補腎健脾中藥復方對成骨細胞中ASK1、ERO1、Caspase-12調節作用*

陳水昌 李 穎（廣東省中西醫結合醫院沙頭分院骨科佛山528208）

補腎健脾中藥復方對成骨細胞中ASK1、ERO1、Caspase-12調節作用*

陳水昌 李 穎
（廣東省中西醫結合醫院沙頭分院骨科佛山528208）

目的：探討補腎健脾中藥復方對成骨細胞中ASK1、ERO1、Caspase-12調節作用機制。方法：將新西蘭大白兔9只隨機分為中藥組、西藥組、空白組，每組3只。三組分別用中藥提取液、雌二醇混懸液按中藥劑量和同體積（約10 ml）蒸餾水灌胃，1個月后抽取含藥血漿。選用1 d齡SD大鼠獲取原代的成骨細胞體外培養，分為中藥組、西藥組、凋亡空白組、正常空白組。中藥組、西藥組分別給予對應的含藥血漿培養；凋亡空白組和正常空白組均給予常規血清培養。24 h后檢測ASK1、ERO1和Caspase-12含量。結果：在ASK1方面，中藥組、西藥組與凋亡空白組相比，差異有統計學意義（P＜0.05）；且西藥組比中藥組更能顯著降低ASK1 mRNA的表達，其差異有統計學意義（P＜0.05）。在ERO1方面，中藥組、西藥組與凋亡空白組相比，差異有統計學意義（P＜0.05），且西藥組比中藥組更能顯著降低ERO1蛋白的表達，其差異有統計學意義（P＜0.05）。在Caspase-12方面，中藥組、西藥組與凋亡空白組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。結論：補腎健脾中藥復方通過ASK1、ERO1所介導的方式對成骨細胞的凋亡進行調控。

成骨細胞；中藥復方；ASK1；ERO1；Caspase-12

細胞衰老的過程是內質網應激反應（Endoplasmic Reticulum Stress，ERS）持續的過程。內質網通過激活非折疊蛋白反應以保護由應激所引起的細胞損傷，減輕內質網負擔，恢復細胞功能，但如果應激刺激過于強烈、持久，內環境紊亂無法糾正，則相應凋亡機制被激活并誘導細胞發生凋亡［1］。本項目通過補腎健脾中藥復方對體外培養的成骨細胞內非折疊蛋白反應介導的細胞凋亡方式進行初步的研究，探討補腎健脾中藥復方調控成骨細胞凋亡的作用機制。

1實驗方法

1.1實驗動物培養細胞用1 d齡SPF級健康雌性SD大鼠20只；制備藥物血清用新西蘭大白兔9只，體重2.0～2.2 kg。實驗動物由廣州中醫藥大學動物中心提供。

1.2實驗藥物補腎健脾中藥復方由淫羊藿、補骨脂、丹參、黃芪等10味中藥組成，該方所含生藥量為1.43 kg/L，由廣州中醫藥大學附屬骨傷科醫院制劑室提供。戊酸雌二醇片，由拜耳醫藥保健有限公司廣州分公司提供（國藥準字J20080036，批號：177A12）。

1.3含藥血漿的制備新西蘭大白兔9只，隨機分為中藥組、西藥組、空白組，每組3只。三組大白免連續灌胃1周，最后一次灌胃后2 h，分別行心臟采血，將獲得的全血置于含抗凝劑的試管中，5～10 min后，于3 000 r/min離心15 min，吸取上清，即獲取含

1.4成骨細胞的培養1 d齡SD大鼠，75％酒精浸泡15 min，取出頭蓋骨，剔凈附著軟組織，0.25％胰蛋白酶預消化，0.1％Ⅱ型膠原酶消化，離心，獲取細胞，PBS液沖洗，置含10％NCS-MEM培養液中，37℃、5％CO2中靜置培養，每2天更換培養液1次，棄去原培養液，加入含10％的胎牛血清MEM進行培養，培養4～7 d，單層細胞鋪滿培養瓶底。傳代時，棄去原培養液，用D-Hank's液沖洗，0.25％胰蛋白酶消化，棄去消化液，加入培養液，吹打培養瓶底，使細胞脫落，制成細胞懸液，接種于新的培養瓶，置37℃、5％CO2中靜置培養。

1.5誘導細胞凋亡采用紫外線誘導細胞凋亡的方法。采用紫外線照射成骨細胞10 min，照射過程中以0.5 ml D-Hank's液濕潤皿底，以保持皿底不干，照射后中藥組和西藥組分別給予對應的含藥血漿培養；凋亡空白組和正常空白組均給予常規血清培養。24 h后，收集成骨細胞做下一步實驗。正常空白組不用紫外線照射。

1.6指標檢測采用酶聯免疫吸附測定法（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）檢測Caspase-12的含量，采用熒光定量PCR（Realtime Fluorescence Quantitative PCR，RTFQ PCR）檢測ASK1的含量，采用光密度（OD值）的方法檢測ERO1的含量。

1.7統計學方法采用SPSS16.0軟件包進行分析，計量資料用（±s）表示，先進行正態性分析，符合要求后各組間差異分別采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有顯著意義。

2實驗結果

2.1成骨細胞凋亡率與細胞周期變化與正常空白組相比，中藥組、西藥組、凋亡空白組G0/G1、G2/M期細胞增多，S期細胞明顯減少。中藥組、西藥組、凋亡空白組細胞凋亡率較正常空白組顯著增高（P＜0.05），其中凋亡空白組凋亡率最高，與其他三組差異明顯（P＜0.05），有統計學意義。西藥組凋亡率略低于中藥組（P＞0.05）。見表1。

表1　紫外線對成骨細胞凋亡與細胞周期的影響（±s）

表1　紫外線對成骨細胞凋亡與細胞周期的影響（±s）

組別G0/G1SG2/M凋亡率（％）中藥組西藥組凋亡空白組正常空白組45.596±2.328 45.792±2.251 44.181±1.959 39.335±1.789 43.528±2.981 41.069±2.731 46.835±1.396 53.987±2.970 10.880±1.27 13.14±1.427 8.986±1.775 6.673±1.383 8.284±0.541 7.745±0.962 10.15±0.838 3.728±0.830

2.2蛋白表達的變化在Caspase-12方面，中藥組、西藥組與凋亡空白組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。在ERO1方面，中藥組、西藥組與凋亡空白組相比，差異有統計學意義（P＜0.05），且西藥組比中藥組更能顯著降低ERO1蛋白的表達，其差異有統計學意義（P＜0.05）。在ASK1 mRNA方面，中藥組、西藥組與凋亡空白組相比，差異有統計學意義（P＜0.05），且西藥組比中藥組更能顯著降低ERO1蛋白的表達，其差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2　各組ASK1 mRNA、ERO1、Caspase-12表達情況（±s）

表2　各組ASK1 mRNA、ERO1、Caspase-12表達情況（±s）

注：與凋亡空白組比較，*P＜0.05；與中藥組比較，#P＜0.05。

組別Caspase-12（pmol/L）ERO1ASK1 mRNA中藥組西藥組凋亡空白組正常空白組11.987±4.133 12.192±3.168 12.118±3.211 10.481±2.871 1.216±0.234*0.983±0.110*#1.351±0.191 0.640±0.102 3.14±0.24*2.21±0.33*#4.56±0.61 1.45±0.86

3討論

骨質疏松癥是一種衰老的疾病。衰老是在正常狀況下生物發育成熟后，隨年齡增加，自身機能減退，內環境穩定與應激能力下降，結構、組分漸進退變。衰老過程在整體、組織、細胞和分子水平皆有所體現，隨年齡增加，器官、組織的實質細胞數、反應敏感性及功能均逐步下降。Naidoo等［2］的實驗證實當衰老發生時，內質網應激的保護效應減退，損害效應增強。而內質網應激能加速衰老，因為內質網應激能導致細胞功能下降和凋亡。錯誤和未折疊蛋白的積累激活內質網應激反應，過度應激導致凋亡，適度的反應最終減輕損害，保護細胞，但卻是以細胞功能的丟失為代價。目前研究表明，非折疊蛋白反應介導的細胞凋亡有三條主要的途徑：（1）CHOP/GADD153途徑：CHOP/GADD153（GrowthArrestand DNA-damage-inducible Gene 153）是內質網應激特異的一個轉錄因子，屬于C/EBP轉錄因子家族成員。在細胞處于應激狀態下，CHOP的表達量大大增加并聚集在細胞核內。CHOP能激活GADD34、ERO1和死亡受體DR5等凋亡反應蛋白過量表達的CHOP能促進細胞凋亡［3］。（2）Caspases-12途徑：Caspases-12定位于內質網外膜，是介導內質網應激凋亡的關鍵分子。內質網應激引起Caspase-12激活，激活的Caspase-12切割并激活Caspase-9，啟動Caspase級聯反應，激活各種下游Caspase，誘導凋亡［4］。（3）ASK1/JNK途徑：ASK1是細胞絲裂原活化蛋白激酶中的一種。活化的ASK1又依次激活MKK4/MKK7-JNK和MKK3/MKK6-p38激酶途徑，對應激做出應答或促使細胞凋亡［5］。

內質網氧化還原酶-1（Endoplasmic Reticulum Oxidoreductin 1，ERO1）主要參與維持ER內氧化狀態，是調控內質網腔中蛋白合成、折疊的關鍵基因。ERO1參與氧化二硫鍵異構酶，維持蛋白折疊過程能夠持續進行。ERO1在形成二硫鍵的過程中可產生H2O2，因此Ozgur等［6］認為ERO1激活是細胞內活性氧簇（Reactive Oxygen Species，ROS）產生的重要來源之一。過多的ROS產生，超過細胞抗氧化防御能力就會影響細胞內氧化還原穩態，引起氧化應激和ERS等過程。目前有研究發現，ERO1同源異構體ERO1 a限制胰島素原突變體誘導的ERS，且ERO1 a蛋白可能參與高血壓誘導的血管內皮細胞損傷，并可以作為ERS導致細胞凋亡通路的重要標志蛋白。

凋亡信號調節激酶1（Apoptosis Signal-regulating Kinase 1，ASK1）是細胞絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase Kinase，MAP3Ks）家族成員之一。在疾病發生發展的過程中，由于致病因子的持續刺激，使ASK1處在持久異常活化的狀態，導致組織細胞損傷。多種內源性和外源性刺激均可激活ASK1，異常活化的ASK1參與了多種疾病的病理過程。眾多學者認為心臟由代償性心肌肥厚發展為心力衰竭的過程中，心肌細胞凋亡起著重要作用。慢性心力衰竭時，ASK1參與凋亡信號傳導，導致心肌細胞凋亡

［7～8］。

Caspase是一類一、二級結構相似的半胱氨酸蛋白酶，是細胞凋亡過程中一組關鍵的蛋白酶，是哺乳動物細胞凋亡的啟動和執行者［9］。內質網應激介導細胞凋亡調節的一個主要因素是Caspase-12，通過激活的Caspase-12切割并激活Caspase-9酶原，這一過程需與另外內質網應激分子協同作用，活化后的Caspase-9通過對Caspase-3酶原等Caspase效應分子的活化，切割多ADP聚合酶（PARP）和多種其它細胞內的底物，最終導致細胞凋亡［10］。

中醫學認為骨質疏松癥屬“骨痿”，根據腎主骨的理論，其病因病機，當首責于各種原因導致腎（氣、陰、陽）的不足，影響骨髓和血之化源，精不生髓，骨失髓血充養，易發生骨骼脆弱無力之證。補腎健脾中藥復方經過臨床及科研實踐［11～13］具有補腎壯骨、健脾益氣、活血化瘀之功效，方中以補骨脂補腎助陽壯骨為君藥；肉蓯蓉、淫羊藿、菟絲子加強補腎陽之功為臣藥；佐以黃芪補中益氣，丹參、當歸活血化瘀，熟地、白芍滋陰益精。在本研究中，中藥組和西藥組相比，兩者均可以降低ASK1 mRNA、ERO1蛋白的含量，與凋亡空白組相比差異有統計學意義（P＜0.05）。但在Caspase-12方面，兩組與凋亡組比較，差異無統計學意義。因此，我們可以認為，補腎健脾中藥復方可能是通過CHOP/GADD153途徑和ASK1/JNK途徑對成骨細胞的凋亡進行調控，這對于中藥復方治療骨質疏松癥具有重要的意義。

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Effects of Chinese Medicine for Bushenjianpi on ASK1，ERO1 and Caspase-12 in Osteoblasts

CHEN Shui-chang，LI Ying
（The Department of Orthopedics，the Shatou Branch Hospital of Guangdong Province Traditional Chinese and Western Medicine，Foshan528208）

Objective：To explore the effects of chinese medicine for Bushenjianpi on ASK1，ERO1 and Caspase-12 in osteoblasts. Methods：9 New Zealand rabbits were randomly divided into the chinese medicine group（n=3），the western medicine group（n=3）and the control group（n=3）.The chinese medicine group was given the intragastric administration with chinese herbal compound.The western medicine group was given the alendronate sodium，the control group was given distilled water.After treament for 1 month，the plasma was separated from blood.1 Day old SD rats were used to culture osteoblasts，which were divided into the chinese medicine group，the western medicine group，the apoptosis group and the control group.The chinese medicine group and the western medicine group were given the corresponding plasma，other group were given serum culture.After 24 h，GADD34、ERO1、IRE-1 were examined.Results：Compared with the apoptosis group，the chinese medicine group and the western medicine group could decrease the expression level of ASK1 and ERO1 in serum obviously（P＜0.05）.Compared with the chinese medicine group in ASK1 and ERO1，the western medicine group could decrease the expression level obviously（P＜0.05）.But compared with the apoptosis group，there was no statistical significance in Caspase-12. Conclusion：Chinese medicine for Bushenjianpi is regulated by ASK1 and ERO1 in the way of apoptosis.

Osteoblasts；Chinese herbal compound；ASK1；ERO1；Caspase-12

R285.5

Bdoi：10.13638/j.issn.1671-4040.2016.04.042

廣東省科技計劃項目（編號：2013B021800162）；廣東省佛山市醫學類科技攻關項目（編號：201308180）藥血漿，再滅活，抽濾除菌，置-20℃保存備用。

（2016-03-18）