miRNA-143在同型半胱氨酸致血管平滑肌細胞增殖中作用的研究

楊曉玲,郭鳳英,馬勝超,楊安寧,曹成建,賈月霞,李桂忠,姜怡鄧

(1.寧夏醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，寧夏 銀川　750004；2.寧夏醫(yī)學科學研究所，寧夏 銀川　750004)

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miRNA-143在同型半胱氨酸致血管平滑肌細胞增殖中作用的研究

楊曉玲1，2,郭鳳英1,馬勝超1,楊安寧1,曹成建1,賈月霞1,李桂忠1,姜怡鄧1

(1.寧夏醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，寧夏 銀川750004；2.寧夏醫(yī)學科學研究所，寧夏 銀川750004)

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.08.013

目的探討miRNA-143在同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)致血管平滑肌細胞增殖中的作用。方法原代培養(yǎng)血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)，用不同濃度的Hcy和葉酸干預，MTT法檢測VSMCs增殖情況，qRT-PCR法檢測miR-143的表達，巢式降落式特異性甲基化PCR法分析miR-143啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)，分別用miR-143的前體和抑制物轉(zhuǎn)染細胞檢測細胞增殖。結(jié)果不同濃度的Hcy均可以引起VSMCs增殖活性增強，miR-143的mRNA表達降低，miR-143啟動子區(qū)甲基化程度升高，以100 μmol·L-1Hcy最為明顯(P<0.01)，miR-143前體作用VSMCs后，細胞的增殖活性減弱(P<0.01)，細胞轉(zhuǎn)染miR-143的抑制物后細胞增殖活性明顯增強(P<0.01)。結(jié)論miR-143可以抑制VSMCs增殖，其機制可能與miR-143啟動子區(qū)高甲基化有關(guān)。

miRNA-143；同型半胱氨酸；血管平滑肌細胞；增殖；甲基化；表達

同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)是體內(nèi)甲硫氨酸循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物，DNA甲基化是Hcy致血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)增殖的重要機制[1]。miRNAs作為表觀遺傳學的組成部分，也參與了VSMCs的增殖過程[2]。VSMCs中含有大量miRNA-143(miR-143)，且miR-143在VSMCs由分化表型向增殖表型轉(zhuǎn)化中具有重要的調(diào)節(jié)作用[3]。但在Hcy導致VSMCs增殖的過程中是否是通過miR-143進行調(diào)節(jié)的，其機制是什么，尚不清楚。因此，本文擬探討miR-143在VSMCs增殖中的作用及機制，為臨床VSMCs增殖相關(guān)疾病的研究提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司；DNA與RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自TaKaRa公司；熒光定量PCR試劑盒購自Fermentas公司；DNA甲基化修飾試劑盒購自美國ZYMORESEARCH公司；葉酸和維生素B12購自Sigma公司。引物由上海生工生物工程公司合成。熒光定量PCR儀、電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)均是美國Bio-Rad公司產(chǎn)品，酶標儀為美國Thermo公司產(chǎn)品，CO2培養(yǎng)箱是德國Heraeus公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與分組參考文獻[4]方法原代培養(yǎng)人臍靜脈血管平滑肌細胞，實驗用第3～8代細胞。將細胞分為對照組、Hcy組(在培養(yǎng)液中加入Hcy,使其終濃度為100 μmol·L-1)、葉酸組(培養(yǎng)液中加入Hcy和葉酸、維生素B12，使Hcy終濃度為100 μmol·L-1，葉酸和維生素B12的終濃度為30 μmol·L-1)。置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。

1.2.2MTT法檢測VSMCs增殖細胞用0.25%胰蛋白酶消化，再用含15%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸，并按照1×104每孔接種于96孔板中。培養(yǎng)48 h后，加入MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去上清，每孔加入150 μL DMSO震蕩15 min，用全自動酶標儀于490 nm處檢測OD值。

1.2.3熒光定量PCR按照試劑盒說明書提取細胞的總RNA，并將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在NCBI查詢各基因的編碼序列，采用Premier 5.0設(shè)計相關(guān)引物。miR-143：5’-GGGTGAGATGAAGCACTGTAGCTC-3’(上游)，5’-GCTGTCAACATACGCTACGTAACG-3’(下游)；PCR反應條件: 95 ℃預變性5 min，94 ℃變性 20 s，58 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s，共45個循環(huán)。目的基因的相對變化結(jié)果用2-△△CT法分析。

1.2.4巢式降落式甲基化特異性PCR(nMS-PCR)按DNA提取試劑盒說明書提取各組細胞全基因組DNA，檢測OD260/OD280值，分析全基因組DNA 樣品純度和濃度。亞硫酸鹽修飾法對全基因組DNA 進行甲基化修飾。nMS-PCR法檢測miR-143啟動子區(qū)DNA 甲基化改變。

分別設(shè)計miR-143外引物、甲基化引物(M)及非甲基化引物(U)，miR-143外引物上游：5’-AGGAGTTTTAGATTAGTTTGGGTAA-3’， 下游：5’-TTTTAAAACAAAATCTCCCTCTATC-3’；M上游：5’-ATTAGTTAGGTATGGTGGTGTACGT-3’，下游：5’- TTTAAAACAAAATCTCCCTCTATCG-3’；U上游：5’-ATTAGTTAGGTATGGTGGTGTATGT-3’， 下游：5’-TTAAAACAAAATCTCCCTCTATCAC-3’。外引物擴增的反應條件為: 94℃預變性5 min，94℃變性30 s，64℃退火30 s，72℃延伸30 s，20個循環(huán)，每個循環(huán)降0.5℃ 至56℃，最后72℃繼續(xù)延伸7 min。然后以外引物的擴增產(chǎn)物為模板，進行內(nèi)引物擴增。反應條件同外引物。甲基化產(chǎn)物與非甲基化產(chǎn)物均為120 bp，取5μL終產(chǎn)物于2% 的瓊脂糖凝膠電泳，分析甲基化條帶及非甲基化條帶的光密度，按公式計算：甲基化/%=甲基化OD值/(甲基化OD值+非甲基化OD 值)×100%。

1.2.5miRNA轉(zhuǎn)染將VSMCs接種于6孔板，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書的操作步驟，分別將miR-143前體和抑制物轉(zhuǎn)染入VSMCs。48 h后收集細胞，提取細胞的總RNA以及全基因組DNA，檢測基因的mRNA表達。

2　結(jié)果

2.1Hcy對VSMCs增殖的影響用不同濃度Hcy刺激VSMCs 48 h后，VSMCs的增殖活性分別是對照組的1.21、1.39、1.17、1.03倍，以100 μmol·L-1Hcy組增加最為明顯，差異具有顯著性(P<0.05)；葉酸組中VSMCs的增殖活性與100 μmol·L-1Hcy組相比下降了27%，差異具有顯著性(P<0.01)，見Fig 1。

Fig 1　Effect of Hcy on proliferation of vascular smooth muscle cells

*P<0.05vs0 μmol·L-1Hcy;#P<0.05vs100 μmol·L-1Hcy

2.2Hcy對miR-143表達的影響qRT-PCR法檢測各組細胞中miR-143的表達，與對照組相比，不同濃度Hcy 刺激VSMCs后，miR-143 表達分別降低了64%、77%、48%、50%，差異具有顯著性(P<0.05，P<0.01)，其中，以100 μmol·L-1Hcy組濃度降低最為明顯。葉酸組miR-143的表達是100 μmol·L-1Hcy組的2.07倍，差異具有顯著性(P<0.05)，見Fig 2。

Fig 2　Effect of Hcy on miR-143 expression

*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol·L-1Hcy；#P<0.05vs100 μmol·L-1Hcy

2.3Hcy對miR-143啟動子區(qū)甲基化的影響用巢式降落式PCR方法檢測miR-143啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)。結(jié)果顯示，不同濃度Hcy 刺激VSMCs后，miR-143啟動子區(qū)DNA 甲基化水平均升高。100 μmol·L-1Hcy組和200 μmol·L-1Hcy組miR-143甲基化分別是對照組的5.53倍和2.50倍，差異具有顯著性(P<0.05，P<0.01)。而葉酸組中miR-143甲基化水平與100 μmol·L-1Hcy比較則下降了61%，差異具有顯著性(P<0.05)，見Fig 3。

Fig 3　Promoter DNA methylation of miR-143 in VSMCs stimulated with Hcy

*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol·L-1Hcy；#P<0.05vs100 μmol·L-1Hcy

2.4miR-143對VSMCs增殖的影響為了確定miR-143在VSMCs增殖中的作用，我們分別將miR-143前體(Pre-miR-143)和miR-143抑制物(miR-143-inhibitor)轉(zhuǎn)染VSMCs。結(jié)果顯示，Pre-miR-143組miR-143表達明顯升高，而miR-143抑制劑組miR-143表達明顯降低(P<0.01)，見Fig 4A。用MTT法檢測了細胞的增殖活性，與對照組相比，過表達miR-143后VSMCs的增殖率降低了46%，而在miR-143 抑制物組中VSMCs的增殖率較正常對照組相比增加了1.29倍，差異均具有顯著性(P<0.05)，見Fig 4B。當用Hcy與Pre-miR-143共培養(yǎng)VSMCs后，細胞增殖較Hcy組下降了38%，而用miR-143抑制物后，細胞增殖較Hcy組升高了40%(P<0.05)。

3　討論

高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia, HHcy)是動脈粥樣硬化性心血管疾病的危險因素[5-6]，其致動脈粥樣硬化的機制涉及內(nèi)皮細胞損傷、VSMCs增殖以及泡沫細胞的形成等[7-9]。本研究用不同濃度的Hcy作用VSMCs后，均可引起VSMCs增殖，以100 μmol·L-1Hcy濃度組最為明顯，而用葉酸干預后，VSMCs增殖受到抑制，表明Hcy能夠促進VSMCs增殖，與文獻報道一致[4]，但Hcy導致VSMCs增殖的機制目前尚未完全闡明。

Fig 4　Effect of miR-143 on VSMCs proliferation

*P<0.05,**P<0.01vscontrol；#P<0.05vs100 μmol·L-1Hcy

microRNAs屬于非編碼RNA，是近年新發(fā)現(xiàn)的長度約為21nt的內(nèi)源性小分子的單鏈RNA，能夠與靶基因mRNA的3’非編碼區(qū)結(jié)合，抑制或降解靶mRNA，導致基因的沉默，可以調(diào)控機體的生長、發(fā)育及分化等[10]。miRNA在體內(nèi)的表達具有組織和細胞特異性，血管組織富含多種miRNAs， 其中，miR-143主要表達于血管壁平滑肌細胞層，在維持VSMCs收縮表型，調(diào)節(jié)VSMCs分化中具有關(guān)鍵作用[3,11]。本研究顯示，用不同濃度的Hcy干預VSMCs后，miR-143表達明顯降低，以100 μmol·L-1Hcy濃度組最為明顯，而用葉酸干預后，miR-143表達有所升高，表明Hcy在促進VSMCs增殖的同時伴有miR-143表達改變，提示miR-143參與了Hcy導致的VSMCs增殖過程。

Hcy是一種含硫的非必需氨基酸，其代謝途徑包括轉(zhuǎn)硫過程和轉(zhuǎn)甲基過程[1,12]。輕度的HHcy或低濃度的Hcy作用于細胞后，Hcy的轉(zhuǎn)甲基作用較強，而高濃度的Hcy則主要引起轉(zhuǎn)硫效應。在體內(nèi)，Hcy參與了甲硫氨酸的循環(huán)過程，將甲基轉(zhuǎn)移至DNA、蛋白質(zhì)等物質(zhì)發(fā)揮生物學效應[13]。DNA甲基化屬于表觀遺傳學的重要內(nèi)容，也是調(diào)控基因表達的重要方式，是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，影響了體內(nèi)某些基因的甲基修飾狀態(tài)而導致基因表達改變，一般而言，DNA甲基化使基因沉默，去甲基化使基因表達激活[14]。本研究結(jié)果顯示，用不同濃度的Hcy干預VSMCs后，miR-143啟動子區(qū)的甲基化程度明顯升高，用葉酸干預后，miR-143啟動子區(qū)甲基化程度降低，表明在Hcy導致VSMCs增殖的過程中，miR-143啟動子區(qū)的甲基化變化程度升高是導致miR-143表達改變的重要機制。為了明確miR-143在Hcy致VSMCs增殖中的作用，我們分別用miR-143的前體和抑制物與Hcy共孵育VSMCs。結(jié)果顯示，miR-143前體能夠抑制VSMCs增殖，而miR-143抑制物能夠促進VSMCs增殖。我們的結(jié)果提示miR-143是Hcy致VSMCs增殖過程中的關(guān)鍵miRNA，本研究將為VSMCs增殖相關(guān)疾病的研究提供新的理論基礎(chǔ)。但miR-143啟動子區(qū)甲基化是受那些因子的調(diào)控，需要進一步研究。

(致謝:本實驗在寧夏醫(yī)科大學心腦血管疾病基礎(chǔ)研究重點實驗室和寧夏醫(yī)學科學研究所公共實驗平臺完成。感謝寧夏醫(yī)學科學研究所趙巍老師給予的指導與幫助。)

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Effect of miRNA-143 on homocysteine induced vascular smooth muscle cell proliferation

YANG Xiao-ling1,2,GUO Feng-ying1,MA Sheng-chao1,YANG An-ning1,CAO Cheng-jian1,JIA Yue-xia1,LI Gui-zhong1,JIANG Yi-deng1

(1.BasicMedicalCollegeofNingxiaMedicalUniversity, 2.InstituteofMedicalSciencesofNingxia,Yinchuan750004,China)

AimTo explore the effect of miRNA-143(miR-143) on homocysteine (Hcy) induced-vascular smooth muscle cells(VSMCs) proliferation and the mechanism.MethodsVSMCs were cultured and incubated with Hcy by using primary cultured method. Then, cells were treated with different concentrations of Hcy and folate. VSMCs proliferation was determined with MTT assay, miR-143 was measured by qRT-PCR, and methylation of miR-143 was determined with methylated PCR.ResultsAfter cells were treated with different concentrations of Hcy, the proliferation of VSMCs was significantly increased, mRNA expression of miR-143 was decreased and methylation of miR-143 was increased. The proliferation of VSMCs was significantly decreased when transfected VSMCs with miR-143 precursor, and cell proliferation was increased by using miR-143 inhibitor transfection.ConclusionHypomethylation of miR-143 may inhibit VSMCs proliferation.

miRNA-143; homocysteine; vascular smooth muscle cells; proliferation; methylation; expression

2016-03-24，修回稿日期：2016-04-26

寧夏自然科學基金資助項目(No NZ15209)；國家自然科學基金資助項目(No 81360027，81360052，81360053)

楊曉玲(1975-)，女，博士，副教授，研究方向：動脈粥樣硬化分子機制，E-mail：yangwj04@126.com；

姜怡鄧(1974-)，男，博士，教授，博士生導師，研究方向：動脈粥樣硬化分子機制，通訊作者，E-mail：jwcjyd@163.com

A

1001-1978(2016)08-1097-05

R322.74；R329.24；R342.2；R977.4

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-7-19 10:43網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160719.1043.026.html