金釵石斛多糖對脂多糖作用大鼠皮層膠質細胞-神經元體系的保護作用

林　牧，龔其海，吳　芹，張　鋒，石京山

(遵義醫學院基礎藥理省部共建教育部重點實驗室，貴州 遵義　563000)

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金釵石斛多糖對脂多糖作用大鼠皮層膠質細胞-神經元體系的保護作用

林牧，龔其海，吳芹，張鋒，石京山

(遵義醫學院基礎藥理省部共建教育部重點實驗室，貴州 遵義563000)

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.08.022

目的觀察金釵石斛多糖(NDP)對脂多糖(LPS)作用的新生大鼠大腦皮層膠質細胞-神經元混合培養體系的保護作用。方法原代制備新生大鼠大腦皮層膠質細胞-神經元混合培養體系，NDP作用于LPS刺激的膠質細胞-神經元混合培養體系，觀察細胞生長情況，并采用Real time PCR法檢測體系中炎癥相關因子IL-1β、TNF-α、COX-2的基因表達。結果NDP作用于LPS刺激的大鼠皮層膠質細胞-神經元混合培養體系后，膠質細胞激活減少、神經元損傷減輕，較單用LPS作用的模型組相比，炎癥相關因子IL-1β、TNF-α、COX-2的基因表達明顯降低。結論NDP能抑制LPS對小膠質細胞和星形膠質細胞的激活，減少炎性因子的生成。

金釵石斛多糖；神經元；小膠質細胞；脂多糖；星形膠質細胞；炎癥因子

小膠質細胞在中樞神經系統(central nervous system, CNS)中充當巨噬細胞的角色來維護CNS的內穩態[1],通過分支狀的突起監測外周環境的變化，不斷清除損傷的神經元、斑塊及炎性物質，在應激狀態下(如外傷、炎癥等)，激活并增強吞噬作用，從而應對損傷；同時釋放多種炎癥介質，對神經元產生刺激、損傷，驅動并加劇神經系統退行性疾病[2-4]。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)可激活小膠質細胞和星形膠質細胞，并釋放炎癥介質，引起局部或廣泛的中樞神經系統損傷，誘導神經炎性疾病的發生，如阿爾茨海默病、帕金森病等[4-6]。為探索神經系統退行性疾病的治療新藥，本課題組通過前期的在體動物實驗發現金釵石斛多糖(noble dendrobium polysaccharides，NDP)能明顯改善LPS引起的神經炎性反應。通過建立大鼠皮層膠質細胞-神經元混合培養體系，模擬離體情況下最接近腦組織內的細胞比例，觀察NDP對LPS產生炎癥的保護作用，為NDP抗神經炎性疾病的應用研究提供基礎藥理學依據。

1　材料與方法

1.1藥品與試劑NDP由貴陽中醫學院提取(分子量為30～1 008 ku、純度為63.9%)，胎牛血清、Iba-1、DMEM/High Glucose培養基由美國Gibco公司提供，脂多糖由Sigma公司提供，NSE和GFAP由 Abcam公司提供，IL-1β、TNF-α、COX-2、β-actin引物由大連寶生物工程有限公司提供。

1.2儀器Leica光學顯微鏡由德國Leica Microsystems Ltd公司提供，熒光倒置顯微鏡由日本Nikon公司提供，Mastercycler Centrifuge PCR儀由德國Eppendorf公司提供。

1.3實驗動物清潔級(SPF級)Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質量200～250 g，♀♂兼用以繁殖乳鼠。實驗選用出生48 h內的SD大鼠，♀♂不拘。大鼠購自第三軍醫大學大坪醫院實驗動物中心。許可證分別為：SCXK(渝)2007-0005及SCXK(渝)2012-0005。

1.4方法

1.4.1膠質細胞-神經元混合培養及免疫熒光化學鑒定將出生48 h內的SD大鼠，7.5 g·L-1酒精浸泡后超凈臺中斷頭，顯微鏡下機械分離大腦皮質組織，盡量剝除血管和腦膜，放入預冷的DMEM/High Glucose培養基中。使用電動移液器機械吹打制備細胞懸液，調整細胞密度為1×109·L-1，接種于預先用1 mg·L-1多聚賴氨酸處理的75 cm2培養瓶中，置于37 ℃、5% CO2培養箱培養。每2～3 d更換1次細胞種植培養液，培養8～10 d后造模。

采用上述膠質細胞-神經元混合培養的方法，將細胞懸液調整計數為1×107·L-1，移入預先用1 mg·L-1多聚賴氨酸處理的6孔培養板中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養7 d，分別用小膠質細胞特異性標志物Iba-1、星形膠質細胞特異性標志物GFAP和神經元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)進行免疫熒光化學染色鑒定。

1.4.2實驗分組① 正常對照組(Normal)：不加任何藥物，僅加入細胞種植培養液(主要成分為DMEM/培養基，內含青、鏈霉素、非必需氨基酸、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、馬血清和胎牛血清)；② 模型組(Model)：含LPS 1 mg·L-1細胞種植培養液；③ NDP低劑量組(NDP-L)：含NDP 0.5 g·L-1+LPS 1 mg·L-1細胞種植培養液；④ NDP中劑量組(NDP-M)：含NDP 0.75 g·L-1+LPS 1 mg·L-1細胞種植培養液;⑤ NDP高劑量組(NDP-H)：含NDP 1 g·L-1+LPS 1 mg·L-1細胞種植培養液。

2　結果

2.1小膠質細胞與神經元熒光免疫雙標原代新生大鼠皮層膠質細胞-神經元混合培養至7 d，倒置顯微鏡觀察細胞：見混合培養細胞明顯分層，底層主要為星形膠質細胞和少量神經元，表層呈圓形、折光性強的細胞為小膠質細胞?；旌吓囵B體系中，小膠質細胞與神經元的比例約為 4 ∶3,與在體大腦中兩種細胞的比例相符。用特異性標記物Iba-1進行熒光免疫染色，見其發出綠色熒光(Fig 1A)。采用Iba-1和神經元特異標記物NSE對混合細胞培養體系中小膠質細胞和神經元共同染色，可清晰的見到“Fig 1B”中央神經元軸突交織成稀疏的網絡狀，周圍的小膠質細胞呈圓形，胞質被染色。

2.2星形膠質細胞鑒定原代新生大鼠皮層膠質細胞-神經元混合培養至7 d，倒置顯微鏡觀察細胞：見混合培養細胞明顯分層，底層主要為星形膠質細胞和少量神經元，可見星形膠質細胞鋪展于底層，突觸呈明顯五角星狀(Fig 2A)。混合細胞培養體系中，星形膠質細胞約占一半以上，符合在體大腦中星形膠質細胞的生長比例。采用星形膠質細胞特異標記物GFAP進行熒光免疫染色(Fig 2B)。

Fig 1　Primary mixed cultures of microglia(A) and neurons(B) fluorescent immune markers (200×)

Fig 2　Primary mixed cultures of astrocytes fluorescent immune markers(200×)

A:Mixed cultures;B:Fluorescence astrocytes

Tab 1　Gene sequences of primers

Fig 3　Pretreatment of different concentrations of NDP for 24 hours after 24 hours LPS stimulation in primary mixed cultures(200×)

A:Normal;B:Model;C:NDP-L;D:NDP-M;E:NDP-H

Fig 4　Pretreatment of different concentrations of NDP for 24 hours after 24 hours LPS stimulation of neurons in primary mixed cultures(200×)

A:Normal;B:Model;C:NDP-L;D:NDP-M;E:NDP-H

2.3NDP對LPS作用的膠質細胞-神經元混合培養體系的保護作用

2.3.1NDP對LPS作用的膠質細胞-神經元混合培養體系保護作用的形態學表現原代新生大鼠皮層膠質細胞-神經元混合培養至d 8，NDP不同劑量(0.5、0.75、1 g·L-1)預處理24 h后，加入LPS作用24 h，倒置顯微鏡下觀察。見空白對照組的小膠質細胞生長情況良好，胞質折光性強(Fig 3A)；LPS單獨作用的模型組可見表層小膠質細胞的胞質顏色加深，表明激活較多(Fig 3B)；NDP 0.5 g·L-1預處理后再LPS作用的低劑量組小膠質細胞激活較少(Fig 3C)；中劑量(NDP 0.75 g·L-1)、高劑量(1 g·L-1)組基本未見激活的小膠質細胞(Fig 3D、3E)。神經元特異標記物NSE熒光免疫染色后倒置顯微鏡下觀察神經元生長情況。見空白對照組生長情況良好，突觸明顯(Fig 4A)；模型組神經元較少且突觸稀疏(Fig 4B)；NDP 0.5 g·L-1預處理24 h，再LPS作用24 h的低劑量組神經元較少(Fig 4C)；NDP 0.75 g·L-1和1 g·L-1預處理24 h,再LPS作用24 h的中、高劑量組神經元生長情況較好，突出清晰可見(Fig 4D、4E)。

為了更直觀地反映神經元在LPS刺激和NDP不同濃度作用后LPS刺激條件下的生長情況，將神經元特異標記物NSE熒光免疫染色后倒置顯微鏡下的觀察結果進行計數并統計。如Fig 5所示，與空白組相比，神經元在LPS的作用下部分死亡，以致數量減少；而NDP不同濃度預處理后再用LPS刺激，神經元的死亡明顯減少。

Fig 5　Pretreatment of different concentrations NDP for 24 hours after 24 hours LPS stimulation of neuron number

##P<0.01vsnormal control；**P<0.01vsmodel

2.3.2NDP對LPS作用的大鼠皮層膠質細胞-神經元混合培養體系中IL-1β、TNF-α、COX-2 mRNA表達的影響模型組與正常對照組相比，IL-1β、TNF-α、COX-2 mRNA的表達明顯升高。與模型組相比，NDP各劑量組IL-1β、TNF-α、COX-2 mRNA的表達均明顯降低。

3　討論

LPS可通過單核巨噬細胞譜系細胞表面的糖蛋白-CD14分子啟動該類細胞的轉膜信號[7-9]， LPS 刺激后TNF-α、IL-1β和COX-2等細胞因子生成增加，刺激神經元釋放更多的炎性介質，引起如阿爾茨海默病、帕金森病的病理變化，引發炎性反應，導致神經元死亡和腦部損傷[10-12]。靜息狀態下，小膠質

Fig 6　Effects of pretreatment of different concentrations of NDP and LPS stimulation on TNF-α,COX-2 and IL-1β expressions in primary mixed ±s，n=3)

##P<0.01vscontrol；*P<0.05，**P<0.01vsmodel

細胞通過分泌神經營養因子維持中樞神經系統微環境的穩定，受到特定刺激(如LPS)時，小膠質細胞被激活，其表型發生改變，細胞表面多種受體表達上調，產生多種炎性因子并誘導神經元變性死亡[13-15]。該體系較在體大腦相比，能夠排除個體差異、個體療效等影響因素，結果顯示，NDP能明顯拮抗LPS對神經元的毒性作用，抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β和COX-2的過度表達，防止小膠質細胞過度激活，從而保護神經元免受炎癥因子的毒性作用[16-17]。該研究表明，NDP對阿爾茨海默病等神經炎性疾病有預防作用，為科學評價NDP療效和安全性提供基礎依據。

(致謝:感謝導師石京山教授的教導，感謝龔其海老師、吳芹老師、張鋒老師、陸遠富老師和劉杰老師等指導，感謝陳晶、杜安妮、劉慧宇、林淑嫻和李葉麗等的幫助！)

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Protective effects of NDP on LPS induced neuron injuries in rat mixed cultures

LIN Mu, GONG Qi-hai, WU Qin, ZHANG Feng, SHI Jing-shan

(KeyLaboratoryofBasicPharmacologyofMinistryEducation,ZunyiMedicalUniversity,ZunyiGuizhou563000,China)

AimTo investigate the protective effect of noble dendrobium polysaccharides(NDP) on lipopolysaccharide(LPS)-induced neuron injuries in newborn rat cerebral cortex glial cells and neuron mixed cultures.MethodsThe primary cultures of newborn rat cortical neurons and glial cells were established and the existence of the neurons, astrocytes and microglia was verified respectively. NDP was given to LPS-induced mixed cultures, the mRNA levels of IL-1β, TNF-α and COX-2 were assayed by real time PCR. ResultsNDP reduced the glial cell activation and neuron damage after it was given to LPS-induced mixed cultures. The mRNA levels of IL-1β, TNF-α, COX-2 were reduced.ConclusionNDP protects against LPS-induced neuron-inflammation in neurons and glial cells cultures.

noble dendrobium polysaccharides; neurons; microglia; lipopolysaccharide; astrocytes; inflammatory factor

2016-03-22,

2016-04-25

國家自然科學基金資助項目(No 30960447) ；貴州省教育廳自然科學基金資助項目(No 2010043)

林牧(1987-)，女，碩士，助教，研究方向：神經藥理學,E-mail:1162770477@qq.com;

石京山(1959-)，男，博士，教授，博士生導師，研究方向：神經藥理學,通訊作者,E-mail: zmcshijs@163.com

A

1001-1978(2016)08-1144-05

R-332；R284.1；R322.81；R329.24；R392.12；R745.7

網絡出版時間：2016-7-19 10:43網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160719.1043.044.html