桑枝多糖對糖尿病腎病小鼠腎皮質氧化應激作用的影響

郭福團，許雄偉，潘建峰，林佩莉，鄭　妮

(福建醫科大學附屬第一醫院藥學部，福建 福州　350000)

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桑枝多糖對糖尿病腎病小鼠腎皮質氧化應激作用的影響

郭福團，許雄偉，潘建峰，林佩莉，鄭妮

(福建醫科大學附屬第一醫院藥學部，福建 福州350000)

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.08.023

目的研究桑枝多糖對鏈脲佐菌素(STZ)誘導糖尿病腎病小鼠腎皮質氧化應激作用的影響。方法STZ(120 mg·kg-1)尾靜脈注射誘導糖尿病小鼠模型，并隨機分為：模型組，纈沙坦組(20 mg·kg-1)，桑枝多糖0.3、0.6、1.2 g·kg-1組，另設空白組，連續灌胃給藥90 d。于d 45將各組小鼠給藥后置代謝籠中收集24 h尿液，記錄排尿量，檢測24 h尿微量白蛋白含量。90 d后處死小鼠，通過對腎臟HE染色觀察腎臟病理學變化；全自動生化分析儀測定血清中尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)的含量；試劑盒測定大鼠腎皮質中錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、氧化氫酶(CAT)、線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅲ的活性和丙二醛(MDA)含量；ELISA法檢測腎皮質ROS的含量；蛋白免疫印跡法檢測腎皮質中SIRT1、FOXO1、NF-κB的蛋白表達。結果桑枝多糖組的腎皮質病變得到緩解，較模型組的血糖有所下降，并明顯降低尿微量白蛋白含量、尿量及血清中Cr、BUN(P<0.05)，腎皮質Mn-SOD、CAT、線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅲ活性有所升高，ROS、MDA含量下降(P<0.05)，上調SIRT1、FOXO1的蛋白水平以及下調NF-κB的蛋白水平(P<0.05)。結論桑枝多糖對糖尿病小鼠腎臟損害有一定的保護作用，機制可能與其通過增加腎皮質中SIRT1、FOXO1的蛋白表達，增強組織的抗氧化能力有關。

桑枝多糖；糖尿病腎病；腎皮質；氧化應激；活性氧自由基；小鼠

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最常見的并發癥之一，是導致終末期腎功能衰竭(end-stage renal disease，ESRD)及患者死亡的重要因素之一[1]。DN的發病機制復雜，氧化應激是其發病最關鍵的因素之一。高糖誘導的線粒體呼吸鏈產生過量的活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)是糖尿病及其并發癥發病機制的始動環節[2]。糖尿病在我國的患病率逐年上升，目前臨床對于DN尚無理想的治療措施[3]，大多使用化學合成藥物來治療糖尿病，不僅療效不理想，而且副作用日益彰顯，因此尋找治療DN的新藥有著重要的意義。

經廣西中醫藥研究院鑒定桑枝MoriRamulus是桑科植物桑MorusalbaL．的干燥樹枝，含有豐富的多糖、黃酮、生物堿等活性成分，具有祛風活絡、通利關節、燥濕利水、降血糖、降血脂以及提高機體免疫功能等多種藥效[4-6]。本研究以糖尿病腎病小鼠為模型，探討桑枝多糖對糖尿病腎病小鼠腎皮質氧化應激作用的影響。

1　材料與方法

1.1動物SPF級C57BL/6小鼠，體質量18～22 g，由福建醫科大學實驗動物中心提供。實驗動物生產許可證： SCkx(閩)2011-0002。

1.2藥物桑枝粗粉 1 kg, 加體積分數為0.8的乙醇6 000 mL，回流提取4次，每次2 h，過濾，加2 000 mL雙蒸水，80℃煮2 h，過濾，煮3次，合并濾液，10 000 r·min-1離心10 min，用微波真空干燥器濃縮，得濃縮液250 mL，經氯仿-正丁醇 (5 ∶1)多次萃取后除去蛋白質。提取液4℃靜置過夜，10 000 r·min-1離心10 min，過濾，加入5倍量體積分數為0.95的乙醇，使乙醇終濃度為體積分數為0.7，醇沉24 h，抽濾，收集沉淀物，依次用乙醚、無水乙醇、丙酮將沉淀物洗滌3次，所得即為桑枝粗多糖。將多糖粗品溶于水，加樣到經PBS緩沖液(pH=7.8)處理的樹脂層析柱中，靜置12 h，用雙蒸水以流速2 mL·min-1進行洗脫，合并洗脫液，真空干燥得桑枝多糖。經紫外-可見分光計測定樣品中的桑枝多糖純度達85.6%。

1.3試劑與儀器鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ,美國Sigma公司，批號SO 150～100 mg)；考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20151107)、錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20151107)；氧化氫酶(CAT)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20151103)；丙二醛(MDA)測試盒(南京建成生物工程研究所，批號 20151118)；線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅲ試劑盒(上海杰美基因醫藥科技有限公司，批號 20151209)；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(上海西唐生物科技有限公司，批號WB1408)；多克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology，批號SC-1537)； SIRT1、FOXO1、NF-κB蛋白抗體(武漢博士德公司，批號3683107)；HRP 標記的兔抗羊IgG抗體(Santa Cruz Biotechnology，批號CV20150909)；預染蛋白Marker(西安潤德生物技術有限公司，批號QE15034)。UVmini-1240紫外可見分光光度計(島津國際貿易上海有限公司)；全自動生化分析儀(日立公司，7100)；Gel doc 2000低溫高速離心機(德國西門子公司)；垂直電泳儀(BIO-RAD公司)；轉膜及顯影設備(BIO-RAD公司)。

1.4方法

1.4.1糖尿病模型建立及分組給藥[7]小鼠造模前12 h禁食不禁水，尾靜脈注射STZ(120 mg·kg-1)。72 h后尾巴取血測空腹FBG值，選取FBG≥16.7 mol·L-1為糖尿病造模成功小鼠。并隨機分為：模型對照組，纈沙坦組(20 mg·kg-1)，桑枝多糖(1.2、0.6、0.3 g·kg-1)組，每組20只。另設空白對照組小鼠20只。灌胃給藥90 d。空白組和模型組給予等量生理鹽水。

1.4.2觀測指標及方法于給藥d 45，各組小鼠給藥后將小鼠置于代謝籠中收集24 h尿液，檢查尿量及尿蛋白含量。d 90末次給藥前，禁食不禁水12 h，給藥后1 h拔眼球取血，以3 500 r·min-1離心10 min，取血清待測。采用全自動生化分析儀檢測小鼠24 h尿蛋白、血清中Cr、BUN的含量；切取部分腎皮質，10%甲醛固定，石蠟包埋切片，蘇木精伊紅(HE) 染色進行病理學觀察。另切除腎皮質，勻漿后測定Mn-SOD、CAT、線粒體呼吸鏈復合物I(complex Ⅰ)、線粒體呼吸鏈復合物Ⅲ(complex Ⅲ)的活性和MDA的含量。ELISA法檢測腎皮質ROS的含量；蛋白免疫印跡法檢測腎皮質中SIRT1、FOXO1、NF-κB的蛋白表達。

2　結果

2.1桑枝多糖對糖尿病腎病小鼠尿量、尿蛋白的影響與空白組相比，模型組尿量、24 h尿微量白蛋白水平明顯升高(P<0.05)。纈沙坦、桑枝多糖各給藥組較模型組小鼠24 h尿微量蛋白以及尿量的水平均有所降低(P<0.05)。見Tab 1。

GroupDose/g·kg-124hurine/mLUrineprotein/mg·24h-1Normal-0.71±0.05*1.89±0.33*Model-3.04±0.329.15±1.09Valsartar0.021.82±0.23*3.61±0.54*RMP0.302.71±0.48*7.83±1.73*0.602.57±0.35*6.16±0.84*1.202.09±0.38*4.08±0.79*

*P<0.05vsmodel

2.2桑枝多糖對糖尿病腎病小鼠血清生化指標的影響模型組較正常組小鼠血清中BUN、Cr的含量明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，纈沙坦及桑枝多糖給藥組血清中的BUN、Cr含量明顯下降(P<0.05)。見Tab 2。

Tab 2　Effect of RMP on serum biochemical indices in DN ±s,n=20)

*P<0.05vsmodel

2.3小鼠腎臟組織形態學觀察HE染色結果顯示，正常組小鼠包曼氏囊腔輪廓清晰、飽滿，未見增生、皺縮、炎癥浸潤等現象出現。模型組小鼠包曼氏囊腔呈皺縮、彌漫性腎小球硬化變化，有炎癥浸潤發生。纈沙坦以及桑枝多糖給藥組腎小球病變情況有所改善，腎小球形態有所恢復。見Fig 1。

Fig 1　Histological observation of kidney tissues in DN mice

A: Normal control group; B: Model group; C: Valsartan group(0.02 g·kg-1); D: 1.2 g·kg-1RMP group; E: 0.6 g·kg-1RMP group; F: 0.3 g·kg-1RMP group

2.4桑枝多糖對糖尿病腎病小鼠Mn-SOD、CAT、MDA的影響Tab 3結果顯示，模型組小鼠較正常組腎組織中Mn-SOD、CAT的活性明顯下降(P<0.05)。與模型組比較，桑枝多糖高劑量組明顯升高小鼠腎臟中Mn-SOD、CAT的活性，降低MDA含量(P<0.05)。

2.5桑枝多糖對糖尿病小鼠腎皮質complex Ⅰ、Ⅲ活性以及ROS含量的影響與空白組比較，模型組大鼠血清中線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅲ的活性明顯下降，ROS含量明顯增加(P<0.05)。與模型組比較，桑枝多糖中、高劑量組明顯升高大鼠血清中線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅲ的活性，ROS的含量明顯降低(P<0.05)。見Tab 4。

Tab 3Effects of RMP on activities of

GroupDose/g·kg-1Mn-SOD/U·μg-1ProMDA/μmol·g-1CAT/U·μg-1ProNormal-53.24±1.74*6.55±1.01*14.72±1.26*Model-17.62±1.8318.34±3.768.66±1.83Valsartan0.0238.53±1.65*8.78±2.53*12.48±2.69*RMP0.3023.92±2.3914.36±3.258.93±1.570.6042.79±2.58*9.48±1.94*9.34±1.831.2048.37±3.41*7.27±1.39*11.87±2.08*

*P<0.05vsmodel

Tab 4　Effects of RMP on mitochondrial respiratory chain ROS, complexⅠ,Ⅲ activity of renal cortex in DN ±s,n=20)

*P<0.05vsmodel

2.6桑枝多糖對糖尿病腎病小鼠腎皮質中SITR1、FOXO1、NF-κB表達的影響與正常組比較，模型組糖尿病小鼠腎皮質中SITR1、FOXO1蛋白表達明顯下降，NF-κB蛋白表達明顯增加(P<0.05)。與模型組相比，桑枝多糖中、高劑量組可下調小鼠腎皮質中NF-κB的蛋白表達，增加SITR1、FOXO1的蛋白表達(P<0.05)。見Fig 2、Tab 5。

Fig 2　Effects of RMP on SITR1, FOXO1 and NF-κB expressions of renal cortex in DN mice

A:Normal control group; B:Model group; C: Valsartan group;D: 0.3 g·kg-1RMP group; E: 0.6 g·kg-1RMP group; F: 1.2 g·kg-1RMP group

3　討論

DN是糖尿病最常發生的并發癥，也是導致糖尿病患者終末期腎功能衰竭、死亡的重要原因之一，其主要的病理特征為腎小球的基底膜增厚，高滲濾等腎小球病變情況[8]。由于DN的發病機制復雜，目前對其發病機制的了解有限，臨床上仍缺乏有效控制DN進展的藥物。桑枝為桑科植物桑的樹枝，含有豐富的多糖、黃酮、生物堿等活性成分，其主要成分桑枝多糖對糖尿病小鼠具有良好的調節血糖作用及改善糖尿病腎病腎組織的病變[9]。

Tab 5Effects of RMP on SITR1, FOXO1 and

GroupDose/g·kg-1SITR1FOXO1NF-κBNormal-0.91±0.22*0.77±0.14*0.13±0.03*Model-0.32±0.080.16±0.030.63±0.06Valsartan0.020.39±0.120.28±0.07*0.36±0.05*RMP0.300.44±0.09*0.38±0.06*0.57±0.120.600.62±0.11*0.53±0.09*0.42±0.08*1.200.78±0.13*0.61±0.07*0.33±0.06*

*P<0.05vsmodel

SIRT1是一種煙酰腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenosine dinucleotide，NAD+)依賴的組蛋白去乙酰化酶，可以催化依賴NAD+的去乙酰化反應，活化其下游的FOXO、PGC-1α、Ku70、p53等多種轉錄因子，調控糖脂代謝、氧化應激及線粒體功能等[10]。FOXO1是叉頭框(forkhead box，Fox)蛋白家族中最早被發現的一員，是INS/IGF-1信號通路中的關鍵分子。FOXO1活性受可逆的磷酸化和乙酰化調節，穿梭于細胞核-細胞質內，隨之發生轉錄活性的改變，從而調節細胞增殖、分化、凋亡及氧化反應[11]。

SIRT1、FOXO1與DN的發生發展密切相關。SIRT1表達上調，減少糖尿病小鼠NADH，下調血管緊張素轉換酶2及腎臟甘油三酯脂肪酶表達，腎皮質線粒體ROS明顯減少，改善腎小球系膜擴張，減輕腎臟炎癥和纖維化，促進腎功能恢復[12-13]。通過去乙酰化活化SIRT1下游因子FOXO1，可增加MnSOD、CAT表達，降低炎癥因子NF-κB的表達，緩解受損腎組織的炎癥反應，減少線粒體損傷，延緩DN腎間質纖維化進程[14]。

腎臟內氧化應激是造成DN足細胞損傷的觸發因素之一。機體的糖脂代謝紊亂導致線粒體呼吸鏈復合物受損，產生過量ROS，損傷周圍正常組織蛋白、脂質、核酸，激活一系列信號分子如p38、NF-κB等，導致細胞及組織損傷[15]。Mn-SOD、MDA和CAT 3者可反映出機體的氧化應激狀態，機體內ROS降解主要依賴于細胞內多種酶的還原作用，如Mn-SOD、CAT等，而這些酶均是FOXO1的靶基因[16]。Piwkowska等[17]研究發現，高糖培養的小鼠足細胞氧化應激反應增強，FOXO1表達減少，其抗氧化靶基因Mn-SOD、CAT表達下調，ROS產生增加。以限制熱量的方式上調DN大鼠SIRT1表達，FOXO1表達也會提高，同時腎皮質MDA減少、SOD活性提高，ROS含量降低[18]。

實驗結果表明，桑枝多糖能有效改善糖尿病腎病小鼠腎的功能，緩解受損腎組織的病變，同時可降低MDA、ROS的含量及提高Mn-SOD、CAT 、complex Ⅰ、complex Ⅲ的活性，上調SIRT1和FOXO1蛋白的表達，降低炎癥因子NF-κB的表達。提示，桑枝多糖可通過調節腎皮質SIRT1的蛋白表白，激活其下游因子FOXO1，從而增強腎皮質中Mn-SOD、CAT的活性以及下調MDA的含量，提高機體抗氧化能力，對因糖脂代謝紊亂所產生過量ROS進行降解，機體受到ROS的攻擊損傷減少，線粒體的呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅲ的活性提高，從而緩解糖尿病腎病的病情。

(致謝：本實驗研究在福建醫科大學藥學院和學校科學實驗中心進行，在此感謝對本實驗研究付出艱辛和努力的實驗人員。)

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The anti-oxidative effect ofRamulusmori

polysaccharides on diabetic nephropathy mice

GUO Fu-tuan, XU Xiong-wei, PAN Jian-feng, LIN Pei-li, ZHENG Ni

(DeptofPharmacy,theFirstAffiliatedHospitalofFujianMedicalUniversity,Fuzhou350000,China)

AimTo investigate the influence ofRamulusmoripolysaccharides(RMP) on blood glucose and anti-oxidative effect in streptozotocin(STZ)-induced diabetic mice.MethodsDiabetic mice were induced by intraperitoneal injection with 120 mg·kg-1STZ and were randomly divided into the following 5 groups with 20 animals per group: model group, valsartan group(20 mg·kg-1), low-, medium-, high-dose(0.3,0.6,1.2 g·kg-1) of RMP groups. Other 20 normal mice were treated as normal control group. The mice were administered orally for 90 d. On 45 d of administration, the 24 h urine was collected through metabolic cages for urine protein detection. Pathological changes of kidney tissues were observed through HE staining. The serum levels of urea nitrogen(BUN) and creatinine(Cr) were detected by automatic biochemical analyzer; and the manganese superoxide dismutase(Mn-SOD), catalase(CAT), malonaldehyde(MDA) and mitochondrial respiratory chain complex Ⅰ,Ⅲ activity of kidney tissues were also determined. ELISA method was used to detect ROS content in renal cortex. The SIRT1, FOXO1 and NF-κB protein expressions were analyzed by Western blot.ResultsCompared with model group, the FBG, microalbuminuria, BUN and Cr were decreased by RMP medication(P<0.05). The activities of Mn-SOD, CAT and mitochondrial respiratory chain complex Ⅰ,Ⅲ in RMP groups were enhanced, while MDA and ROS levels were reduced. Moreover, the expressions of SIRT1 and FOXO1 were up-regulated by RMP, the expression of NF-κB was down-regulated (P<0.05).ConclusionRMP exerts renal protective effect through up-regulating the expressions of SIRT1 and FOXO1 in renal cortex, which may relate to the improvement of anti-oxidative capability.

Ramulusmoripolysaccharides; diabetic nephropathy; renal cortex; oxidative stress; reactive oxygen species; mice

2016-04-03，

2016-04-23

國家自然科學基金資助項目(No 81500633)；福建省衛生系統中青年骨干人才培養重點項目(No 2013-ZQN-ZD-21)

郭福團(1984-)，男，學士，主管藥師，研究方向：抗糖尿病藥物, E-mail:guofutuan@163.com;

鄭妮(1984-)，女，博士，研究方向：抗糖尿病藥物，通訊作者,E-mail：1125526381@qq.com

A

1001-1978(2016)08-1148-05

R-332；R284.1；R322.61；R349.1；R587.2；R692.390.22

網絡出版時間：2016-7-19 10:43網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160719.1043.046.html