炎癥應(yīng)激通過(guò)激活mTOR通路誘導(dǎo)THP-1巨噬細(xì)胞泡沫化的實(shí)驗(yàn)研究

趙　爽，葉　強(qiáng)，李　濤，范忠才

(西南醫(yī)科大學(xué) 1. 附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科、2. 心肌電生理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 瀘州　646000)

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炎癥應(yīng)激通過(guò)激活mTOR通路誘導(dǎo)THP-1巨噬細(xì)胞泡沫化的實(shí)驗(yàn)研究

趙爽1,2，葉強(qiáng)1，李濤2，范忠才1

(西南醫(yī)科大學(xué) 1. 附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科、2. 心肌電生理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 瀘州646000)

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.08.015

目的研究脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的炎癥應(yīng)激是否通過(guò)激活mTOR通路，增加SCAP/SREBP2表達(dá)，干擾SCAP/SREBP2負(fù)反饋調(diào)控，增加THP-1巨噬細(xì)胞對(duì)非修飾低密度脂蛋白膽固醇(LDL)攝取，導(dǎo)致泡沫細(xì)胞形成。方法誘導(dǎo)分化成功的THP-1源性巨噬細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h后，分為對(duì)照組(5 mg·L-1LDL)、炎癥刺激組(5 mg·L-1LDL+200 μg·L-1LPS)、炎癥+雷帕霉素組(5 mg·L-1LDL+200 μg·L-1LPS+10 μg·L-1Rapamycin)。以上各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后收獲。油紅O染色法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積情況，Real-time PCR法檢測(cè)LDLr、SREBP2、SCAP、S6K1和mTOR mRNA水平, Western blot法檢測(cè)LDLr、S6K1、mTOR蛋白表達(dá)，激光共聚焦法檢測(cè)SCAP在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體間的轉(zhuǎn)位情況。結(jié)果油紅O染色發(fā)現(xiàn)，炎癥應(yīng)激增加THP-1巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，雷帕霉素抑制炎癥應(yīng)激誘導(dǎo)的脂質(zhì)聚積。Real-time PCR檢測(cè)顯示，炎癥應(yīng)激上調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞LDLr、SREBP2、SCAP、S6K1和mTOR mRNA水平(P<0.05)，雷帕霉素減少炎癥應(yīng)激誘導(dǎo)的LDLr、SREBP2、SCAP、S6K1和mTOR mRNA水平升高(P<0.05)。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，炎癥應(yīng)激上調(diào)LDLr、S6K1和mTOR蛋白表達(dá)(P<0.05)，雷帕霉素減少炎癥應(yīng)激誘導(dǎo)的LDLr、S6K1和mTOR 蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。激光共聚焦檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，炎癥應(yīng)激增加SCAP/SREBP2從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)位到高爾基體，雷帕霉素則抑制炎癥應(yīng)激誘導(dǎo)的SCAP/SREBP2復(fù)合物從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)位到高爾基體。結(jié)論炎癥應(yīng)激通過(guò)激活mTOR通路，上調(diào)SCAP/SREBP2表達(dá)，致SCAP/SREBP2復(fù)合體轉(zhuǎn)位至高爾基體異常增加，LDLr表達(dá)上調(diào)，致使膽固醇聚積于細(xì)胞內(nèi)，泡沫細(xì)胞形成。雷帕霉素能夠逆轉(zhuǎn)炎癥應(yīng)激誘導(dǎo)mTOR通路激活，減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇沉積，提示炎癥應(yīng)激狀態(tài)下，mTOR可能是泡沫細(xì)胞形成的關(guān)鍵通路。

THP-1 巨噬細(xì)胞；脂多糖；炎癥；LDLr;泡沫細(xì)胞；雷帕霉素

動(dòng)脈硬化性心血管疾病(atherosclerotic cardiovascular disease, ASCVD)是全球發(fā)病率和死亡率的主要原因，主要是由動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致。目前認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，包括內(nèi)皮功能的紊亂、炎癥細(xì)胞的募集、細(xì)胞因子產(chǎn)生以及血管壁的脂質(zhì)沉積[1]。既往研究認(rèn)為，動(dòng)脈硬化與血脂紊亂有關(guān)，然而最近研究發(fā)現(xiàn)，血脂正常的自身免疫性疾病(如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、腸道炎癥性疾病等)患者有嚴(yán)重的動(dòng)脈粥樣硬化，提示慢性炎癥在動(dòng)脈硬化過(guò)程中起重要作用[2-4]。

低密度脂蛋白受體(LDLr)是結(jié)合血漿來(lái)源LDL膽固醇和調(diào)節(jié)血漿膽固醇水平的主要受體，LDLr活性受細(xì)胞內(nèi)膽固醇濃度的負(fù)反饋系統(tǒng)的嚴(yán)密調(diào)控[5]。該系統(tǒng)通過(guò)調(diào)控LDLr 介導(dǎo)的 LDL 攝入以及新生膽固醇合成，確保肝細(xì)胞和其他細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平穩(wěn)定。因此，傳統(tǒng)觀念認(rèn)為L(zhǎng)DLr不參與細(xì)胞內(nèi)膽固醇聚集以及泡沫細(xì)胞形成[6-7]。我們前期研究證實(shí)，炎癥因子如脂多糖(LPS)可通過(guò)干擾巨噬細(xì)胞上LDLr負(fù)反饋調(diào)節(jié)，上調(diào)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-2(SREBP-2)及SREBP裂解激活蛋白(SCAP)的表達(dá)，天然LDL通過(guò)LDLr被巨噬細(xì)胞大量攝入，導(dǎo)致泡沫細(xì)胞形成。

雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞合成的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。mTOR有2種細(xì)胞復(fù)合物形式，mTORC1和mTORC2，目前大多數(shù)研究都集中在mTORC1，雷帕霉素是其特異性抑制劑。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，mTOR信號(hào)通路與SCAP/SREBP2復(fù)合物及膽固醇調(diào)控有密切聯(lián)系。 但目前關(guān)于炎癥應(yīng)激下mTOR通路與細(xì)胞內(nèi)膽固醇失穩(wěn)態(tài)的關(guān)系尚不清楚。本研究探討LPS誘導(dǎo)的炎癥應(yīng)激是否通過(guò)激活mTOR通路，增加SCAP/SREBP2表達(dá)，干擾SCAP/SREBP2負(fù)反饋調(diào)控，增加THP-1巨噬細(xì)胞對(duì)非修飾低密度脂蛋白膽固醇(LDL)攝取，導(dǎo)致泡沫細(xì)胞形成。

1　材料

人單核細(xì)胞株(THP-1)，由重慶醫(yī)科大學(xué)脂質(zhì)研究中心提供；細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FCS)購(gòu)于Hyclone公司；低密度脂蛋白(LDL)購(gòu)于廣州奕源生物有限公司；青霉素、鏈霉素、小牛血清白蛋白(BSA)、佛波醇酯(PMA)、LPS、二甲基亞砜、四乙酸乙二胺(EDTA)、叔丁基對(duì)甲酚(BHT)、雷帕霉素(rapamycin)均購(gòu)于Sigma；4%多聚甲醛、油紅O、蘇木精均購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；總RNA提取試劑盒購(gòu)于北京天根生化科技有限公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于日本Toyobo公司；SYBR Green I PCR Mix購(gòu)于日本TaKaRa公司；8聯(lián)光學(xué)反應(yīng)PCR管及光學(xué)蓋子購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司；細(xì)胞蛋白提取試劑盒購(gòu)自南京凱基生物技術(shù)公司；Bradford試劑購(gòu)于北京百泰克生物科技有限公司；Anti-LDLr一抗、Anti-S6K1一抗、Anti-mTOR一抗購(gòu)于美國(guó)ABI；鼠抗人Golgi一抗、羊抗兔Fluor(green)488 for SCAP 二抗、羊抗鼠Fluor(Red)594 for Golgi 二抗均購(gòu)于Molecular Probes。

2　方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組THP-1細(xì)胞用含20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。加佛波醇酯(160 μmol·L-1)于培養(yǎng)液，72 h后待懸浮細(xì)胞分化為貼壁生長(zhǎng)的巨噬細(xì)胞后，用PBS清洗3次，換含抗氧化劑EDTA和BHT無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h，將細(xì)胞分為3組：① 對(duì)照組(5 mg·L-1LDL)；② 炎癥刺激組(5 mg·L-1LDL+200 μg·L-1LPS)；③ 炎癥+雷帕霉素組(5 mg·L-1LDL+200 μg·L-1LPS+10 μg·L-1Rapamycin)。以上各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后收獲。

2.2泡沫細(xì)胞鑒定待懸浮細(xì)胞分化為貼壁生長(zhǎng)的巨噬細(xì)胞后，用PBS清洗3次，換含0.2% BSA無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h，用冷PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，油紅O染色液染色20 min，蘇木精復(fù)染10 s，自來(lái)水沖洗5 min，顯微鏡下觀察并照相。

2.3總RNA提取和Real-time PCR根據(jù)試劑盒操作說(shuō)明提取THP-1巨噬細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA；cDNA合成后，用SYBR GReen I PCR Master Mix進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)參數(shù)：50℃ 2 min，95℃ 5 min，然后40個(gè)循環(huán)(95℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 45 s)，72℃10 min 后終止。計(jì)算公式如下：實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組基因表達(dá)水平的倍數(shù)=-exp(△△CT)，其中△△CT=實(shí)驗(yàn)組△CT-對(duì)照組△CT，△CT=靶基因CT值-β-actin CT值。引物序列：LDLr上游5′-GATAC CAAGGGCGTGAAGAG-3′，下游 5′-CACCAGCGAGTAGATGTCCA-3′；SREBP2上游5′-CCGCCTGTTCCGATGTACAC-3′, 下游 5′-TGCACATTCAGCCAGGTTCA-3′;SCAP 上游 5′-TCTGACCGCAAACAAGGAG-3′, 下游 5′-CCAGGGAAACACTGAGGACT-3′；mTOR上游 5′-GCCCTCACCTCACAAGACAT-3′，下游5′-GCTCTCTACCCAGCAGAAC-3′；β-actin 上游 5′-CCTGGCACCCACGCACAAT-3′，下游5′-GCCGATCCACACACGGAGTACT-3′。所有引物由上海生物工程技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)。

2.4Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)收獲細(xì)胞，用試劑盒提取蛋白后，定量總蛋白和胞核蛋白濃度，電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫下封閉，用相應(yīng)的一抗4℃孵育過(guò)夜，洗滌后換HRP標(biāo)記二抗室溫孵育1 h；最后ECL化學(xué)發(fā)光試劑A液、B液按1 ∶1混勻，均勻加至膜上，放入成像儀中采集圖像，用Quantity One軟件分析條帶灰度值。

2.5激光共聚焦掃描檢測(cè)SCAP定位THP-1巨噬細(xì)胞經(jīng)實(shí)驗(yàn)處理后培養(yǎng)于24孔板中，經(jīng)PBS洗滌后，用5%福爾馬林生理鹽水室溫下固定30 min；0.25% TritonX-100處理細(xì)胞15 min;1% BSA室溫下封閉20 min;加入兔抗人SCAP 一抗(終濃度1 ∶100)和鼠抗人Golgi抗體(終濃度1 ∶100)，200 μL每孔，4℃過(guò)夜;PBST洗滌后加入羊抗兔Fluor488 for SCAP 二抗(終濃度1 ∶100)，室溫下孵育1h;經(jīng)PBST洗滌后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖片。

3　結(jié)果

3.1不同干預(yù)條件對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積的影響油紅O染色初步證實(shí)，與對(duì)照組比較，炎癥刺激組可見(jiàn)明顯的脂質(zhì)沉積。加入雷帕霉素則抑制了細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的沉積，見(jiàn)Fig 1。

3.2不同干預(yù)條件對(duì)巨噬細(xì)胞LDLr、SREBP2和SCAP mRNA水平的影響如Fig 2所示,與對(duì)照組比較，200 μg·L-1LPS上調(diào)了LDLr、SREBP2和SCAP mRNA水平。加入10 μg·L-1Rapamycin后，LDLr、SREBP2和SCAP mRNA水平被明顯抑制。

Fig 1　Morphological examination of macrophages with Oil Red O staining(×200)

A:Control；B:LDL+LPS；C:LDL+LPS+Rapamycin

Fig 2　Effect of different conditions on LDLr, SREBP2 and SCAP mRNA levels in macrophages

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsLPS alone

3.3不同干預(yù)條件對(duì)巨噬細(xì)胞S6K1和mTOR mRNA水平的影響200 μg·L-1LPS上調(diào)了S6K1和mTOR mRNA水平。而加入10 μg·L-1Rapamycin后，則可明顯抑制S6K1和mTOR mRNA水平。見(jiàn)Fig 3。

Fig 3　Effect of different conditions on S6K1 and mTOR mRNA levels in macrophages

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsLPS alone

3.4不同干預(yù)條件對(duì)巨噬細(xì)胞LDLr蛋白表達(dá)的影響當(dāng)有200 μg·L-1LPS存在時(shí)，上調(diào)了LDLr蛋白表達(dá)。而加入10 μg·L-1Rapamycin后，則可明顯抑制LDLr蛋白表達(dá)。見(jiàn)Fig 4。

Fig 4　Effect of different conditions on LDLr protein expression in macrophages

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsLPS alone

3.5不同干預(yù)條件對(duì)巨噬細(xì)胞S6K1蛋白表達(dá)的影響當(dāng)有200 μg·L-1LPS存在時(shí)，上調(diào)了S6K1蛋白表達(dá)。而加入10 μg·L-1Rapamycin后，則可明顯抑制S6K1蛋白表達(dá)。見(jiàn)Fig 5。

3.6不同干預(yù)條件對(duì)巨噬細(xì)胞mTOR蛋白表達(dá)的影響如Fig 6所示，當(dāng)有200 μg·L-1LPS存在時(shí)，上調(diào)了mTOR蛋白表達(dá)。而加入10 μg·L-1Rapamycin后，則可明顯抑制mTOR蛋白表達(dá)。

3.7激光共聚焦結(jié)果用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)巨噬細(xì)胞4 h后，分別加入5 mg·L-1LDL、5 mg·L-1LDL+200 μg·L-1LPS、5 mg·L-1LDL+200 μg·L-1LPS+10 μg·L-1Rapamycin處理24 h。用抗人的SCAP抗體和抗高爾基抗體雙重染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察(×1 000)。SCAP用綠色表示，高爾基體用紅色表示，SCAP和高爾基體的共定位用黃色表示。結(jié)果顯示，單獨(dú)加入200 μg·L-1LPS時(shí)，SCAP從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的轉(zhuǎn)位異常增加；加入10 μg·L-1Rapamycin后，明顯抑制SCAP從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的轉(zhuǎn)位，見(jiàn)Fig 7。

Fig 5　Effect of different conditions on S6K1 protein expression in macrophages

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsLPS alone

Fig 6　Effect of different conditions on mTOR protein expression in macrophages

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsLPS alone

4　討論

mTOR是哺乳動(dòng)物細(xì)胞合成的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，有2種細(xì)胞復(fù)合物形式，mTORC1和mTORC2。目前大多數(shù)研究都集中在mTORC1，雷帕霉素是其特異性抑制劑。激活的mTOR 發(fā)揮兩個(gè)方面的功能：一方面，磷酸化其下游區(qū)的效應(yīng)子核糖體蛋白S6 激酶1(S6K1)和真核細(xì)胞翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白(4EBP1)，從而啟動(dòng)翻譯過(guò)程，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。第二，生理?xiàng)l件下，S6K1 和4EBP1 與真核細(xì)胞啟動(dòng)因子3(elF3)結(jié)合，處于無(wú)活性狀態(tài)；在過(guò)度生長(zhǎng)、炎癥、應(yīng)激等病理?xiàng)l件下，mTOR 與elF3 結(jié)合并磷酸化S6K1 和4EBP1，結(jié)果是S6K1 和4EBP1 活化，促進(jìn)了翻譯啟動(dòng)和細(xì)胞的生長(zhǎng)[8]。因此，mTOR 在控制細(xì)胞生長(zhǎng)及代謝方面起到中心作用。LPS是一種常用炎癥刺激物，通過(guò)作用于Toll樣受體4(TLR-4)通路,進(jìn)而激活轉(zhuǎn)錄因子-核因子κB(NF-κB)，其最終生物學(xué)效應(yīng)是腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)合成分泌增加，導(dǎo)致炎癥應(yīng)激狀態(tài)，故常用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)[9]。

Fig 7　Effect of different conditions on translocation of SCAP-SREBP2 complex from endoplasmic reticulum to the Golgi

A: Control; B: LDL+LPS; C: LDL+LPS+Rapamycin

近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，mTOR信號(hào)通路與SCAP/SREBP2復(fù)合物及膽固醇調(diào)控有密切聯(lián)系[10]。研究發(fā)現(xiàn)，mTOR的上游調(diào)控蛋白之一，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的特異性抑制劑LY294002可以明顯抑制細(xì)胞內(nèi)低膽固醇水平調(diào)控的SREBP2從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體轉(zhuǎn)位，使細(xì)胞內(nèi)膽固醇持續(xù)處于低水平；同時(shí)，負(fù)性表達(dá)蛋白激酶B(DN-Akt)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞內(nèi)膽固醇也是降低的，激光共聚焦也發(fā)現(xiàn)SCAP/SREBP2從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體轉(zhuǎn)位減少。Porstmann等[11-13]也發(fā)現(xiàn)mTOR特異性抑制劑雷帕霉素可以明顯抑制SREBP2表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)膽固醇合成減少，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，LPS明顯增加THP-1巨噬細(xì)胞組內(nèi)脂質(zhì)沉積，雷帕霉素則抑制了炎癥組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的沉積(油紅O染色證實(shí))。Real-time PCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，炎癥LPS應(yīng)激明顯上調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞LDLr mRNA水平和蛋白表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞攝入膽固醇及細(xì)胞內(nèi)膽固醇合成。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，炎癥應(yīng)激上調(diào)了細(xì)胞內(nèi)膽固醇敏感期SCAP及其伴隨蛋白SREBP2 mRNA水平，這2個(gè)蛋白是LDLr的上游調(diào)節(jié)基因，雷帕霉素抑制SCAP/SREBP2的表達(dá)，減少SCAP/SREBP2從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的轉(zhuǎn)位，繼而減少LDLr表達(dá)。我們檢測(cè)mTOR和其下游調(diào)節(jié)因子S6K1的mRNA和蛋白表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，炎癥應(yīng)激上調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞mTOR和S6K1的mRNA和蛋白表達(dá)，提示mTOR信號(hào)通路被激活。雷帕霉素明顯抑制mTOR和S6K1的mRNA和蛋白表達(dá)，繼而減少SCAP/SREBP2/LDLr表達(dá)及SCAP/SREBP2轉(zhuǎn)位，抑制細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積，進(jìn)一步證實(shí)炎癥應(yīng)激下THP-1巨噬細(xì)胞mTOR通路激活與細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)超載及泡沫細(xì)胞形成有關(guān)。我們的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提示，炎癥應(yīng)激可能是動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)因子，在低血脂水平條件下，炎癥應(yīng)激同樣可以促進(jìn)脂質(zhì)在巨噬細(xì)胞內(nèi)聚積，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞泡沫化。本實(shí)驗(yàn)給予細(xì)胞一個(gè)低水平的LDL濃度負(fù)荷，在炎癥應(yīng)激下卻依然造成細(xì)胞內(nèi)大量脂質(zhì)聚集，這樣或許能解釋臨床上有不少患者血脂正常甚至偏低，仍然有較高的動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生率，部分原因可能與炎癥應(yīng)激誘導(dǎo)脂質(zhì)由血液向組織細(xì)胞分布有關(guān)[14]。綜上所述，在THP-1巨噬細(xì)胞，炎癥應(yīng)激通過(guò)激活mTOR通路，上調(diào)SCAP/SREBP2表達(dá)，致SCAP/SREBP2異常轉(zhuǎn)位至高爾基體，上調(diào) LDLr表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)膽固醇聚積，泡沫細(xì)胞形成，而雷帕霉素能夠逆轉(zhuǎn)炎癥應(yīng)激誘導(dǎo)mTOR通路激活，減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇沉積，提示炎癥應(yīng)激狀態(tài)下mTOR可能是泡沫細(xì)胞形成的關(guān)鍵通路。

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Experiment of THP-1 macrophage foam-cell formation through mTOR signal pathway activation induced by inflammatory stress

ZHAO Shuang1,2, YE Qiang1, LI Tao2, FAN Zhong-cai1

(1.DeptofCardiology，theAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,2.KeyLaboratoryonCardiacElectrophysiologyofEducationMinistry,LuzhoSichuan646000，China)

AimTo investigate if LPS increases the sterol regulatory element binding proteins(SREBPs) cleavage-activating protein(SCAP)-SREBP2 expression by activation of mTOR signal pathway in THP-1 macrophages, upgrading LDLr level, causing foam-cell formation.MethodsTHP-1 macrophages were incubated in serum free medium in the absence of 5 mg·L-1LDL alone, or 5 mg·L-1LDL plus 200 μg·L-1LPS， or 5 mg·L-1LDL plus 200 μg·L-1LPS plus 10 μg·L-1rapamycin. Morphological examination of macrophages was performed with Oil Red O staining. Expression changes of LDLr, SREBP2, SCAP, S6K1 and mTOR mRNA were detected by real time quantitative polymerase chain reaction(PCR). Western blot was used to analyze protein expression changes of LDLr, S6K1 and mTOR. Translocation of SCAP-SREBP2 complex from the endoplasmic reticulum(ER) to the Golgi was determined by confocal microscopy.ResultsLPS enhanced transformation of THP-1 macrophages into foam cells by increased uptake of lipid as evidenced by Oil Red O assay. LPS increased mRNA levels of LDLr,SREBP2,SCAP,S6K1 and mTOR(P<0.05). Rapamycin reduced the mRNA levels of LDLr,SREBP2,SCAP,S6K1 and mTOR induced by LPS(P<0.05). Western blot demonstrated that LPS also caused over-expression of protein of LDLr, S6K1 and mTOR(P<0.05). Rapamycin reduced the expression of protein of LDLr, S6K1 and mTOR induced by LPS(P<0.05). Confocal microscopy demonstrated LPS caused an escape of SCAP-SREBP2 complex from the ER to the Golgi. Rapamycin inhibited the translocation of SCAP-SREBP2 complex from the ER to the Golgi.ConclusionsInflammatory stress increases SCAP/SREBP2 expression by activation of mTOR signal pathway, resulting in an escape of SCAP-SREBP2 complex from the ER to the Golgi, furthermore elevating LDLr expression and causing foam-cell formation. Rapamycin reverses the activation of mTOR signal pathway and decreases lipid deposition in THP-1 macrophages induced by LPS.

THP-1 macrophages; LPS; inflammation; LDLr; foam cells; rapamycin

2016-04-18,

2016-05-10

四川省衛(wèi)生廳基金項(xiàng)目(No 2011-110335);瀘州市科技局基金項(xiàng)目[No 2011-I-S37(6/7)];瀘州醫(yī)學(xué)院基金資助項(xiàng)目(No 2010-108);瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院基金資助項(xiàng)目(No 2011-43)

趙爽(1988-),男，碩士生，住院醫(yī)師，研究方向：介入心臟病學(xué)，E-mail：arronzhao@126.com；

葉強(qiáng)(1978-)，男，博士，副教授，研究方向：冠心病、脂質(zhì)代謝紊亂、心力衰竭，共同第一作者，E-mail：qiangye78@126.com；

A

1001-1978(2016)08-1105-06

R329.24；R364.5； R979.5

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-7-19 10:43網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160719.1043.030.html

范忠才(1965-)，男，博士，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：介入心臟病學(xué)，通訊作者，E-mail: zhongcai9665@126.com