1.5、3、6 mg·kg-1，隔天給藥1次，連續給藥6次；對照組腹腔注射生理鹽水3 mg·kg-1，隔天給藥1次，連續給藥6次。給藥后48 h處死大鼠，檢測大鼠超聲心動圖、心肌酶、心臟組織中氧化應激水平及心臟組織病理學的變化。同時建立S180腹水瘤模型，檢測PAC的抗腫瘤作用。結果ADM組大鼠存活率為50%，PAC各組大鼠存活率為100%；PAC能不同程度增加大鼠體重、心臟指數及免疫指數；增加HR、EF、FS，減小LVIDd、LVIDs；降低血清中AST、LDH、CK、CK-MB活性；增加心肌組織中GSH-Px、SOD活性，降低MDA含量；改善病理學變化；PAC能明顯降低腹水的生長，延長小鼠生存期。結論PAC能有效改善心臟毒性，提高大鼠存活率，改善免疫能力及心功能，改善心肌酶和氧化應激，減少心肌細胞損傷，而且有明顯的抗腫瘤作用。

阿霉素；果膠阿霉素；心臟毒性；超聲心動圖；心肌酶；氧化應激水平；病理學變化；抗腫瘤活性

阿霉素(ADM)是目前應用最廣泛的抗腫瘤藥物之一，對各種生長周期的腫瘤均有殺傷效果[1]。但是，ADM在達到抗癌療效的同時也產生嚴重的心臟毒性[2-4]。為了減小ADM毒副作用，利用靶向給藥系統將藥物選擇性地釋放到特定的組織或細胞，保持靶點藥物濃度，減少心臟毒性。果膠是從植物細胞壁提取的物質，是一種生物組織相容性極好的天然高分子物質，在體內性質穩定，不降解，具有來源豐富、安全、無毒等優點，用其作為靶向給藥的載體有著非常廣闊的應用前景[5]。將小分子果膠與抗癌藥物阿霉素通過酰胺鍵[6]共價結合形成的高分子抗癌前藥果膠阿霉素(PAC)，其藥理作用主要由于EPR效應及腫瘤細胞的吞噬作用，該高分子軛合物在腫瘤細胞大量累積，并通過溶酶體酶的作用使共價鍵斷裂，釋放游離阿霉素，進而靶向作用于腫瘤細胞。PAC腹腔給藥后，血中游離阿霉素濃度大大降低，且心肌組織中溶酶體數量少于其他組織，因此能達到減少心臟毒性的目的。

1　材料與方法

1.1實驗動物與實驗材料SD大鼠，♀，體質量280～320 g，(成都達碩實驗動物有限公司，合格證號：0016465)；KM小鼠，♀，20～22 g，(成都達碩實驗動物有限公司，合格證號：0016465)；果膠阿霉素(PAC)由實驗室合成；注射用鹽酸多柔比星(浙江海正藥業股份有限公司，批號：H20100406)；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測試盒(南京建成生物工程研究所，批號：20141108)、超氧化物歧化酶(SOD)測試盒(南京建成生物工程研究所，批號：20141108)、丙二醛(MDA)測試盒(南京建成生物工程研究所，批號：20141107)；可見紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限公司,型號：TU-1810)；全自動生化分析儀(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司，型號：BS-480)。

1.2方法

1.2.1大鼠心臟毒性造模50只大鼠隨機分成5組，分別為ADM組、PAC低劑量組、PAC中劑量組、PAC高劑量組和對照組。每組給藥劑量分別為：ADM腹腔注射3 mg·kg-1，隔天給藥1次，連續給藥6次，累積劑量為18 mg·kg-1[7]；PAC分別腹腔注射ADM當量1.5、3、6 mg·kg-1，隔天給藥1次，連續給藥6次，累積劑量分別含ADM當量9、18、36 mg·kg-1；對照組給予同體積的生理鹽水。

1.2.2超聲心動圖檢測造模完成后48 h，稱體重后腹腔注射100 g·L-1水合氯醛麻醉大鼠，將大鼠左胸去毛，固定大鼠四肢，左胸前涂少量耦合劑，將探頭置于左胸前，調整深度為2.0～2.5 cm，獲得左室短軸各切面，記錄乳頭肌水平的M型曲線，并進行測量。觀測指標包括：左室舒張末期內徑(LVIDd)、左室收縮末期內徑(LVIDs)、心率(HR)、左室射血分數(EF)、左室短軸縮短率(FS)。

1.2.3大鼠體重變化百分比、心臟指數、存活率檢查完超聲心動圖后處死大鼠，分離大鼠心臟并稱重，計算大鼠體重變化百分比、心臟指數，統計大鼠存活率。

大鼠體重變化百分比/%=(最終體重-最初體重)/最初體重×100

心臟指數/%=心臟重量/最終體重×100

存活率/%=存活大鼠數量/起始大鼠數量×100

1.2.4免疫器官臟器系數的測定處死大鼠后，分離大鼠脾臟及胸腺并稱重，計算臟器系數。

脾臟系數/%= 脾臟重量/最終體重×100

胸腺系數/%=胸腺重量/最終體重×100

1.2.5心肌酶譜檢測[8]采用全自動生化分析儀測定血清中肌酸肌酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)以及乳酸脫氫酶(LDH)活性。

1.2.6氧化應激水平檢測取心肌組織稱重，加入組織重量9倍體積的生理鹽水，勻漿，制備100 g·L-1的組織勻漿液。 硫代巴比妥酸法檢測MDA含量，硫代二硝基苯甲酸顯色法測定GSH-Px活力，黃嘌呤氧化酶法測定SOD活力。

1.2.7病理學檢查取心室部分，用體積分數為0.1的中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋切片，HE染色，乙醇脫水，透明，封片，鏡檢觀察大鼠心肌組織病理學變化。

1.2.8PAC對S180腹水瘤的抗腫瘤活性100只KM小鼠腹腔接種106個細胞。3 d后，將小鼠隨機分為5組，每組各20只：ADM組、PAC低劑量組、PAC中劑量組、PAC高劑量組和對照組，分別按照ADM 2.5 mg·kg-1、PAC 2.5 mg·kg-1、PAC 5 mg·kg-1、PAC 10 mg·kg-1、 對照組(等體積生理鹽水)腹腔給藥，3 d后重復上述方式再次給藥，即累積劑量分別是ADM 5 mg·kg-1、PAC 5 mg·kg-1、PAC 10 mg·kg-1、PAC 20 mg·kg-1。給完藥3 d后，各組斷頸處死10只小鼠，收取腹水并稱重，計算各組小鼠腹水量。每組剩余的10只小鼠繼續飼養，觀察生存期。

2　結果

2.1超聲心動圖檢測如Tab 1所示，與對照組相比，ADM組HR、EF、FS明顯降低(P<0.01)，LVIDd、LVIDs明顯增加(P<0.01)。與ADM組相比，PAC各劑量組心功能均有明顯改善，其中PAC 9 mg·kg-1組HR、EF、FS明顯增加(P<0.01)，LVIDd、LVIDs明顯降低(P<0.01)；PAC 18 mg·kg-1組HR、FS明顯增加(P<0.01)，EF明顯增加(P<0.05)，LVIDd、LVIDs明顯降低(P<0.01)；PAC 36 mg·kg-1組FS明顯增加(P<0.01)，HR明顯增加(P<0.05)。

2.2大鼠存活率、體重和臟器指數的變化如Tab 2所示，對照組及PAC各組大鼠全部存活，ADM組大鼠死亡一半。ADM組體重變化百分比、心臟指數、脾臟指數、胸腺指數與對照組相比明顯降低(P<0.01)。與ADM組相比，PAC 9 mg·kg-1組與PAC 18 mg·kg-1組的體重變化百分比、心臟指數、脾臟指數、胸腺指數均有明顯增高(P<0.01)；PAC 36 mg·kg-1組與ADM組相比，心臟指數、胸腺指數明顯增高(P<0.01)，體重變化百分比明顯增高(P<0.05)。

2.3心肌酶含量ADM組大鼠血清中CK、CK-MB、LDH和AST與對照組相比有明顯增高(P<0.01)。與ADM組相比，PAC 9 mg·kg-1組CK、CK-MB、LDH、AST明顯降低(P<0.01)；PAC 18 mg·kg-1與ADM組相比，CK-MB、LDH、AST明顯降低(P<0.01)，CK明顯降低(P<0.05)；PAC 36 mg·kg-1組對比ADM組，AST明顯降低(P<0.01)，CK及LDH明顯降低(P<0.05)。見Fig 1。

2.4心肌細胞氧化應激水平對比對照組的GSH-Px、SOD及MDA，ADM組GSH-Px、SOD明顯降低，而MDA明顯升高(P<0.01)。與ADM組相比，PAC 9 mg·kg-1和PAC 18 mg·kg-1組GSH-Px、SOD明顯上升，MDA明顯下降(P<0.01)；PAC 36 mg·kg-1組與ADM組相比，MDA明顯下降(P<0.01)，GSH-Px、SOD明顯上升(P<0.05)。見Fig 2。

GroupHR/BPMEF%FS%LVIDd/mmLVIDs/mmControl370.00±10.5784.70±4.7949.12±2.2357.30±1.4229.50±2.22ADM18mg·kg-1326.10±16.04##64.40±7.20##32.52±3.91##67.60±2.17##46.40±3.17##PAC9mg·kg-1367.60±7.37**80.40±6.85**47.04±3.66**59.20±2.04**32.30±3.02**PAC18mg·kg-1355.90±11.07**73.50±8.65*43.59±4.70**63.20±1.81**35.90±3.87**PAC36mg·kg-1344.00±15.59*68.30±8.6539.54±5.69**66.20±1.9945.20±2.53

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsADM

GroupSurvivalrate/%Weightpercentagechange/%Cardiacindex/%Spleenindex/%Thymusindex/%Control1006.18±3.420.30±0.110.16±0.120.10±0.11ADM18mg·kg-150-22.08±5.45##0.24±0.10##0.10±0.14##0.03±0.14##PAC9mg·kg-11003.42±4.61**0.29±0.12**0.15±0.16**0.09±0.15**PAC18mg·kg-1100-5.48±5.59**0.28±0.15**0.13±0.17**0.07±0.15**PAC36mg·kg-1100-15.42±4.45*0.26±0.22**0.12±0.100.06±0.18**

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01.vsADM

Fig 1　Effect of PAC on serum CK (A),CK-MB (B),LDH(C),AST(D)

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsADM

2.5病理學變化如Fig 3所示，光鏡下觀察對照組心外膜完整，未見纖維組織增生；肌層肌纖維無肥大萎縮變細，無肌肉纖維斷裂、波浪變性，心肌細胞無水樣，空泡、脂肪變性，細胞核居中，結構清晰，肌纖維未見壞死及瘢痕組織形成；未見炎細胞浸潤及纖維結締組織增生，心內膜內皮細胞完好。ADM組心肌細胞局灶性水腫，心肌纖維排列紊亂，間隙增大、變性、部分溶解壞死，間質水腫，毛細血管擴張。PAC組大鼠心肌損傷呈劑量效應，但均比ADM損傷程度低，其中PAC 9 mg·kg-1組組織結構基本正常，PAC 18 mg·kg-1組心肌細胞局灶狀水腫，PAC 36 mg·kg-1組心肌細胞局灶狀水腫，心肌纖維排列紊亂，間隙增大。

2.6PAC的抗腫瘤作用相比陰性組產生的腹水量(9.82±2.34) g，ADM 5 mg·kg-1組腹水為(0.29±0.37) g(P<0.01)，PAC 3個劑量組與陰性對照組相比也能不同程度地抑制腹水的產生，其中PAC 5 mg·kg-1、PAC 10 mg·kg-1、PAC 20 mg·kg-1分別產生腹水(4.36±0.79) g、(0.73±0.46) g、0 g(P<0.01)。各組剩余的10只小鼠中，陰性組小鼠在23 d內全部死亡，ADM組小鼠死亡3只，PAC 5 mg·kg-1、PAC 10 mg·kg-1、PAC 20 mg·kg-1分別死亡5只、2只、0只。見Fig 4。

Fig 2　Effects of PAC on GSH-Px (A), SOD (B) and MDA (C)

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsADM

3　討論

一般情況下，心肌細胞內存在完整的氧化抗氧化系統，它們的平衡保證了機體的正常運作。由于ADM進入心肌細胞后通過代謝產生大量自由基，消耗機體的抗氧化酶SOD、GSH-Px等， 使抗氧化能力降低，心肌細胞膜系統磷脂中多不飽和脂肪酸逐漸形成脂質自由基，引起脂質過氧化。使膜結構發生改變，并影響膜功能蛋白的位置和構型，破壞膜的完整性，導致心肌細胞損傷[9-13]。PAC腹腔給藥后，主要分布于網狀巨噬系統器官中，心臟中藥物濃度明顯降低，同時進入循環系統的藥物大大減少，因此能減少藥物對心肌的損傷。研究中發現多次腹腔注射高分子靶向藥物PAC后，能提高抗氧化酶的活性，清除過量的自由基，減輕過氧化反應產物聚積而導致的脂質過氧化產物的形成，從而降低對大鼠的氧化損傷，保護心肌細胞膜的完整性，降低心臟毒性。同時，由于EPR效應和腫瘤細胞對大分子藥物的吞噬作用，使藥物在腫瘤細胞大量積累，提高選擇性和利用率，使得PAC也能很好地抑制腫瘤細胞的生長，提高小鼠生存期。PAC在減小藥物心臟毒性的同時擁有良好的抗腫瘤作用，因此，臨床上有望通過增加藥物劑量提高其抗腫瘤效果并改善患者生活質量，這使PAC有更深一步深入研究和開發的意義和價值。

Fig 3　Effect of PAC on cardiac histology in rats

A:Control group;B:ADM 18 mg·kg-1group;C：PAC 9 mg·kg-1group;D：PAC 18 mg·kg-1group;E：PAC 36 mg·kg-1group

Fig 4　Effects of PAC on S180 ascites (A) and survival period (B) of mice

**P<0.01vscontrol

(致謝：本實驗于川大萊美聯合實驗室完成，在此對本實驗做出貢獻的所有人員給予誠摯的感謝。)

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Study of pectin-adriamycin conjugate to cardiac toxicity in rats

PENG Lin1,2, TANG Xiao-hai1,2，YAN Wei1, RAN Mao-sheng2, ZHANG Xue-mei1,2， FAN Fei1,2

(1.CollegeofLifeScience,SichuanNormalUniversity,Chengdu610101,China;2.ChongqingLummyPharmaceuticalCo.Ltd,Chongqing401336,China)

AimTo study the effect of pectin-adriamycin conjugate(PAC) on cardiac toxicity.Methods50 female SD rats were randomly divided into 5 groups with 10 animals in each group. Adriamycin(ADM) group received 3 mg·kg-1, ip, every other day for 6 times.PAC group received ADM equivalent 1.5,3 and 6 mg·kg-1, ip, every other day for 6 times. Control group received normal saline parallel to ADM. Rats were sacrificed and the echocardiogram, cardiac enzymes，the oxidative stress levels in myocardial cells and histopathological changes after 48 h administration were detected. S180 ascites tumor bearing mice models were established to investigate the antitumor activity of PAC.ResultsThe survival rate of ADM group was 50% and that of PAC each group was 100%. PAC could significantly increase body weight，heart index and immune index and increase HR,EF,FS,reduce LVIDd,LVIDs. PAC could also significantly increase the AST, LDH, CK, CK-MB level in serum.GSH-Px and SOD activities of PAC group were significantly increased and MDA contents were reduced, and histopathological changes decreased. PAC could effectively inhibit the growth of tumor cells and extend the survival period of mice.ConclusionPAC induces a significant reduction in cardiotoxicity by increasing survival rate, immune and cardiac function, improving cardiac enzymes,oxidative stress and myocardial cell injury, and also PAC has obvious antitumor effect.

ADM; pectin-adriamycin conjugate(PAC); cardiac toxicity; echocardiogram; cardiac enzymes; the oxidative stress levels; histopathological changes; antitumor activity

2016-03-28，修回稿日期：2016-04-25

國家十二五重大專項(No 2011ZX09102-001)

彭琳(1991-)，女，碩士，研究方向：靶向抗腫瘤藥物，E-mail:748109074@qq.com；

唐小海(1963-)，男，博士，教授，研究方向：抗腫瘤藥物，通訊作者，E-mail：pharmmateceo@aliyun.com

A

1001-1978(2016)08-1075-06

R-332；R322.11；R730.53；R979.14

網絡出版時間：2016-7-19 10:43網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160719.1043.018.html